方法論記事

C. elegans興奮毒性壊死モデルにおける神経変性を調べるための生きた動物のイメージングと細胞選別法

DOI：

10.3791/61958

⸱

2021年1月22日

 ,  , 
1Cellular, Molecular, and Biomedical Science, CUNY School of Medicine, The City University of New York (CUNY), 2PhD Program in Biology, The CUNY Graduate Center, The City University of New York (CUNY)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.エレガンスの興奮毒性モデルでは、このプロトコルはin vivoイメージングを使用して、壊死性神経変性の調節、候補メディエーターをコードする遺伝子の影響、およびミトコンドリアの関与を分析します。細胞の解離と選別は、神経変性および神経保護メカニズムの細胞特異的トランスクリプトーム解析のために、リスクのあるニューロンを特異的に取得するために使用されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

興奮毒性壊死は、神経変性の主要な形態です。この調節壊死のプロセスは、神経伝達物質グルタミン酸のシナプス蓄積とそのシナプス後受容体の過剰な刺激によって引き起こされます。しかし、このタイプの神経変性の明確なニューロンの腫脹形態で最高潮に達するその後の分子イベントに関する情報は不足しています。特定の細胞内コンパートメントの変化や、異なるニューロンサブタイプの異なる細胞脆弱性の基礎など、他の側面については、まだ十分に調査されていません。さらに、in vitroまたはex vivo調製物を使用する研究で作用するさまざまな要因が、この形態の神経変性の自然な進行を修正および歪める可能性があります。したがって、線虫 Caenorhabditis elegansの遺伝的に適切で透明なモデルシステムにおけるニューロン壊死の程度を調節する介入の影響を監視することにより、生きた動物の興奮毒性壊死を研究することが重要です。このプロトコルは、 C. elegans ニューロンの興奮毒性壊死を研究する方法を、光学的、遺伝的、および分子分析と組み合わせて説明しています。 C.エレガンスに興奮毒性条件を誘発するために、グルタミン酸トランスポーター遺伝子(glt-3)のノックアウトとニューロン感作性の遺伝的背景(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)])を組み合わせて、グルタミン酸受容体の過剰刺激と神経変性を引き起こします。生きた動物におけるノマルスキー微分干渉コントラスト法(DIC)、蛍光顕微鏡、および共焦点顕微鏡法は、神経変性を定量化し、蛍光標識タンパク質の細胞内局在を追跡し、変性ニューロンのミトコンドリア形態を定量するために使用される方法です。Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) は、神経変性の細胞型特異的トランスクリプトーム解析のために、リスクのあるニューロンを明確にソーティングするために使用されます。ライブイメージングとFACS法の組み合わせ、 およびC.エレガンス モデル生物の利点により、研究者はこのシステムを活用して、大きなサンプルサイズで再現性のあるデータを取得できます。これらのアッセイから得られた知見は、神経変性疾患における治療介入の新たな標的となる可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

興奮毒性は、脳虚血におけるニューロン死の主な原因であり、複数の神経変性疾患の一因です 1,2,3,4,5,6,7,8,9。脳への酸素化された血流の混乱(例:.、血栓による)は、グルタミン酸トランスポーターの機能不全を引き起こし、シナプスにグルタミン酸が蓄積します。この過剰なグルタミン酸は、シナプス後グルタミン酸受容体(GluR)を過剰に活性化し、Ca2+のニューロンへの過剰な(触媒的、非化学量論的)流入につながります(図1A)。この有害な流入は、形態学的および機構的にアポトーシスから調節性壊死に至る進行性のシナプス後神経変性をもたらす10,11,12。それらは動物モデルでの成功した介入に基づいていたが、Ca2+の侵入をブロックし、細胞生存率を促進しようとしたGluR拮抗薬の複数の臨床試験は、臨床現場で失敗している13,14,15,16。これらの失敗の重大な原因である可能性が高いのは、(動物モデルとは対照的に)臨床現場での治療が脳卒中発症の数時間後に投与され、介入が遅効性の神経保護メカニズムをブロックし、GluRsの下流の変性シグナル伝達を中断できないという事実です14,16,17.血栓溶解療法に基づく別のアプローチは、厳しく制限された時間枠内でのみ投与できるため、多くの患者(発症時期が特定できない自宅で脳卒中を患っている)は、血栓溶解療法の恩恵を受けることができません17。これらの挫折は、GluR過剰刺激後に発生する事象の研究に興奮毒性研究を集中させ、その後の変性カスケードを同時の神経保護プロセスと区別する必要性を強調しています。このアプローチは、細胞の損傷を防ぎ、損傷発症後に投与できる効率的な薬物標的を特定するのに役立ちます。

