方法論記事

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

DOI：

10.3791/61947

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2020年12月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Research Institute of Hearing Enhancement, Yonsei University Wonju College of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Hallym University College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex vivoインキュベーションによって損傷組織に向かって移動する細胞を観察するリアルタイムイメージング法を提示する。

要約

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間葉系幹細胞(MCs)が細胞再生および治療に及ぼす影響を調べ、人工内皮との共培養後のMSC移行および形態学的変化を追跡する。コルティの器官は、解剖中に発生したライスナーの膜の一部を押すことによってプラスチックカバースリップに固定化された。ガラスシリンダーで閉じ込められたMSCは、シリンダーが取り外されたときに人工内皮上皮に移行した。彼らの主な局在は、コルチの器官の透析で観察され、神経線維と同様の方向に整列した。しかし、いくつかのMSCは、手足の領域に局在し、水平に細長い形状を示した。また、毛細胞領域への移動が増加し、カナマイシン処理後にMSCの形態が様々な形態に変化した。結論として、この研究の結果は、人工内皮とのMSCの共培養が細胞移植による治療薬の開発および様々な条件および要因を調べることができる細胞再生の研究に有用であることを示している。

概要

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難聴は先天的に起こり得るか、加齢、薬物、騒音を含むいくつかの要因によって徐々に引き起こされる可能性がある。難聴は、聴力を担う毛細胞が損傷した後に機能障害を回復することは非常に困難であるため、しばしば治療が困難である。世界保健機関(WHO)によると、世界の4億6,100万人が難聴と推定されており、これは世界人口の6.1%を占めています。難聴者のうち93%が成人で、7%が子供です。

多くのアプローチは、難聴を治療するために試みられてきた;特に、MSCを用いた再生アプローチが有望な治療法として登場している。組織が損傷すると、MSCは循環系に自然に放出され、損傷部位に移動し、そこで様々な分子を分泌して再生を促進する微小環境を形成する2。したがって、外部移植されたMSCを標的とする臓器への移行と、強力な免疫調節、血管新生、および抗アポトーシスを引き起こす分子のその後の分泌を通じて損傷した組織を治療する方法を開発することが重要であり、損傷した細胞機能3、4、5の回復を強化する。

MSCが損傷した組織に移行するホーミングプロセスは、克服すべき最も重要な障害である可能性があります。MSCには、テザリング/ローリング、活性化、逮捕、トランスマイグレーション/ダイアペデス、および移行6、7、8の順次ステップを備えた全身ホーミングメカニズムがあります。現在、これらのステップを改善する方法を特定するための取り組みが進行中です。遺伝子組み換え、細胞表面工学、インビトロプライミング、磁気誘導など、さまざまな戦略が6,7で試験されています。さらに、損傷した人工内毛部位にMSCをホーミングすることにより、聴覚毛細胞の保護と再生を促進するためにいくつかの試みがなされている。しかし、インビボでのMSCの追跡は時間と労力を要し、高度に専門的なスキルを必要とします 9.

この問題を解決するために、数時間にわたって細胞の移動を撮影するタイムラプス共焦点顕微鏡を介して、内腔内のMSCのホーミングを観察する方法が開発された(図1)。それは20世紀 初めに開発され、最近特定の細胞の移動を研究するための強力なツールとなっています。

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図1:図1:(A)コルティの解剖された器官が鉗子を用いてプラスチックカバースリップに付着した後、カバースリップは35mmガラス底の共焦点顕微鏡皿に置かれ、(B)ガラスシリンダーが配置される。(C)ガラスシリンダーの内部を媒体で充填した後、(D)GFPラベル付きMSCを媒体で慎重にシリンダーの外に追加する。(E)一晩のインキュベーション後、ガラスシリンダーを取り外し、画像を共焦点顕微鏡で撮影する。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC = 間葉系幹細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

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ICRマウスを含むすべての研究プロトコルは、元州医科大学延世大学の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験は世界医師会倫理規定に従って行われた。このプロトコルでは、妊娠中のICRマウスを12/12時間の明暗サイクルに保ち、食物および水に自由にアクセスした。

