糞便(マイクロ)RNA単離

細胞外RNAは、多くの生物学的プロセスを媒介する重要な因子として認識されつつあります¹。糞便中の細胞外RNAは、2008年に結腸癌および活動性潰瘍性大腸炎のマーカーとして最初に報告され²、最近、腸管腔および糞便の正常な成分として明らかにされ、宿主と微生物のコミュニケーションを媒介します^3,4,5。このRNA分離プロトコルの目的は、動物およびヒトの被験者から収集された糞便サンプルから高品質の細胞外RNAを抽出することです。このプロトコルは、市販のmiRNAアイソレーションキットから採用されました。取得したRNAは、RNAシーケンシング、RT-PCR、マイクロアレイなどのダウンストリーム分析に利用されます。このプロトコルには、動物や人間の糞便に含まれるRNAの量と質を最大化するための重要で有用なヒントがいくつか含まれています。このRNA(マイクロRNAを含む)単離方法を開発および最適化する理由は、糞便中の微生物RNAを減らし、調査研究の変数を制限し、さまざまな交絡因子や汚染源を考慮せずに腸内のRNA組成を分析するためです。注目すべきことに、このRNA単離は、生細胞および生きた微生物からのRNAの放出を最小限に抑えます(細胞RNA)。腸細胞によって放出された、または食物摂取によって獲得された細胞外RNAに焦点を当てています。主に、この方法は微生物トランスクリプトームが調査される研究には適していません。

ここに記載されている研究動物を含むすべての方法は、ハーバード大学医学部ブリガムアンドウィメンズ病院の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

ここで説明するヒト研究対象を含むすべての方法は、パートナーズヒト研究委員会が定めたガイドラインに準拠しています。

1.糞便サンプル収集

1. オートクレーブまたはスクリューキャップ付きの滅菌およびヌクレアーゼフリーの2mLマイクロ遠心チューブを実験中の各動物対象用に調製する。
   1. ヒト被験者に対しては、各被験者に適切でヌクレアーゼフリーの滅菌便検体採取装置を提供する。
2. 無菌環境で各動物被験者から25〜100 mg(マウス糞便サンプルの場合は約1〜4個の糞便ペレット)を収集します。.
   注:最高純度のRNAを得るには、2つ以上の糞便ペレット(~50 mg以上)が好ましい。
   1. 必要なすべての個人用保護具(PPE)と材料(例:実験用手袋、消毒スプレー、滅菌ペーパータオル)を利用して、動物研究対象が置かれている作業エリアを滅菌し、糞便サンプルの汚染を回避します。
      1. ヒト被験者の場合、各研究対象/コレクターに、できるだけ無菌の環境で100〜200mgの便サンプルを収集するように指示します。標準的な無菌操作を使用し、便検体の汚染を避けてください。
3. 汚染を避けるために、他の表面に触れることなく、各動物被験者から糞便サンプルをスクリューキャップ付きの2mLマイクロ遠心チューブに直接収集します。
   1. ヒト被験者の場合、汚染を避けるために、提供された適用可能な収集装置(例えば、滅菌便検体収集キット)に直接排便するように各被験者に指示する。
      注意: トイレの表面、水、尿、またはその他の非滅菌の表面/物体による汚染を避けるように被験者に指示します。
4. 2 mLマイクロ遠心チューブで採取した糞便サンプルをすぐに-80°Cで凍結するか、ドライアイスの入ったバケツに入れてRNAの量と質を高めてから、以下の手順で説明するように糞便を再懸濁します。
   1. ヒト糞便検体の場合は、200 mgの新鮮な検体をスクリューキャップ付きの2 mLマイクロ遠心チューブに分注し、以下に説明するように糞便を再懸濁する前に-80°Cで凍結します。
      1. スクリューキャップ付きの2 mLマイクロ遠心チューブにない便検体を保管する場合は、以下に説明するように糞便を再懸濁する前に、凍結検体をそれぞれ100〜200 mgの重量を量り、スクリューキャップ付きの個別の2 mLマイクロ遠心チューブに移します。
         注:ヒトの糞便標本の場合、次の手順で問題が発生する可能性があるため、RNA分離のために200mgを超える便標本を服用しないでください。2 mLのマイクロ遠心チューブに過負荷のサンプルがあると、水相、有機相、および界面相が明確に形成および分離されない場合があります。手順はここで一時停止できます。

2.洗浄液の調製

1. miRNAアイソレーションキット( 材料の表を参照)に含まれている洗浄液1に21 mLの米国化学会(ACS)グレードの100%エタノールを加えて、ボトルに示されているように最終容量30 mLに到達します。すべてがボトルに溶けるまで渦を巻きます。
2. ボトルに示されているように、提供された洗浄液2/3に40 mLのACSグレード100%エタノールを加えて、最終容量の50 mLに到達します。5秒間、または最終混合物がよくブレンドされるまで渦巻きます。

