分子解析のための小脳局所解剖

サマリー

異なる小脳領域は、異なる行動出力に役割を果たすのに関与してきましたが、根本的な分子メカニズムは不明のままです。本研究では、RNAを単離し、遺伝子発現の違いを検査することによって分子の違いを探るために、半球の小脳皮質、前部および後部の小脳部、および深い小脳核を再現的かつ迅速に解剖する方法を説明する。

要約

小脳は、動きの制御を含むいくつかの重要な機能で重要な役割を果たしています, バランス, 認知, 報酬, そして、影響.イメージング研究は、異なる小脳領域がこれらの異なる機能に寄与することを示している。局所的小脳の違いを調べる分子研究は、主に小脳エキス全体で行われるため、特定の小脳領域にわたる区別を隠すため、遅れている。ここでは、深い小脳核(DCN)、前および後の脊髄小脳皮質、半球の小脳皮質の4つの異なる小脳領域を再現し、迅速に解剖する技術について説明します。これらの異なる領域を解剖することは、バランス、動き、影響および認知への彼らのユニークな貢献の根源となり得る分子メカニズムの探求を可能にする。この技術はまた、様々なマウス疾患モデルにおけるこれらの特定領域の病理学的感受性の違いを探求するために使用され得る。

概要

小脳は脳内のニューロンの半分以上を含み、歴史的に脳内の運動制御とバランスセンターと呼ばれています¹.最近では、小脳が認知、報酬処理、および^{2、3、4、5}に影響を及ぼすなど、他のさまざまな機能において重要な役割^を果たしていることを実証した。

小脳は、よく記述された解剖学を有する:皮質領域は顆粒、プルキンジェ、および分子層で構成される。顆粒細胞は、顆粒細胞層を形成し、分子層のプルキンエ細胞デンドライトに平行繊維を介して入力を送信し、劣ったオリーブに由来する上昇繊維からの入力も受け取る。プルキンエ細胞は、小脳からの主な出力として機能する深小脳核(DCN)内の細胞に抑制性の投影を送る。この小脳回路の出力は、ゴルジ、ステレート、およびバスケット細胞⁴を含む小脳皮質における阻害性相互作用ニューロンの活性によってさらに変調される。この小脳機能ユニットは、小脳皮質のすべての小葉全体に分布しています。小脳を横切るこの比較的均一な回路にもかかわらず、ヒトの神経イメージング文献および患者研究からの証拠は、小脳

プロトコル

1. セットアップ

1. 切断ハサミ、鈍い鉗子、解剖はさみ、血管はさみ、マイクロスタッラ、矢状マウス脳マトリックス、カミソリの刃、200 μLピペット先端、ガラスシャー、ガラススライド、およびアイスバケツを含む必要な機器を収集します。吸収パッド上のすべての機器をレイアウトします。
2. シャーレ、ガラス板、脳マトリックスを氷の上に置きます。
3. カミソリの刃を垂直な角度で使用し、1つの200 μLピペットチップの先端から約5mmを切ります。これにより、先端の端部の開口部のサイズは約1mm幅になります。これは DCN をパンチアウトするのに十分なはずです。しかし、これはまた、解剖に応じて必要に応じて調整することができます。簡単に交換と調整のための準備ができて多くのヒントを持っています。
4. 動物の同一証明および小脳領域(動物ごとの4つの管)が付いているラベル1.5 mLマイクロフュージ管。
5. 抽出後に凍結組織をフラッシュするために液体窒素で凍結安全な容器を充填します。

2. 脳の抽出と解剖

すべての実験は、ミネソタ大学動物ケア委員会のガイドラインに従って行われました。

1. 5%の_CO2 露光を使用してマウスを安楽死させます。呼吸が....

結果

これらの実験では、生後11週齢の雌野生型C57/Black6マウス4匹を使用した。1つのマウスは、「バルク小脳」と呼ばれる完全な小脳解離を行うために使用され、解剖された領域のRNAレベルを完全解剖と比較することを可能にした。他の3匹のマウスを用い、このプロトコルに記載された小脳解剖を行った。3匹のマウスを使用することで、RNAのレベルで検出された傾向がマウス全体で再現可能であることを確認することができます。

図1Aは 、マウス小脳-青で朱色、黄色の半球を表す。ベルミの矢状の概略図(濃い青色の前領域、水色の後部領域)および半球(黄色)。DCN は赤い点線のボックスで強調表示されます。解剖が成功すると、脳の正中線の下に最初のカミソリの刃の配置から始まります (図 1B);これは、次の 6 つのブレードの配置を正常に行うガイドです (

ディスカッション

ここで説明する方法は、4つの異なる小脳領域内の基礎となる遺伝子発現および分子メカニズムを評価することを可能にする - 深い小脳核(DCN)、脊椎の前小脳皮質(CCaV)、ベルミの後小脳皮質(CCpV)、および半球の小脳皮質(CCH)。これらの領域を別々に評価する能力は、特定の小脳領域の不均一性に関する我々の知識を拡大し、おそらく様々な行動への貢献に光を当てる。

完全な脳組織を矢状に切り離すことによって、小脳のこれら4つの領域を容易に可視化して同定することができ、迅速な解剖を可能にする。著者の知る限りでは、これは分子分析のための完全な小脳局所解剖の最初の記述である。最近発表された論文では、研究者は分子解析²²のために小脳の前小葉と小脳のうなず小葉の一括解剖を使用した。しかし、説明された方法では、DCNを解剖することもできないであろう。300um厚さのスライスをカットするためにビブラートメを使用してDCNパンチを分離しようとする試みは、通常、3つの重大な問題に遭遇します。第1に、脳の取り付けと組織が切断される角度のわずかな違いのために、動.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 マイクロ遠心チューブ	ThermoScietific	3456
100% イソプロピルアルコール	VWR ライフサイエンス	1106C361
200 ul ピペットチップ	GeneMate	P-1237-200
大人 マウス 脳 マトリックス サジタル	ケント サイエンティフィック	コーポレーション RBMA-200S
鈍い鉗子
クロロホルム	マクロン	220905
斬首ハサミ
剖ハサミ
チルアルコール	Pharmco	111000200
スライドガラス(電気泳動用)	BIORAD
ホモジナイザーキン	ブル	6HAZ6
アイスバケツ
インスリン注射器 (.5ml)	BD	329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR	BIORAD	1725037
マイクロスパチュラ
ニードル ノーズ
ペトリ皿	パイレックス
プライムタイム プライマー アルドラーゼ C	IDT	Mm.PT.5>43415246
8 用Kcng4	IDT	Mm.PT.56a.9448518
パルブアルブミン用プライムタイムプライマー	IDT	Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer RPS18	IDT	Mm.PT.58.12109666
シングル エッジ Rzor ブレード	Personna GEM
滅菌済み、単用乳棒	FisherScientific	12141364
TRIzol 試薬	Ambion by Life technologies	15596018
血管はさみ

解エ鉗子