Method Article

機能的および解剖学的に異なる領域へのマウス脳の微小解剖

DOI:

10.3791/61941

⸱

February 15th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Geneva Foundation, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 2Walter Reed Army Institute of Research, Medical Readiness Systems Biology, Center for Military Psychiatry and Neuroscience, 3ORISE Fellow, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 4Headquarter, Walter Reed Army Institute of Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、新鮮な脳組織からの離散領域のマウス脳除去および解剖のための実践的な、段階的、迅速なプロトコルを提示する。分子解析のために脳領域を取得することは、多くの神経科学研究室で日常的になっています。これらの脳領域は直ちに凍結され、システムレベルの解析のための高品質のトランスクリプトームデータが得られます。

Abstract

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脳は哺乳類の神経系の司令センターであり、構造的に非常に複雑な器官です。頭蓋骨内で保護された脳は、大脳皮質として知られる半球上の灰白質の外側の覆いで構成されています。この層の下には、存在にとって重要な複数の現象に不可欠な他の多くの特殊な構造があります。特定の総脳領域のサンプルを取得するには、迅速かつ正確な解剖手順が必要です。微視的なレベルでは、多くのサブ領域が存在し、この解剖の目的のために課す任意の地域の境界を越える可能性が高いことが理解される。

マウスモデルは、ヒトの脳機能および疾患を研究するために日常的に使用されている。遺伝子発現パターンの変化は、罹患状態に応じて特定の表現型を標的とする特定の脳領域に限定され得る。したがって、その明確に定義された構造組織に関して転写の調節を研究することは非常に重要です。脳を完全に理解するには、異なる脳領域を研究し、接続を定義し、これらの各脳領域の活動における主要な違いを特定する必要があります。これらの異なる領域のそれぞれをより包括的に理解することは、神経科学の分野における新しく改善された治療への道を開くかもしれない。ここでは、マウスの脳を16の異なる領域に解剖するための段階的な方法論について説明します。この手順では、オスマウスC57Bl/6J(6-8週齢)の脳摘出と、神経解剖学的ランドマークを用いた複数の領域への解剖に焦点を当て、機能的に関連する脳領域と行動的に関連する個別の脳領域を同定し、サンプリングしました。この研究は、神経科学の分野で強力な基盤を築くのに役立ち、脳機能のより深い理解におけるより焦点を絞ったアプローチにつながります。

Introduction

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脳は、脊髄および網膜とともに、全身にわたって特殊化され、正確に位置決めされ、相互作用する細胞型によって制御される複雑な行動を実行する中枢神経系を構成する1。脳は、何十億もの相互接続されたニューロンとグリアを持つ複雑な器官であり、多数の機能を果たす正確な回路を備えています。これは、2つの異なる葉と多様な細胞成分2を有する両側構造である。脊髄は脳を外界に接続し、骨、髄膜、脳脊髄液によって保護され、脳との間でメッセージをルーティングします2,3,4。脳の表面である大脳皮質は不均一で、ジャイリと呼ばれる明確なひだと、脳を機能中枢に分離するスルシと呼ばれる溝を持っています5。皮質は小さな脳を持つ哺乳類では滑らかです 6,7.異なる脳領域に関連する障害とその機能回路を理解するために、人間の脳の構造を特徴付け、研究することが重要です。近年、神経科学の研究が拡大し、脳の構造や機能を研究するために様々な実験方法が用いられています。分子・システム生物学の分野における発展は、脳構造と分子の機能との複雑な関係を探....

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Protocol

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動物の取り扱いおよび実験手順は、動物ケアに関するヨーロッパ、国家および機関のガイドラインに従って実施された。すべての動物実験は、米国陸軍環境衛生研究センター(現在のウォルターリード陸軍研究所(WRAIR)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)の認定を受けた施設で実施されました。
注:この手順は、子宮頸部脱臼によって安楽死させたC57BL/6j株の6〜8週齢の雄マウスに対して行われる16。私たちの研究室では灌流は行われていませんが、血管系から血液をきれいにするための灌流を行うことができるように、このプロトコルを変更することができます。解剖に必要なすべての消耗品は、 材料表に記載されています。解剖は、脳の除去、下垂体の除去および脳の解剖を含む3つの構成要素に細分される。脳組織収集の目的は、RNA抽出後のトランスクリプトームアッセイのためにそれらを処理することです。脳領域が解剖されるとすぐに、各脳領域をすでにラベル付けされた冷凍バイアルに移し、バイアルを液体窒素または-80°Cに保管します。
注:神経解剖学の徹底的な知識は、この手順を実行するために不可欠です。水平および縦方向のセクション、ならびに通常の横方向のセクションは、研究され、学習されるべきである。脳組織は非常に急速に劣化するので、この手順を実行しながらアトラスに相談する時間はありません。

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Results

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複雑な脳の構造と機能に関する私たちの理解は急速に進化し、改善されています。脳には複数の異なる領域が含まれており、分子マップを構築することは、脳がどのように機能するかをよりよく理解するのに役立ちます。この方法論文では、マウスの脳を複数の異なる領域に解剖することについて議論しました(表1)。このプロトコルでは、構造は重要なランドマークに基づいて同定され、即時解剖のためにその頑丈さを保持することによって、生理食塩水で組織を湿らせておくことによって達成される。この方法は、他の報告21 よりも多くの領域をカバーし、凍結脳22、23を用いた解剖方法を補完するものである。これらの解剖された組織は、研究の要件に応じて後で保存および処理することができる。ここで議論される方法は、頭蓋骨から脳を即時に除去し、続いてマウス脳の大きさを与えられた下流アッセイのための迅速な方法で十分な組織を提供する解剖である。私たちのチームは、複数の解剖された組織からRNAを抽出し、.......

