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デジタル高速毛様体ビデオ顕微鏡を使用した鼻ブラッシングサンプリングと処理–COVID-19パンデミックへの適応

DOI:

10.3791/61949

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November 7th, 2020

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1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center, University of Liège, 2Department of ENT, University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit, University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics, University of British Columbia and British Columbia Children's Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology, University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics, University Hospital of Liège

In This Article

Summary

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PCD診断のための高品質毛様体機能解析を成功させるには、呼吸上皮のサンプリングと処理のための正確で慎重な方法が不可欠です。COVID-19パンデミックの間もPCD診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルが更新され、適切な感染管理対策が追加されました。

Abstract

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原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、遺伝的運動性繊毛症であり、重大な耳鼻咽喉科肺疾患を引き起こします。PCD診断は、さまざまな診断モダリティの課題のために見逃されたり遅れたりすることがよくあります。PCDの診断ツールの一つであるデジタル高速ビデオ顕微鏡(DHSV)を用いた毛様体ビデオ顕微鏡は、毛様体拍動周波数(CBF)と拍動パターン(CBP)解析からなる毛様体機能解析(CFA)を行うのに最適な方法と考えられています。ただし、DHSVには、サンプルを処理および分析するための標準化された公開された操作手順がありません。また、COVID-19パンデミック時の重大な感染管理の問題である生体呼吸器上皮を使用しています。この健康危機の間も診断サービスを提供し続けるために、毛様体ビデオ顕微鏡プロトコルは、適切な感染管理対策を含むように適応されています。

ここでは、繊毛呼吸器サンプルのサンプリングと実験室処理のための改訂されたプロトコルについて説明し、COVID-19感染管理対策に準拠するために行われた適応を強調します。このプロトコルに従って処理および分析された、16人の健康な被験者から得られた鼻ブラッシングサンプルからのCFAの代表的な結果が記載されている。また、品質選択基準を満たさないサンプルではCFAが可能になり、診断の信頼性とこの技術の効率が低下する可能性があるため、最適な品質の上皮繊毛ストリップを取得して処理することの重要性についても説明します。

Introduction

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原発性毛様体ジスキネジア(PCD)は、遺伝性の不均一な運動性繊毛症であり、呼吸繊毛が静止している、遅い、または運動障害であり、粘液繊毛クリアランスの障害および慢性耳鼻肺疾患を引き起こします1,2,3,4。PCDの臨床症状は、乳児期初期から始まる慢性的な湿った咳と慢性的な鼻づまり、気管支拡張症につながる再発性または慢性の上気道および下気道感染症、および再発性または慢性の中耳炎と副鼻腔炎です5,6,7。PCD患者の約半数は、上皮内または曖昧な上皮などの臓器側性欠損を呈しています。一部の患者はまた、男性の不動の精子と女性の卵管の不動繊毛による不妊症の問題を呈します1,2,8。PCDはまれですが、有病率を定義するのは難しく、1:10,000から1:20,000の範囲です....

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Protocol

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承認は、リエージュの病院と教員の倫理委員会と職場の衛生と健康保護のための大学部門から得られました。

1.呼吸繊毛上皮のサンプリング

  1. サンプリングする前に、被験者が少なくとも4〜6週間感染がなく、鼻薬や吸入薬がないことを確認してください。
  2. 補充されたM199製剤を調製する:細胞培養培地199(M199)(500 mL)に抗生物質溶液(5 mLのストレプトマイシン/ペニシリン(50 μg/mL))および抗真菌溶液(5 mLのアムホテリシンB(2.5μg/mL))を補充します。
  3. 蓋付きの2本(各鼻孔に1本ずつ)の15 mLコニカルチューブを準備し、それぞれに3 mLの補充M199を入れます。
  4. 気管支細胞診ブラシ(厚さ:2 mm、長さ:11 mm)を準備します。ワイヤーの端を切断して、ブラシの長さが約15 cmになるようにします(図1A、B)。鼻ブラッシングを行うときにブラシを保持するには、ワイルブレイクスリー鼻鉗子を使用します(図1B)。
  5. 新型コロナウイルス感染症(COVID-19)への適応:COVID-19の状態が不明な生きた鼻上皮サンプルの処理を避け、毛様体ビデオ顕微鏡検査のための鼻ブラッシング....

