糞便(マイクロ)RNA単離

Summary

このプロトコルは、動物およびヒト被験者の糞便サンプルから高品質のトータルRNAを分離します。市販のmiRNA分離キットは、最適化された量と質で純粋なRNAを単離するために、大幅に適応して使用されます。RNA分離株は、シーケンシング、マイクロアレイ、RT-PCRなどのほとんどのダウンストリームRNAアッセイに適しています。

Abstract

RNAは、動物やヒトの腸管腔や糞便に存在することが明らかになりつつあります。以下に説明するプロトコルは、動物およびヒト被験者の糞便サンプルからマイクロRNAを含む全RNAを単離する。目的は、RNAシーケンシング、RT-PCR、マイクロアレイなどのダウンストリーム分析のために、高純度および量のトータルRNAを単離することです。miRNA単離におけるこの最適化されたプロトコルの利点は、説明されている追加の洗浄ステップで高度に精製されたRNA製品を単離する能力、サンプルの再懸濁における改良された方法で得られるRNAの量の増加、および除染の重要なヒントです。1つの制限は、これらのサンプルサイズが間期の明確な形成を困難にするため、200 mgを超えるより大きなサンプルを処理および精製できないことです。その結果、サンプルサイズが大きいと、プロトコルに記載されているように、抽出される水相が、最終的に単離されたRNAの品質に影響を与える有機物で汚染される可能性があります。ただし、ほとんどのダウンストリーム分析には、最大200 mgのサンプルからのRNA分離で十分です。

Introduction

細胞外RNAは、多くの生物学的プロセスを媒介する重要な因子として認識されつつあります¹。糞便中の細胞外RNAは、2008年に結腸癌および活動性潰瘍性大腸炎のマーカーとして最初に報告され²、最近、腸管腔および糞便の正常な成分として明らかにされ、宿主と微生物のコミュニケーションを媒介します^3,4,5。このRNA分離プロトコルの目的は、動物およびヒトの被験者から収集された糞便サンプルから高品質の細胞外RNAを抽出することです。このプロトコルは、市販のmiRNAアイソレーションキットから採用されました。取得したRNAは、RNAシーケンシング、RT-PCR、マイクロアレイなどのダウンストリーム分析に利用されます。このプロトコルには、動物や人間の糞便に含まれるRNAの量と質を最大化するための重要で有用なヒントがいくつか含まれています。このRNA(マイクロRNAを含む)単離方法を開発および最適化する理由は、糞便中の微生物RNAを減らし、調査研究の変数を制限し、さまざまな交絡因子や汚染源を考慮せずに腸内のRNA組成を分析するためです。注目すべきことに、このRNA単離は、生細胞および生きた微生物からのRNAの放出を最小限に抑えます(細胞RNA)。腸細胞によって放出された....

Protocol

ここに記載されている研究動物を含むすべての方法は、ハーバード大学医学部ブリガムアンドウィメンズ病院の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。

ここで説明するヒト研究対象を含むすべての方法は、パートナーズヒト研究委員会が定めたガイドラインに準拠しています。

1.糞便サンプル収集

1. オートクレーブまたはスクリューキャップ付きの滅菌およびヌクレアーゼフリーの2mLマイクロ遠心チューブを実験中の各動物対象用に調製する。
   1. ヒト被験者に対しては、各被験者に適切でヌクレアーゼフリーの滅菌便検体採取装置を提供する。
2. 無菌環境で各動物被験者から25〜100 mg(マウス糞便サンプルの場合は約1〜4個の糞便ペレット)を収集します。.
   注:最高純度のRNAを得るには、2つ以上の糞便ペレット(~50 mg以上)が好ましい。
   1. 必要なすべての個人用保護具(PPE)と材料(例:実験用手袋、消毒スプレー、滅菌ペーパータオル)を利用して、動物研究対象が置かれている作業エリアを滅菌し、糞便サンプルの汚染を回避します。
      1. ヒト被験者の場合、各研究対象/コレクターに、できるだけ無菌の環境で100〜200mgの便サンプルを収集するように指示します。標準的な無菌操作を使用し、便検体の汚染を避けてください。

Results

代表的なRNAをそれぞれ50 mgのマウス糞便サンプル(2つのマウス糞便ペレット)および100 mgのヒト糞便標本から単離し、50 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出しました。濃度の分光光度計分析は、49μgおよび16μgのRNAの総量がそれぞれ単離されたことを示唆している(表1)。RNA純度は、A260/A280比が~2.0、A260/A230比が~1.8であることで示されるように高かった(表1)。報告³のように、糞便中のRNAの大部分はマイクロRNAであり、それらのマイクロRNAはエクソソームに存在する可能性があります。これと一致して、RNAのチップベースの電気泳動アッセイは、マウスおよびヒトの糞便からの代表的なRNA分離株は、18Sおよび28S rRNA組成が低いか欠如しており、RNA分離株のサイズが小さなRNA領域にあることを示唆しています(図1A)。チップベースの電気泳動によるさらなる低分子RNA電気泳動により、RNAの大部分がマイクロRNAサイズであるこ.......

Discussion

分離中のRNase汚染を防ぐために、RNaseフリー技術を使用することが重要です⁷。遠心分離とコンパクトな間相の形成後、水相を回収するときは、水相、下相、および水相の上部に浮遊する粒子汚染物質を回避することが重要です。さらに、500 μLと250 μLの洗浄液2/3による2つの洗浄ステップが追加され、フィルター膜内の汚染物質を除去して品質を最適化します。さらに、200 mgを超える開始サンプル材料は、間相の明確な形成が困難になる可能性があるため、推奨されません。同様に、25 mg未満のサンプル材料は、ダウンストリーム分析に十分なRNAサンプルを抽出するのに十分ではない可能性があるため、推奨されません。

マイクロバイオーム研究の驚異的な成長により、微生物種、遺伝子の測定が微生物プロファイル⁸のメタ転写研究に駆り立てられました。便中のマイクロRNAは、疾患^のマーカーとして研究されている9,10,11。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酸-フェノール:クロロホルム、pH 4.5(IAA付き、125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし	Thermo Fischer Scientific	14190-144
手袋
微量遠心分離機
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
ヌクレアーゼフリー微量遠心チューブ(1.5 mL、2 mL)
ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理なし)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
ピペットおよびヌクレアーゼフリーピペットチップ(フィルター付き)
PowerLyzer 24 ホモジナイザー	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase 除染液	Thermo Fischer Scientific	AM9780
ボルテックスシェーカー