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方法論記事

日本梅における花粉の要件を確立する:フェノロジーモニタリング、手受粉、蛍光顕微鏡と分子ジェノタイピング

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DOI:

10.3791/61897

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2020年11月9日

 ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

この記事について

サマリー

蛍光顕微鏡下での蛍光顕微鏡下での花粉管のフィールド・受粉と観察と、PCRによる S-遺伝子型の同定、受粉者の選択のための開花のモニタリングを組み合わせた、日本の梅型ハイブリッドにおける受粉要件の決定方法論が記載されている。

要約

一般的に栽培されている日本の梅の品種は、元のプルヌスサリシナと他のプルヌス種との間の十字架に由来する特異性ハイブリッドです。ほとんどのハイブリッドは、複数の対立遺伝子を含む単一の非常に多形性S-locusによって制御される、ゲーム病の自己非適合性を示す。ほとんどの栽培ハイブリッドは自己互換性がなく、花を受精させるために互換性のあるドナーからの花粉が必要です。日本の梅の受粉要件の確立は、未知の受粉要件を持つ新しい品種の数が多いため、ますます重要になっています。本研究では、梅型ハイブリッド系の受粉要件の決定方法について説明する。自己(in)の適合性は、現場と研究室の両方で手受粉によって決定され、続いて蛍光顕微鏡による花粉管伸びをモニタリングし、フィールドにおける果実成熟をモニタリングします。受粉者品種の選択は、現場での開花時間のモニタリングとPCR分析によるS-遺伝子型の同定を組み合わせることにより評価される。品種の受粉要件を知ることは、新しい果樹園の設計のための品種の選択を容易にし、確立された果樹園の受粉欠損に関連する生産性の問題の早期発見を可能にする。

概要

日本の梅(プルヌスサリチーナリンブル.)は中国1原産です。19世紀には、この作物は日本からアメリカに導入され、そこで他の北米の二分性の梅2と交配した。20世紀には、これらのハイブリッドのいくつかは、世界中の温帯地域に広がりました。今日では、「日本の梅」という用語は、元のP.サリシナと最大15個の他のディプロイド・プルヌス属の間の十字架から導き出される幅広い異特異的ハイブリッドを指します。

日本の梅は、他の種の酒さファミリーと同様に、多方対立遺伝子を含む単一の高多形性S−軌跡によって制御されるGametophytic自己非適合性(GSI)を示す6。S-locusには、ピスティルで発現したリボヌクレアーゼ(S-RNase)をコードする2つの遺伝子と、花粉粒7に発現するFボックスタンパク質(SFB)が含まれている。自己非適合反応では、花粉粒(ハプロイド)で発現したS-アレスレが、ピスティル(ジプロイド)で発現した2つの中の1つと同じである場合、S-RNase8の作用により花粉管RNAの分解によりスタイル全体の花粉管の成長が抑制される。このプロセスは、排卵体中の女性のガテファイトの受精を防ぐため、GSIは、品種間の外交を促進する。

一部の日本の梅の品種は自己互換性がありますが、現在栽培されているほとんどの品種は自己互換性がなく、花を受精させるために互換性のあるドナーからの花粉が必要です。アーモンド9、アプリコット10、11、12、スウィートチェリー13などのプルヌス属の石実種では、品種の受粉要件は、異なるアプローチによって確立することができます。自己(in)互換性は、フィールド内の花の自己受粉とその後のフルーツセットの監視、または実験室での制御された条件での半生体自己受粉および顕微鏡14、15、16、17、18の下での花粉管の観察によって決定することができる.品種間の非適合性関係は、潜在的な受粉者品種の花粉を用いて現場または実験室でのクロス受粉によって決定され、PCR分析による各品種のS-対立アレスの同定14、15、16、19、20、21、22.例えば、甘い桜やアーモンドのような種では、自己(in)相溶性は、アーモンド23のスウィートチェリー13またはSfのS4'として、自己適合性に関連する特定のS対立アレスの同定によっても評価することができる。

主な生産国からのいくつかの梅の繁殖プログラムは、未知の受粉要件を持つ新しい品種2、14、それらの多くをリリースしています。本研究では、梅型ハイブリッド系の受粉要件の決定方法について説明する。自己(in)の適合性は、フィールドと研究室の両方で自己受粉によって決定され、続いて蛍光顕微鏡下での花粉管の観察が行われます。受粉者品種の選択は、現場での開花時間のモニタリングとPCR分析によるS-ジェノタイプの同定を兼ね備えています。