3.機器と材料の準備

1. 作業エリアと機器、たとえば、実験室のベンチ、化学ヒュームフード内の作業エリア、マイクロ遠心チューブラックに、リボヌクレアーゼ(RNase)除染溶液(市販のRNase除染ソリューションなど)をスプレーします。汚染を避けるために、必要に応じていつでもどこでもRNase除染溶液を表面に塗布してください。
2. 清潔な白衣を着用し、フェイシャルマスクを着用し、適切な実験用手袋を着用して、糞便サンプル中のRNAを人間の皮膚に存在するヌクレアーゼから保護します。手袋にRNase除染液をスプレーし、汚染を避けるために手袋を頻繁に交換してください。
3. 糞便の再懸濁前の解凍を防ぐために、-80°Cで保存された糞便サンプル用のドライアイスのバケツと、貯蔵寿命を延ばすための材料用の氷のバケツを準備します。
   注意: プロトコルで使用される培地を含む材料がヌクレアーゼの汚染なしに無菌であることを確認してください。

4.糞便の再懸濁

1. 25〜100 mgの糞便サンプルを600 μLの滅菌1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に再懸濁します。
   注意:糞便サンプルは、サンプル中の細胞が融解すると氷の結晶が細胞コンパートメントの内側と外側の両方で破裂するため、RNaseと細胞RNAの放出を最小限に抑えるために、部分的な解凍もせずに-80°Cから解凍したらすぐに処理する必要があります。
   1. 室温(RT)の糞便サンプルを含むスクリューキャップ付きの2 mLマイクロ遠心チューブに600 μLの1x DPBSを追加します。
   2. 600 μLの1x DPBSに沈めた糞便サンプルの混合物を、RTで30分間キャップした2 mLマイクロ遠心チューブでインキュベートします。
   3. 1 mL ピペットチップでマッシュアップして混合物を再懸濁し、2 mL マイクロ遠心チューブをキャップした状態でよくボルテックスします。RNAの量と質を最適化して向上させるには、S4000(または4000 rpm)および45秒で1サイクルの設定でホモジナイザーで混合物を再懸濁します。

5.有機抽出

注意: 酸性フェノールを使用して、ステップ6までの次の手順には、危険な化学物質のヒュームフードを使用してください:クロロホルムとACSグレードの100%エタノールは、毒性と可燃性のため。危険物を取り扱うときは、必要に応じてPPEを交換し、適切な標準の予防措置に従ってください。

1. 600 μLの酸-フェノール:クロロホルムでRNAを抽出します(必要な酸-フェノール:クロロホルムの量は、ステップ4.1で添加した1x DPBSの初期量に相当します)。
   1. ステップ4.1の懸濁液に600 μLの酸-フェノール:クロロホルムを加えます。
      注:上相が水性緩衝液と混合されるため、酸-フェノール:クロロホルムをボトルの下相から引き出します。これら2つの相の間の間相が乱されている場合は、汚染を避けるために間相が再確立したときにのみ、酸 - フェノール:クロロホルムを待って引き抜いてください。
2. 混合物を60秒間ボルテックスして完全に混合します。あるいは、収量中のRNA量を最適化および増加させるために、S4000および45秒で1サイクルの設定でホモジナイザーを使用して混合する。
3. RTで10,000 x g で15分間遠心分離し、微量遠心分離機で水相と有機相を分離します。遠心分離後、間期はコンパクトになるはずです。そうでない場合は、遠心分離を繰り返します。
   注:遠心分離を数回繰り返した後、添加された酸-フェノール:クロロホルムの量に対する初期体積の比率が不均一である可能性があるため、間期が希望するほどコンパクトでなかった場合は、汚染を避けるためにより注意して水相を回収してください。
4. 水相を回収し、ヒンジキャップ付きの新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移します(miRNA分離キットには付属していません)。
   1. 下相を乱さずに水性(または上)相を慎重に取り除き、ヒンジキャップ付きの新しい2mLマイクロ遠心チューブに移します。転送された容量に注意してください(例:~500 μL)。
      注:間相がコンパクトで、上相が明確に分離されている場合、水相の上部にいくつかの小さな残留粒子が浮遊している可能性があります。ピペットでこれらの残留物を避け、目に見えて明確に分離された水相のみを回収して、少量の水相しか得られない場合でも、高品質のRNA収量を確保します。