1. コクリー解剖

  1. 紫外線を30分間オンにして層流組織培養フードを殺菌し、使用前に70%エタノールで全ての表面をスプレーします。表面を乾かします。
  2. 解剖器を70%エタノールに10分間入れ、使用する前に乾燥させます。
  3. 手術用ブレードを使用して、出生後3-4日齢のマウスの首を切り落とします(図2A)。
  4. 頭蓋骨を層流フードの実体顕微鏡の下に置き、組織を70%エタノールに浸します。
  5. 組織を組織解剖液(1xハンクスバランス塩溶液、1 mM HEPES)に素早く浸し、エタノールを除去する。
  6. 外科用ブレードで頭蓋骨の中心線を切る(図2B、C)。
  7. 皮膚を前から引き下げ、耳の外耳道を切断して頭蓋骨を露出させる(図2D)。
  8. 眼線を横切って頭蓋骨の前部から後部に切り取る(図2E)。
  9. 頭蓋骨を開き、前脳、小脳、脳幹を鈍い鉗子で取り除く(図2F、G)。
  10. マイクロ鉗子を用いて、側頭骨から内耳を分離する(図2H)。
  11. 組織解離液を含むペトリ皿にコクリーを移します。
  12. 内の人工内軟組織のみを残して、すべての人工内臓のオティックカプセルを慎重に解剖する(図2I、J)。
  13. 鉗子と別の鉗子のペアで人工内耳管の変化を保持し、ゆっくりと2つの組織を分離する(図2K)。
  14. ストリア血管症とテクトリアル膜を静かに剥がして取り除く(図2L、M)。
  15. 新しい組織解剖液に殺菌プラスチックカバースリップを入れ、コルティの器官を直径9mmのカバースリップに置き、バジラー膜が下向きであることを確認する(図2N-P)。
  16. Reissnerの膜と残りの変形組織を鉗子でカバースリップに押し込んで組織を固定化する(図2N-P)。
  17. 埋め込みティッシュのカバースリップを直径35mmの共焦点皿の中心に移す。
  18. 皿の中央に位置する人工内草を持つガラスクローニングシリンダーを皿の上に置き、100 μLの外植培養培地(DMEM/F12、10%胎児血清(FBS)、1%N2サプリメント、アンピシリン(10μg/mL))をシリンダー内に10を加える(図2Q)。
  19. プレート5×マウス骨髄由来緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きMSPの10細胞

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結果

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3次元モードにおけるMSCのインビトロ移行は、トランスウェルシステムまたは従来の創傷治癒法によって評価され、2次元(2D)モード11での移動を観察する。コルティの器官は、ボエッチャー細胞、クラウディウス細胞、Deiters細胞、ピラー細胞、ヘンセン細胞、外毛細胞、内毛細胞、神経線維、バジル膜、および網状層層などの様々な細胞から構成される複雑な構造である。このような複雑な細胞で構成される組織にMSCを移植する場合、細胞がどこでリクルートされ、安定されているかを確かめる技術を使用することは、MSCを用いた細胞療法と再生のメカニズムを理解する上で極めて重要です。また、MSCが損傷の有無に局在する方法を決定するために、創傷治癒法のような2D法は、細胞が一方向にランダムに下方に移動するトランスウェルシステムよりも適している。

本研究では、MSCとコルチの器官との間の障...

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ディスカッション

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損傷した細胞の再生を促進するために、損傷部位へのMSCの移植が広範囲に研究されており、治療効果が明らかである。移植とその後のMCの分化は、3-ニトロプロピオン酸13によって誘発される難聴を有するラットの聴力を回復させることが報告されている。Leeらはヒトに対してMSCをトランスベンで適用したが、彼らは聴覚14において有意な改善を達成しなかった。最近まで、MSC移植によるげっ歯類モデルの聴覚を回復させるために、ほぼ12の実験が行われました。結果は異質性のためにやや不明であるが、MSCが聴覚を促進することができるといういくつかの兆候がある。

化学吸引に関連する様々な成長因子およびケモカインは、異質性または均質性15に関係なく、損傷した領域への移植幹細胞の移動に関与している。ケモカインは、組織ホメオスタシス、免疫応答、創傷治癒のための細胞移動の主要な調節因子です。生体内のケモカイン誘導化学引力は、インビボとインビトロの実験条件の違いのために、イン...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、韓国国立研究財団(NRF)とハリム大学研究基金の研究助成金(NRF-2018-R1D1A1B07050175、HURF-2017-66)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10X PBSバッファーGenDEPOTP2100-104
4%ホルマリンT&IBPP-9004
アンピシリンシグマ A5354-10ml
BSAシグマ A4503-100G
共焦点ディッシュSPL200350
共焦点顕微鏡 ZEISSLSM800
coverslipSPL20009
DMEM/F12Gibco10565-018
Fetal Bovine SerumThermo Fisher scientific16140071
Fluorsheild with DAPIsigma F6057
フォーセプスデュモン0508-L5-P0
HBSSサーモフィッシャー 科学14065056
HEPESサーモフィッシャー 科学15630080
N2 サプリメントGibco17502-048
ファロイジン-iFluor 647 試薬abcamab176759
ステージトップインキュベーター東海HITWELSX
C57BL/6マウスメッセンキマ系幹細胞とGFPシアーゲンMUBMX-01101
Triton X-100sigma T8787

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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