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プロトコル

1. 現場での手受粉

  1. 花粉抽出
    1. 花粉を得るためには、ステージD24で花芽を収集し、BBCHスケール25、26のステージ57に従って。
      注:彼らのアンサーがより少ない花粉を生成するので、他の プルヌス 種よりも日本の梅でより多くの花の芽が必要です。
    2. プラスチックメッシュ(2mm x 2mmの細孔サイズ)を使用してアンサーを取り除き、アンサーが解菌するまで室温で24時間紙に置きます。
    3. 細かいメッシュ(0.26mm x 0.26mmの細孔サイズ)を通して花粉粒をふるいにかけて、使用するまで4°Cのキャップを持つ10mLガラスチューブに保存します。
  2. 魅惑的な花の受粉
    1. 花の10%から20%が開いている場合は、いくつかの枝を選択してラベルを付けます。BBCHスケール25、26のステージ57によると、ステージD24に花芽だけを残して、開いた花や若い芽を削除します。
    2. 爪やピンセットで治療ごとに800〜1,000の花芽の花びら、セパル、およびstamensを取り除きます。
    3. 手は、腫れ後の細かい絵筆24の助けを借りて、ピステイルを受粉する。同じ品種の花粉を含むいくつかの枝、およびコントロールとして他の品種からの互換性のある花粉と残りの半分。他の品種の花粉粒で指先や絵筆を汚染しないように注意してください。
    4. 果物のドロップパターンを特徴付け、各受粉治療に設定された最終的な果物を定量化するために、花と果物の開発の毎週のカウントを記録します。
  3. フィールドにおける補足受粉
    1. 最初の花が開く数日前に、受粉昆虫の到着を避けるために0.8ミリメートルメッシュケージで選択した木を囲みます。
    2. 10%~20%の花が開いている場合は、受粉治療ごとに複数の枝を選択してラベルを付け、1回の治療で1,000~1,500本の花を残します。
    3. 次の日、花が開いているときに、対応する花粉(自己受粉のための同じ品種からの花粉、およびクロス受粉制御として他の互換性のある品種からの花粉)を持つ絵筆の助けを借りて、各花を受粉させる。
    4. すべての花が開くまで、一日おきに受粉します。
    5. 果物のドロップパターンを特徴付け、各受粉治療に設定された最終的な果物を定量化するために収穫するために、花の毎週のカウントを記録し、アンテシスから果物を開発します。

2. 研究室での手受粉

  1. ステージD24で50〜100の花を集め、BBCHスケール25、26のステージ57に従って。
  2. 研究室では、治療(自己およびクロス受粉)あたり30本の花を放出する。
    注:イマチの損傷を避けるために、腫を慎重に行う必要があります。
  3. 湿った花屋の泡(各受粉処理のための泡の1枚)の部分にそれを置く前に、水中の各花のペディセルのベースに新鮮なカットを行います。
  4. 手は、前に収集した花粉を持つ細かい絵筆を使用して、後で各ピスティル24時間後に受粉する(セクション1.1を参照)。同じ品種から花粉で一組のピスチルを受粉し、もう一方は互換性のある品種をコントロールとして花粉でセットします。
  5. 受粉後72時間の受粉を室温で残す。花の泡は水で継続的に濡れている必要があります。
  6. 4°Cで少なくとも24時間エタノール/酢酸(3:1)の固定液中のピスティルを固定します。 固定液を75%エタノールに交換してください。試料は、27を使用するまで4°Cでこの溶液中で保存することができる。
    注: サンプルがソリューションに完全に沈み込まないようにします。

3. 顕微鏡観測

  1. インビトロ花粉の生殖評価
    1. 花粉発芽培地を精巧にするには、250mLの蒸留水に25gのスクロースを溶かし、0.075gの硝酸カルシウム[Ca(NO3)2]とホウ酸0.075g(H3BO3)を加える。
    2. 溶液に2gの寒天を加え、完全に溶解するまで混ぜ合わせます。
    3. 培地を殺菌するには、120°Cで20分間オートクレーブする。培地を冷却し、固化する前に、滅菌層流れフードに3 mLの無菌ペトリ皿(55mm x 12 mm)を分配します。中型固化後、使用するまで4°Cで包んだペトリ皿を保存します。
    4. 2つのペトリ皿の制御された花粉の花粉のドナーとして以前に使用される各品種の花粉を広げ、24時間25°Cでそれらをインキュベートする。
      注:接種された培養培地は、顕微鏡観察で観察した直後に観察するか、使用するまで-20°Cで保存することができます。この目的のために、ペトリ皿は、顕微鏡観察の前に冷凍庫から冷蔵庫24時間に変更する必要があります。
    5. 花粉粒を観察するには、カロキを染色する1%(v/v)アニリンブルー溶液を調製します。まず、7.97gのK3PO4を1,000mLの蒸留水に溶解して、0.1Nリン酸カリウム三塩基(K3PO4)溶液を調製する。1%(v/v)アニリンブルー溶液を精巧にする、0.1 N K3PO4の100 mLにアニリンブルーの1 mLを溶かす。
    6. 各ペトリ皿プレートに2~3滴のアニリンブルー溶液を加え、励起器フィルターBP340-390とバリアフィルターLP425を使用して、紫外線励起顕微鏡の下で5分後に観察します。各品種のための2ペトリ皿に、100〜200個の花粉粒を含む各フィールド、プレートごとに3つのフィールドに実行可能で実行可能でない花粉粒を数えます。
  2. 花粉管の成長
    1. 固定されたピスチルを蒸留水で3回(それぞれ1h、合計3h)、硫酸ナトリウム(Na2SO3)を4°Cで24時間5%(1時間、3h)に移します。この溶液を調製するには、硫酸ナトリウム5gを蒸留水100mLに溶解する。
    2. 5%(w/v)硫酸ナトリウムで8分間120°Cでピスティルをオートクレーブし、組織を軟化させます。
    3. スカッシュは、スライド上のカバーガラスの下に1%(v/v)アニリンブルー溶液の低下でシミルを柔らかくし、カロースを染色します。
    4. エキサイターフィルターBP340-390とバリアフィルターLP425を用いて、紫外線蛍光で顕微鏡下で花粉チューブの成長を観察します。