6. 最終的なRNA単離

1. 2 mLマイクロ遠心チューブの水相に1.25容量のRT ACSグレード100%エタノールを追加します(たとえば、ステップ5.4から500 μLの水相を回収した場合は、625 μLの100%エタノールを追加します)。渦3秒。
2. 水相/エタノール混合物を、miRNA分離キットに付属のフィルターカートリッジに通します。
   1. サンプルごとに、フィルターカートリッジをキット付属の収集チューブの1つに入れます。
      1. ピペットで、600 μLの水相/エタノール混合物をフィルターカートリッジに入れます。
         注:ピペッティングする前に、混合物を短時間ボルテックスしてエタノールを水相と完全に混合します。一度にロードできる水相/エタノール混合物は700 μL以下です。
   2. 10,000 x g で90秒間遠心分離し、混合物をろ過します。高速で回転すると、フィルターが損傷する可能性があります。
   3. ろ液を廃棄し、連続したアプリケーションですべての混合物が同じフィルター膜でろ過されるまで、手順6.2.1から6.2.2を繰り返します。以下の洗浄手順で同じ収集チューブを保管して再利用します。
   4. 700 μLのmiRNA洗浄液1でフィルターを洗浄します。
      注意: miRNA洗浄液1には、皮膚の炎症や深刻な目の損傷を引き起こす可能性のあるグアニジンチオシアン酸塩が含まれています。手袋、フェイスシールド、防護白衣など、必要なPPEを着用してください。必要に応じて頻繁に手袋を交換してください。
      1. ACSグレードの100%エタノールで調製した作業溶液であるmiRNA洗浄溶液1を700 μLのフィルターカートリッジに塗布します。
      2. 60秒間遠心分離して、miRNA洗浄溶液1をフィルターカートリッジを通してろ過します。
      3. 収集チューブからろ液を廃棄し、同じフィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。
   5. フィルターを洗浄液2/3で、700 μL、500 μL、250 μLの容量でそれぞれ1回ずつ連続して洗浄します。
      1. ACSグレードの100%エタノールで調製した作業溶液である洗浄液2/3の700μLをフィルターカートリッジに塗布します。
         1. 10,000 x g で1分間遠心分離します。
         2. 収集チューブからろ液を廃棄し、同じフィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。
      2. 500 μLの洗浄液2/3をフィルターカートリッジに塗布します。
         1. 10,000 x g で1分間遠心分離します。
         2. 収集チューブからろ液を廃棄し、同じフィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。
      3. 250 μLの洗浄液2/3をフィルターカートリッジに塗布します。
         1. 10,000 x g で1分間遠心分離します。
         2. ろ液を回収チューブから捨てます。
      4. フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移し、アセンブリを5分間回転させて、フィルターから残留液を取り除きます。

7. 50 μLのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出

1. フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移します。50 μLのヌクレアーゼフリー水をフィルターの中央にピペットで入れ、回収チューブにキャップをします。
   1. RTで10分間インキュベートします。
   2. 8,000 x g で5分間スピンして、RNAを新しい収集チューブに回収します。
   3. 蛍光光度計を使用して、回収された糞便RNAの濃度と純度を決定します。回収した糞便RNAは-80°Cで保存できます。

代表的なRNAをそれぞれ50 mgのマウス糞便サンプル(2つのマウス糞便ペレット)および100 mgのヒト糞便標本から単離し、50 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出しました。濃度の分光光度計分析は、49μgおよび16μgのRNAの総量がそれぞれ単離されたことを示唆している(表1)。RNA純度は、A260/A280比が~2.0、A260/A230比が~1.8であることで示されるように高かった(表1)。報告3のように、糞便中のRNAの大部分はマイクロRNAであり、それらのマイクロRNAはエクソソームに存在する可能性があります。これと一致して、RNAのチップベースの電気泳動アッセイは、マウスおよびヒトの糞便からの代表的なRNA分離株は、18Sおよび28S rRNA組成が低いか欠如しており、RNA分離株のサイズが小さなRNA領域にあることを示唆しています(図1A)。チップベースの電気泳動によるさらなる低分子RNA電気泳動により、RNAの大部分がマイクロRNAサイズであることが明らかになりました(図1B)。これは、低分子RNAバイオアナライザーを使用して完了した定量が、以前のアッセイ6で得られたものに匹敵するという観察と一致しています。

表1:このプロトコルで単離されたRNAの代表的なナノドロップ分析。 代表的なRNAを2匹のマウス糞便ペレットまたは100 mgのヒト糞便検体から単離し、50 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出しました。RNA濃度、A260/A280の比率、およびA260/A230の比率をナノドロップで測定しました。

図1:糞便RNA分離株のサイズ分布の代表的なチップベースの電気泳動分析。 (A)ここで説明したプロトコルを使用して2つのマウス糞便ペレット(左パネル)および100 mgヒト糞便標本(右パネル)から単離された代表的なRNAを、チップベースの電気泳動アッセイを使用して特徴付けました。このアッセイは、RNA単離物の大部分が低分子RNAであることを示唆している。(B)次に、分離株をチップベースの電気泳動システムで低分子RNA電気泳動にかけ、分離株のサイズ分布を分析しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、このプロトコルペーパーに記載されている研究方法に関連する関連または重要な金銭的利益を宣言しません。