高解像度超音波は、妊娠、妊娠年齢、妊娠喪失の状態を決定することによって、時限妊娠マウスを必要とする実験を合理化するのに役立ちます。ここで提示されるは、マウスの妊娠だけでなく、妊娠を模倣する可能性のある潜在的な落とし穴(画像アーティファクト)を評価する方法を説明するためのプロトコルです。
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この記事について
サマリー
要約
マウスは、多くのヒト疾患および生物学的プロセスに適した哺乳類動物モデルである。発生生物学では、多くの場合、様々な時点で進化するプロセスを決定するために、段階的な妊娠マウスが必要です。さらに、モデルマウスの最適かつ効率的な繁殖には、時効妊娠の評価が必要です。最も一般的には、マウスは一晩で交配され、膣プラグの存在が決定される。しかし、この技術の正の予測値は最適ではなく、マウスが本当に妊娠しているかどうかを知るのを待つ必要があります。高解像度超音波バイオ顕微鏡は、イメージングのための効果的かつ効率的なツールです: 1) マウスが妊娠しているかどうか;2)マウスが到達した妊娠段階。3)子宮内損失があるかどうか。胚および胎児に加えて、研究者はまた、これらを重力子宮と間違えないように、腹腔内の一般的な人工物を認識しなければならない。この記事では、例示の例と共に、イメージング用のプロトコルを提供します。
概要
マウスは、多くのヒト疾患および生物学的プロセス1、2、3、4に好ましい哺乳類モデルである。発生生物学の研究では、多くの場合、様々な時点点5、6、7、8で進化するプロセスを決定するために、段階的妊娠マウスが必要です。さらに、モデルマウスの最適かつ効果的な繁殖は、特に研究者が遺伝子変異が発症に及ぼす影響を研究している場合に、時限妊娠の評価を必要とする。典型的には、研究者は一晩ヘテロ接合マウスを交尾し、翌朝早く膣プラグを探し、妊娠が9を続けることを望む。子宮内損失の決定は、通常、遺伝子型のメンデリア比の新生児ごみをチェックし、様々な妊娠段階で妊娠中のマウスを犠牲にして後方に働き、胚を回復させることから始まります。研究者は、体重増加を陽性妊娠10、11の指標として決定することができる。しかし、特に遺伝子操作されたマウスでは、体重増加が明らかにならない可能性があるために子宮内損失がある場合(特に妊娠初期の~E6.5~8.5)に、ごみは非常に小さく、その後再起する可能性があります。マウスは、例えば良性腹部腫瘍のために誤って妊娠しているように見えることがある。本質的に、人は「盲目」を働く。
高解像度超音波バイオ顕微鏡は、グラビッド子宮の直接可視化を可能にし、マウス胚を開発12、13、14、15、16。我々は、最初に胚マウス心血管生理学16、17を評価する方法を開発したが、我々は我々のマウスの繁殖を合理化するために、このイメージングモダリティの有用性を認識した。具体的には、明らかな体重増加またはごみの送達に基づいて、マウスが妊娠しているかどうかを「見る」のを待つ必要がなくなりました。ダムが妊娠していない場合、私たちはグラビッド状態を決定し、すぐにマウスを再嵌合することができました。さらに、子宮内損失を容易に画像化することができ、マウスを犠牲にすることなく損失のタイムラインを決定することができます(図1を参照)。時間、貴重なモデルマウス、資金を節約することができます。
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プロトコル
このプロトコルのすべての手順は、国立衛生研究所が発行し、ニューヨーク大学グロスマン医学部の施設動物ケアと使用委員会によって承認された実験動物のケアと使用のためのガイドに従います。
1. 時を取った妊娠のためのマウスの交配
- ケージ内の適切なメスマウス(通常はヘテロジゴテ)と適切な雄マウス(通常はヘテロジゴテ)を一晩の交配に対してペアリングする。
- 翌朝マウスを分離します。あるいは、メスマウスと雄マウスを継続的に交尾させ、妊娠の可能性を高める。
注:しかし、正確にタイミングの高い妊娠は代替手段では保証できず、特に疾患プロセスが子宮内成長遅滞をもたらす場合には、超音波によるマウス胚のステージングは明らかではない。遺伝子変異体を運ぶ胚が小さいと仮定される場合は、より大きな野生型のリッターメイトを探して妊娠年齢を測定します。- オプション: 膣プラグを探します。膣プラグがない場合、メスのマウスは嵌合されていません。膣プラグがある場合、女性のマウスが妊娠していない可能性が依然として高い。
- E0.5として一晩の交配の翌日の時間。
- E6.5~E.8.5でイメージングを行い、妊娠を確認し、マウスが妊娠していない場合はマウスを再嵌合します(ステップ1.1を参照)。