4. 非互換性関係の判別

  1. 葉からのDNA抽出
    1. DNAを抽出するには、各品種の3〜4個の若い葉を畑に集め、好ましくは春に採取する。
      注:DNAは成熟した葉からも抽出できますが、若い葉からのDNAはフェノール化合物が少ないです。
    2. 市販キットを使用してDNAを分離し、提供されているプロトコルキットに従います( 資料表を参照)。
    3. DNA濃度を定量化し、UV-Visマイクロボリューム分光光度計で260nmの各サンプルのDNAの品質を評価します。DNA濃度を10 ng/μLに調整します。
  2. フラグメント増幅のための PCR 条件
    1. 0.2 mL PCR チューブおよびキャップにラベルを付けます。
    2. 表1に記載のPCR試薬を準備し、氷の上で解凍します。
    3. 反応の数に過剰の10%を加えた1.5 mLマイクロチューブ内のプライマーの各ペアのマスターミックスのボリュームを設定し、1反応あたり16μLの体積を考慮します。 表1 の順番に従って試薬を加え、十分に混ぜます。
    4. アリコート16 μLのマスターミックスは、4 μLのDNAテンプレートまたは4 μLの殺菌蒸留水を陰性対照として含む各0.2 mL PCRチューブに混合します(C-)。既知の遺伝子型を有する品種のDNAを陽性のコントロールとして使用する。軽く混ぜ合わせ、キャップで反応管を閉じ、遠心分離機を2,000 x g で30 sで閉じ、反応管の底部の全容を集めます。
    5. サーモサイクラーに反応チューブを入れ、94°Cで3分、94°Cで1分、56°Cで1分、72°Cで3分、72°C20で7分の最終ステップを使用してPCRプログラムを設定します。
  3. 電気泳動とフラグメントサイズの推定
    1. 1.7%(w/v)アガロースミニゲルを調製するには、アガロースの0.68 gと1x TBEバッファーの40 mLを100 mLのエルレンマイヤーフラスコに溶解します。沸騰を避けるために、600Wのマイクロ波で600 Wで加熱して溶液を溶かします。
    2. 溶液をベンチに置いて冷却し、3.5 μLの核酸染色液を加えます。
    3. ゲルトレイを鋳造スタンドに入れ、選択した櫛をゲルモールドに入れます。PCR製品とDNAラダーごとに十分な井戸を持っていることを確認してください。
    4. アガロース溶液をゲルモールドに注ぎ、重合するまで冷まします。重合ゲルのくしを取り除きます。ゲルの表面を覆うのに十分な1x TBEバッファーを含む水平電気泳動システムにゲルを入れます。
    5. DNA分子量ラダー(1 kb DNAラダー)の2 μLで最初と最後のウェルをロードします。PCRの各製品の3μLを他のウェルにロードします。チャンバーを閉じ、電源を入れ、ゲルを100 Vで30分間動かします。
    6. ゲルドキュメンテーションシステムを使用して、UV光下でゲルを観察します。DNA分子量ラダーを使用して増幅断片のサイズを決定し、対応する対立遺伝子を同定するために正の対照と比較します。

5. 花の日付を監視する

  1. 異なる年にわたって開花で各品種の異なる木のフェノロジーを監視します。開花期間の長さを最初(約5%)から最後の開いた花(約95%)まで設定します。花の少なくとも50%がステージF24にある場合、フルブルームは、BBCHスケール25、26のステージ65によると、考慮されます。
  2. 互換性のある品種の開花日を比較し、毎年開花時期に一致するものを決定するには、数年からのデータで開花時間のカレンダーを精巧に。