興奮毒性のその後の事象を特定するための1つのアプローチは、ミトコンドリアの崩壊につながるものなど、GluR過剰刺激の下流の細胞死シグナル伝達メカニズムを研究することです。ミトコンドリアの生理学とダイナミクスの劇的な機能不全は、興奮毒性18,19,20に見られるように、神経変性の特徴です。すべての細胞は、生存、活動、および細胞の維持のためにミトコンドリアの機能と利用可能性に依存していますが、ニューロンは特にシグナルの伝達と伝播をサポートするためにミトコンドリアのエネルギー産生に依存しています。具体的には、ニューロンは、酸素とグルコースに高い依存度で、シナプス後受容体/チャネル21の活性化後に静止膜電位を回復するために、シグナル伝達関連のエネルギー消費の~50%を費やします。脳卒中で観察されるグルコースと酸素の利用可能性の低下は、深刻なミトコンドリアの変化を引き起こし、ATP産生のさらなる減少を引き起こします19,22,23,24。しかし、ミトコンドリアの崩壊につながる一連の事象を特定するための研究では、物議を醸す結果が得られ、コンセンサスが得られませんでした。ミトコンドリアの形態を分析することは、ニューロンの健康25,26,27,28,29の良い指標であるため、ミトコンドリアの病理につながるこれらのイベントを理解するのに役立ちます。糸状ミトコンドリアは健康なニューロンの代表ですが、断片化されたミトコンドリアは細胞死につながる可能性のある大きなニューロン損傷を示します。生きた動物のミトコンドリア形態を異なる遺伝的条件下で解析することで、興奮毒性におけるミトコンドリア依存性神経変性に関与する特定の遺伝子や経路に焦点を当てることができます。

興奮毒性神経変性の程度を調節する可能性のあるその後の事象を特定するための別のアプローチは、興奮毒性の影響の一部を軽減する転写神経保護メカニズムを研究することである14,16。しかし、主要な神経保護転写因子の特異性の欠如と実験設定の分岐は、主要な神経保護プログラム(特に調節された壊死)を明確に特定する努力の成功を妨げています。

したがって、下流の死シグナル伝達経路の研究と興奮毒性における転写神経保護の研究の両方が、観察された結果について大きな困難と不一致に直面しました。この論争の多くは、興奮毒性のex vivoまたはin vitroモデルの使用、および異なる実験設定の特異性によってもたらされる変動性から生じる可能性があります。したがって、高度に保存されたコアメカニズムの特定に焦点を当て、それらをin vivoで研究することは非常に有益です。線虫C.エレガンスの単純なモデルシステムは、特に強力で多様な研究ツールの強力な組み合わせ、コア細胞死経路の保存、およびその神経系の構造と接続性に関する豊富な情報により、特に効果的なオプションを提供します30,31,32,33.実際、機械感覚ニューロンにおける壊死性神経変性の遺伝子解析に関するDriscoll研究室の独創的な研究は、このアプローチの力の優れた実証である34。興奮毒性の解析にとって重要なことは、線虫におけるシグナル伝達経路の保存には、グルタミン酸作動性神経伝達のすべての主要成分が含まれていることである35,36。