注:この段階では、メスのダムは明らかに目に妊娠していません。したがって、超音波画像は早期の決定および再交配を可能にする。
2. 麻酔とマウスの準備
- 妊娠中のマウスを麻酔の誘導室に置きます。
- イオブルランと室内空気または医療用酸素を混合し、1 L/min流量で2%~3%の濃度で、誘導室での妊娠中のマウスの沈薬を誘発します。
注: 通常、セドレーションは 1 ~ 2 分以内に発生します。マウスはじっと横たわり、呼吸が遅くなったでしょう。 - マウスを素早くイメージングプラットフォームに移します。イメージングプラットフォームには通常発熱体も含まれており、マウスを暖かく保つのに役立ちます。
- マウスの鼻を麻酔のノセクネに入れる。
- イオブルラン/酸素混合物をイメージングプラットフォームの無セセコーンに素早く再ルーティングします。1 L/min流量で2%~3%のイオブルランを維持します。
- 足のピンチ、角膜反射、呼吸のレベル、および任意の動きによる沈下のレベルを決定します。
注:角膜反射は、マウスが麻酔されている間(マウスが彼女の目を閉じない)、乾燥しないように目に保湿軟膏を適用することによって、最初に決定することができます。 - マウスが仰向けに横たわっている(背中に)、足をイメージングプラットフォームの心電図パッド(EKG)パッドにテープで貼ります。
注: ただし、この種のイメージングには EKG は必要ありません。 - 次のように、妊娠中のダムの腹部から毛皮を取り除きます:
- 腹部の毛皮を70%エタノールで十分に濡らし、外側の端まで含む。プラットフォームに流出があるほど適用しないでください。
注:エタノールは水よりもシェービング潤滑剤としてより良く働きます。 - カミソリの刃を使用して腹部を慎重に剃ります。乳首を切らないように注意してください。
- ガーゼまたはいくつかのワイプで腹部から剃った毛皮を拭きます。
- または、毛皮の大部分を取り除くために毛皮のバリカンを使用した後、脱毛クリームを使用します。
- 腹部の毛皮を70%エタノールで十分に濡らし、外側の端まで含む。プラットフォームに流出があるほど適用しないでください。
3. (推定) 妊娠マウスの腹腔内画像
- 腹部を剃った後、イオブルランを1%~1.5%に減らし、流量は1 L/minに維持します。呼吸のレベルと動きだけでなく、足のピンチおよび/または角膜反射によって沈下のレベルを監視します。
注: 麻酔マウスの心拍数は、通常、コア(直腸)温度に応じて400~500分になります。迅速な妊娠チェックの目的のために、生理学的なコア温度にマウスを温めないでください。心拍数は400-450/分に近くなりますが、マウスが長時間のイメージングで冷たくなった場合、不規則なリズムでさらに低下する可能性があります。- 重要なことに、呼吸が不安定または苦しみではなく、深さと規則性が中程度であることを確認してください(あえぎ:深く、遅く、不安定で、深い肋間および肋間の撤回を伴う)。
注: 換気されていない麻酔用マウスの呼吸数は、通常 60 ~ 100/https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html 分です。
- 重要なことに、呼吸が不安定または苦しみではなく、深さと規則性が中程度であることを確認してください(あえぎ:深く、遅く、不安定で、深い肋間および肋間の撤回を伴う)。
- 腹部に超音波(音響カップリング)ゲルを寛大に塗布する。
- 画像変換器を腹部に置いて水平面に向ける:プローブを配向して、イメージングシステム上の左右の向きを得る。撮像プローブの側面に示された「ドット」またはリッジは右向きにする必要があります。
注:イメージングプローブをマウスの右にスライドさせると、超音波システム上の対応する画像がマウスの右に移動します(マウスの尾から「上」を見ているとします( マウスの右はモニタに残ります)。- 通常、撮像システムのトランスデューサマウントおよびレールマニピュレータシステムを使用します。ここでは、イメージングトランスデューサが手持ち(両手が1つよりも安定)であり、腹部の周りのより迅速な動きを可能にする「自由な手」イメージングが使用されています。これらの動きは、以下に概説されるように、回転運動と移動運動の両方を含む。ただし、これにはさらに多くの練習が必要です。
- 画面上の膀胱を識別します (ビデオ 1)。
- 膀胱からスキャンし、膣を識別する。次に、頭蓋方向にゆっくりとスムーズにスキャンし、膣の分岐を左右の子宮角に識別する(図2;ビデオ 1)。
- 子宮(左および右の子宮角)13(図3;ビデオ 2)。