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結果

日本の梅の花の芽には、花1~3本の花が咲く花が入っています。他の石の果実種と同様に、各花は4つの花で構成されています:カルペル、雄人、花びら、セパル、花の基部にカップを形成して融合されています。花の構造は、花粉粒の少量を含むstamensに囲まれた短く、壊れやすいピスティルで、他の石の果物よりも小さいです。満開の時、各花序の花が短い茎に分離して現れ、麻酔前の日に緑色のシーパル(ステージD、57 BBCH)に囲まれた風船を形成する白い花びらを示しています。花は、アンテアとピスチル(ステージF、65 BBCH)を示す、アンテシスで完全に開いています(図2A)。他の温帯プルヌスspp.のように、花芽が最初に開き、葉の芽が数日後に芽を出します。これは、咲く木は花の偉大な数を示す壮観に見えるが、葉はありません。

日本の梅の手受粉は、触菌と雄がほぼ成熟している前のバルーンステージ(図1A)で花の集ま...

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ディスカッション

本明細書に記載されている梅品種の受粉要件について述べる方法論では、現場や研究室での制御された受粉による各品種の自己(in)適合性を決定し、その後蛍光顕微鏡による花粉管成長の観察を行う必要がある。非非適合性関係は、分子ジェノタイピングによる S-対立遺伝子の特性化によって確立される。最後に、毎年開花で一致する品種を検出するためにモニタリングフェノロジーによって受粉者の選択が行われる。

新しい日本の梅型品種の受粉要件の確立は、未知の受粉要件を持つ新しい品種の数が多く、それらのほとんどは自己互換性がないことからますます重要になっています3.本明細書に記載されるアプローチは、表現型モニタリング、制御された受粉、蛍光顕微鏡、および分子遺伝子型を組み合わせて、品種14の受粉要件を決定するのに有用であることが証明されている。

日本の梅のハイブリッドは、他の プルナス 種で使用される受粉要件を決定するための単一の...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、インスティトゥート・ナシオナル・デ・インベスティガシオン・イ・テクノロジア・アグラリア・イ・アリメンタリア(RFP2015-00015-00およびRTA2017-00003-00)によって資金提供されました。ゴビエルノ・デ・アラゴン—欧州社会基金、欧州連合(グルポ・コンソリデーションA12-17R)、ユンタ・デ・エストレマドゥーラ—フォンド・ヨーロッパ・デ・デサロロ地域(FEDER)、プラン地域デインベスティガシオン(IB16181)、グルーポ・デ・インベスティガシオン(AGA001、GR18196)。B.I. ゲレーロは、メキシコのコンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(CONACYT、471839)のフェローシップによって支えられていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酢酸 氷河Panreac131008.1611
寒天iNtRON バイオテクノロジー25999
アニリンブルーDifco8504-88
ホウ酸 (H3BO4)Panreac131015.1210
硝酸カルシウム 4-水和物 (Ca(NO3)2&ミッドドット;4H2O)Panreac131231.1211
カバーガラスDeltalabD10246024 mm x 60 mm
デジタルカメライメージング Developmet SystemsUI-1490SE
デジタルカメラソフトウェアスイートイメージング Developmet Systems4.93.0.
DNA オリゴThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM eachThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polymeraseThermoFisher ScientificEP0713
Ethanol 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNAラダー(米国特許番号4.403.036)(500PB-12Kb)Invitrogen15615-016サイズ:250µg;濃度:1.0 & マイクロ;g/µl
ゲルドキュメンテーションシステムBio-Rad1708195
ハンドカウンターTamacoTM-4
Image Lab ソフトウェアBio-Radゲルドキュメンテーションシステム用画像解析システム
MetaPhor AgaroseLonza50180
微量遠心機 5415 REppendorfZ605212
顕微鏡 UV 付きエピフルレッセンスライカDM2500エキサイターフィルター BP340-390、バリアフィルター LP425
マイクロスライドDeltalabD10000426 mm x 76 mm
ミニ電気泳動システムフィッシャーブランド14955170
ミニ遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック15334204
NanoDrop 1000 分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックND1000
ペトリ皿Deltalab20020155 mm x 14 mm
リン酸カリウム三塩基性 (K3PO4·1.5H2O)Panreac141513
プライマーフォワード 'Pru C2'サーモフィッシャーサイエンティフィック
プライマーフォワード Pru T2'サーモフィッシャーサイエンティフィック
プライマーリバース 'PCER'サーモフィッシャーサイ
レッドセーフ 核酸染色溶液iNtRON Biotechnology21141
サッカロース Panreac131621.1211
亜硫酸ナトリウム無水物 (Na2SO3)Panreac131717.1211
Speedtools 植物 DNA 抽出キットBiotools21272
TBE バッファー (10X)PanreacA0972,5000PE
サーマルサイクラー T100Bio-Rad
サーモミキサーコンフォートEppendorfT1317
縦型オートクレーブ Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
エンティフィック 1861096

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