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Results

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この技術の効率を説明するために、16人の健康な成人ボランティア(男性5人、年齢層22〜54歳)のシリーズでCFAの結果を紹介します。

合計16人のボランティアのうち14人(男性4人、年齢範囲24〜54歳)の鼻ブラッシングサンプルは、CFAを実行するために必要な選択基準を満たすのに十分な適切な上皮エッジを提供しました。これらの14の鼻ブラッシングサンプルから、合計242の繊毛エッジが記録され、212のエッジが定義された包含基準を満たし、分析されました。これらのエッジはすべて横向きのプロファイルに記録されました(観察者の上から繊毛が鼓動し、円形のCBPが観察されたかどうかを評価するために各ボランティアについて分析されました13が、これらのエッジはCFAには含まれていませんでした)。合計807のCBF測定値およびCBP評価が、分析された繊毛または繊毛群から得られた(表1)。各健常被験者についてのCFAの詳細な結果を 表1に示す。

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Discussion

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この論文は、鼻ブラッシングサンプルを使用したCFAの標準的な操作手順を提供することを目的としており、COVID-19パンデミック時の適切な感染管理の考慮事項に合わせて調整が行われます。PCD診断は困難であり、現在、鼻一酸化窒素測定、DHSVを使用したCFA、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用した毛様体超微細構造分析、免疫蛍光を使用した毛様体タンパク質の標識、PCD原因遺伝子の遺伝子検査など、国際勧告に従ってさまざまな診断テストのパネルが必要です4,37。現在、PCD 4,37のすべての患者を診断する単一の検査はありません。欧州呼吸器学会のガイドラインによると、PCD診断を確認できるのは、TEMによる特徴的な微細構造欠陥とPCDの原因となる遺伝子の双対立遺伝子変異のみです。残念ながら、これらのテストでは、偽陰性結果が15〜30%の割合です4,37,38,39。<.......

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Disclosures

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これらの著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

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ジャン・フランソワ・パポン、ブルーノ・ルイ、エステル・エスクディエ、そしてパリ東のPCD診断センターのすべてのチームメンバーが、PCD診断センターへの訪問中に彼らの可用性と心からの歓迎、および多数の交換に感謝します。また、ロバート・ハーストとレスターのPCDセンターのすべてのチームメンバーの歓迎と時間、アドバイス、専門知識に感謝します。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15mLコニカルチューブフィッシャーサイエンティフィック35209615ml 蓋付きハイクラリティポリプロピレンコニカルチューブ
アムホテリシンBLONZA17-836E抗真菌液
ブレイクスリーワイル鼻鉗子NOVO SURGICALE7739-12鼻ブラッシングを行うためのブラシを保持するために使用されます
気管支細胞診ブラシCONMED129鼻に使用ブラッシング
綿棒NUOVA APTACA2150/SGCOVID-19検査に使用
デジタル高速ビデオ顕微鏡カメラIDTeu 動きの革新CrashCam Mini 1510
ガラススライドThermoScientific12372098顕微鏡スライド 可視化チャンバーの作成に使用
加熱ボックスIBIDI細胞に焦点が合っている10918を加熱するために使用されます試料
倒立光学顕微鏡ツァイスAXIO Vert.A1
レンズヒーター東海 HITTPiE-LH油浸レンズの加熱に使用
メディウム 199 (M199)、HEPESテルモフィッシャー サイエンティフィック12340030細胞培養 メディウム
モーションスタジオ X64IDT Motionversion 2.14.01ソフトウェア
オイルフィッシャーサイエンティフィック、カール ツァイス
長方形カバースリップVWR631-0145可視化チャンバーのカバーに使用
スペーサー(Ispacer) 0.25 mmSunjinlabIS203密閉型クローズドビジュアライゼーションチャンバーの作成に使用
スクエアカバースリップVWR631-0122ラボビルトビルドのオープン可視化チャンバースト
レプトマイシン/ペニシリンの制作に使用FisherScientific、Gibco11548876抗生物剤ソリューション
11825153

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H.

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Ciliary VideomicroscopyDigital High Speed VideomicroscopyNasal Brushing SamplingCiliary Functional AnalysisCiliary Beat FrequencyCiliary Beat PatternPrimary Ciliary DyskinesiaInfection Control MeasuresEpithelial Ciliated StripsVideo Analysis Software

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