注:妊娠中期(E10.5またはE11.5)まで、マウス胚は左右の周辺に沿って配置されます。彼らが成長するにつれて、子宮のより遠位の部分とそれに対応する胚は外側に向かって後方に回る。胚がさらに成長するにつれて(E15.5以降、一般的に)、マウス胎児は様々な方向にほぼランダムに配置され、近位から遠位まで子宮を「追跡」することは困難になる。- マウスが妊娠しているかどうかを確認するために、迅速にスキャンします。この迅速な方法は、グラビッド子宮およびマウス胚の認識のみを必要とする。
- あるいは、各子宮角の胚(生きて、死んだ、再ソード)を列挙するために余分な時間を取る。
注:一般的に、生きた胚は、心臓、手足、心室を持つ頭、目などの異なる器官を示します。死んだ胚は、死んだ場合を除き、均質な「むしゃくしゃした」外観を取ります。リソーベッド胚は、グラビドに見える子宮の真ん中にピンポイントのエコー原斑を有する(図4、図5、図6、図7、図8)。 - 胚が本当に生きているかどうかを判断するには、心拍や血流を探します。
注:カラードップラーフローマッピングは、胚と臍帯の両方で血流の存在を決定する際に役立ちます。一般に、これはE8.5より古い胚に適用され得る。 - グラビド子宮を模倣する可能性のある人工物を認識する (図 9, 図 10)。さらに、腸ガスおよび他の超音波「影」アーチが子宮角のセグメントを隠す可能性があるため、複数の見晴らしの良い場所からイメージングを行い、子宮の十分な視覚化を確実にする。
- 調査が完了したら、ガーゼまたはワイプで腹部からゲルを拭きます。ゲルがマウスを冷やす傾向にあるので、できるだけ取り除くようにしてください。
- 足のテープを外し、麻酔の無セコネからマウスを取り除く。
- マウスをケージにそっと動かします。彼女は目を覚まし、1分かそこらで動き回り始めるべきです。
注:遺伝子組み換えマウスは、麻酔から回復するのに少し時間がかかり、より注意深く監視する必要があります。
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結果
このプロトコルは、研究者がマウスが妊娠しているかどうかを自信を持って判断することを可能にします, 初期段階を含みます, 妊娠ダムを犠牲にすることなく、明らかな出生前胚または胎児の損失があるかどうかを判断します.このプロトコルは、遺伝子操作されたマウスを繁殖させるときに特に有用である。典型的には、ホモ接合子孫を生み出すためにヘテロ接合xヘテロ接合は、出生前致死性を引き起こす適切な発達の失敗につながる。図1は、胚が徐々に死んでから、妊娠中期まで再形成される代表的な状況を示している。図2は、分岐を通して膣を追って左右の子宮角を見つける方法を示しています。図3、図4、図5、図6、図7、ビデオ3、およびビデオ3
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ディスカッション
画像化における最も重要な最初のステップは、膣を識別し、次に左右に子宮角の分岐を決定することです。各子宮ホーンに従うことによって、イメージャーは子宮として腸のループを誤って識別する可能性が低い。さらに、腸の外観の変化を理解することは重要です(便の有無にかかわらず)これらは子宮と区別する必要があります。時折、腸ループの便「ボール」は、グラビッド(妊娠)子宮を模倣する可能性があります。他の著者は、マウス胚発生の妊娠診断とステージングの診断を説明しているが、再ソード胚20の検出を含む19、この研究は、グラビッドマウス子宮をイメージングするステップと潜在的な落とし穴を概説する最初のものである。
画像は、妊娠初期またはグラビド子宮を模倣する可能性のある人工物、または子宮および胚のイメージングを妨げる可能性のある人工物を認識しなければならない。子宮の角に横向きに続...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 脱毛クリーム | |||
| 、エタノール、70% | |||
| ファークリッパー、 | |||
| ガーゼまたはキムワイプ、 | |||
| イソフルラン | |||
| 、医療用酸素(オプション)、 | |||
| 医療用テープ | |||
| マウスイメージングシステム(麻酔セットアップとイメージングプラットフォームを含む) | Fujifilm Visual Sonics | Various | 40 MHz中心周波数超音波トランスデューサープローブを備えた任意のシステム |
| カミソリブレード(安全カミソリではありません) | |||
| スケール(マウスの体重を量る) | |||
| 超音波ジェル |
参考文献
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