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Discussion

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哺乳類の脳は、多様な分子シグネチャを持つ形態学的に明確で機能的にユニークな細胞の配列と、特殊で離散的な機能を実行する複数の領域で構成される複雑な器官です。ここで報告する解剖手順は、ラボの要件に応じて複数の目標を持つことができます。私たちの研究室では、ストレスのようなPTSDに曝露されたマウスから採取した複数の脳領域における転写を評価した16 。我々は、複数の脳領域における発現レベルに対する系統の遺伝的背景24 の影響をさらに研究したいと考えています。このプロトコルには、実験の再現性を成功させるために考慮する必要がある複数の重要なステップがあります。脳のそれぞれの局在領域は、神経病理学的状態において明確な役割を果たしており、研究する適切な脳領域の詳細な知識が欠けている。したがって、脳領域に関するデータセットを生成することが重要です。したがって、データは、脳領域を選択することによってだけでなく、より正確な情報につながるデータカテゴリ(例えば、トランスクリプトーム、タンパク質、細胞(細胞構造)、または他の)によっても照会することができる。これまで、.......

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Disclosures

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著者らには開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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セシュマリニ・スリニヴァサン氏、スティーブン・バトラー氏、パメラ・スペルマン氏には実験的な支援をいただき、ダナ・ユセフ氏は原稿の編集に感謝いたします。USAMRDCからの資金援助は感謝の意をもって認められています。ジュネーブ財団はこの作業に貢献し、米国陸軍研究局を通じて軍事および運用医学研究地域局IIIからの資金によって支援されました。

免責事項：

資料はウォルター・リード陸軍研究所によってレビューされています。そのプレゼンテーションおよび/または出版に異議はありません。ここに含まれる意見または主張は、著者の私的見解であり、公式として、または陸軍省または国防総省の真の見解を反映していると解釈されるべきではありません。研究は、動物福祉法および動物を含む実験に関するその他の連邦法令および規制に準拠し、AAALAC認定施設で承認された動物使用プロトコルに基づいて実施され、 実験動物のケアおよび使用のためのガイド、NRCパブリケーション、2011年版に記載されている原則を遵守します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
脳の除去
DeaverはさみRoboz Surgical StoreRS-67625.5 "ストレートシャープ/シャープ
DeaverハサミRoboz Surgical StoreRS-67635.5 "湾曲したシャープ/シャープ
繊細な手術ハサミRoboz Surgical StoreRS-67034.75 "湾曲したシャープ/シャープ
繊細な手術用ハサミロボズ手術用店舗RS-67024.75インチ ストレートシャープ/シャープ
軽い手術用ハサミロボズ 手術用ハRS-67535インチ 湾曲したシャープ/シャープ
マイクロヘラ、半径、先細りのフラットエンドステンレス製鏡面仕上げ
手術用ハサミ 6.5インチロボズ サージカルストアRS-6846湾曲、シャープ/シャープ
組織鉗子Roboz Surgical StoreRS-81604.5" 1X2 歯 2mm 先端幅
Rongeur (オプション)Roboz Surgical StoreRS-8321 多くのスタイルLempert Rongeur 6.5" 2X8mm
下垂体解剖
メス ハンドルRoboz Surgical StoreRS-9843メス ハンドル #3 ソリッド 4「
とブレードRoboz Surgical StoreRS-9801-11滅菌メスブレード:#11 Box 100 40mm
超微細鉗子 InoxRoboz Surgical StoreRS-4955先端サイズ 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A 倍率バイザーPenn Tool Col40-178-62.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification,長方形拡大鏡
解剖コールドプレートCellpath.comJRI-0100-00Aアイスバーグ コールド プレート & ベース
グレーフ鉗子、フルカーブ 超繊細なRoboz サージカル ストアRS-51380.5 mm チップ 4"(10 cm)長い
軽い操作はさみRoboz Surgical StoreRS-67535 "湾曲した鋭い/鋭い
メスハンドルRoboz Surgical StoreRS-9843(上記で繰り返し)メスハンドル#3ソリッド4 "
およびブレード(特に#11)Roboz Surgical StoreRS-9801-11(上記で繰り返し)滅菌メスブレード:#11ボックス100 40mm
ヘラアマゾンMS-SQRD9-4ダブルエンドスパチュラスクエアおよびラウンドエンド
組織鉗子RobozサージカルストアRS-8160(上記で繰り返される)4.5インチ1X2歯
サミ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  2. Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
  3. P, T. L. S.

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Mouse Brain DissectionBrain Region IsolationNeuroanatomical LandmarksCerebral Cortex RemovalCerebellum DissectionHypothalamus SeparationThalamus IsolationAmygdala ExtractionHippocampus DissectionSeptal Nuclei Identification

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