線虫興奮毒性モデルは、これらの独創的な研究に基づいており、研究者は、脳卒中やグルタミン酸依存性神経毒性の影響を受ける他の神経変性疾患で発生するものと同様の生化学的プロセスを研究することができます。C.エレガンスに興奮毒性条件を誘導するために、この実験的アプローチは、グルタミン酸トランスポーター遺伝子(glt-3)のノックアウトとニューロン感作性の遺伝的背景(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)])の組み合わせである興奮毒性株を使用して、GluR過剰刺激と神経変性を引き起こします37。この興奮毒性株は、興奮毒性神経変性に対するグルタミン酸作動性へのシナプス後結合である30の特異的(glr-1発現)ニューロンを露出させます。これらのリスクのある30のニューロンのうち、個々のニューロンは、動物が発達を通じて進行するにつれて壊死を経験します(混合確率性と特定の特定のニューロンへの部分的な選好38)一方で、同時に細胞の死体も徐々に除去されています。このアプローチは、多くの変異株のアクセス可能性と組み合わせることで、神経変性および神経保護に影響を与える複数の経路の研究を可能にする。これらのアプローチは、興奮毒性における興奮毒性神経変性の下流の死シグナル伝達カスケード39および転写調節因子の一部を分析するためにすでに使用されています38,40。線虫41における壊死性神経変性の他の症例と同様に、線虫の興奮毒性神経変性は、古典的なアポトーシスを伴わない40。

この手法論文では、 C.エレガンス における興奮毒性壊死性神経変性を誘導、定量化、および操作するための基本的なシステムについて説明します。さらに、線虫の興奮毒性の特定の側面の研究を合理化するために現在使用されている2つの主要なプロトコルを概説しています。蛍光レポーターを使用し、生体内イメージングを行うことで、研究者は興奮毒性神経変性の線虫モデルにおけるミトコンドリアの関与とダイナミクスを研究することができます。特定の神経保護転写因子の効果を判断するために、研究者は、蛍光マーカーの細胞型特異的発現、動物の単一細胞への解離、および FACS を使用して、興奮毒性から壊死のリスクがある特定のニューロンを分離できます。これらの細胞型特異的に単離されたニューロンは、主要な転写因子に変異を持つ株のRNAシーケンシングに使用できます。これらの方法を組み合わせることで、研究者は興奮毒性神経変性とin vivoでの神経保護の分子基盤を非常に明確かつ正確に引き出すことができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 興奮毒性神経変性および神経保護の研究に使用される株

  1. 線虫興奮毒性株ZB1102を標準的な興奮毒性神経変性の基準点として使用します。
    注: C.エレガンス におけるグルタミン酸依存性興奮毒性は、グルタミン酸トランスポーターのノックアウト(ko) と、これらの動物のニューロンを神経毒性に対して感作し、グルタミン酸作動性結合37に続くニューロンのサブセットで発現する導入遺伝子との組み合わせによって、ZB1102株で産生される。この遺伝子の組み合わせは、線虫興奮毒性株と呼ばれ、 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から無料で入手できます。
  2. 興奮毒性壊死の候補調節因子をコードする遺伝子の影響を研究するには、そのような遺伝子の突然変異(例: dapk-1、または crh-1)を線虫興奮毒性株と組み合わせます。
  3. wormbook.org42,43に概説されているように、標準的なC.エレガンス法30に従って遺伝的交配を実施します。
  4. 通常、突然変異の分子基盤が文書化されているため、PCRを使用して特定の遺伝子座をジェノタイピングすることにより、交差子孫を追跡します。WTと変異体をフラグメントサイズ(欠失の場合)またはシーケンシング(点突然変異の場合)で区別します。
    注: 表1 は、特にこのプロトコルについて、神経変性および神経保護の異なる経路を研究するために使用された株を概説しています。
  5. すべての重要な株を2つの独立した系統で導き出し、それらを別々にテストして、観察された表現型の妥当性を確認します。

2.成長培地と畜産

  1. 標準的な方法に従って、OP50 E.coliを播種した標準的なNGMプレート30,37,42またはMYOBプレート38,44のいずれかで、16〜25°Cでワームを増殖させます。
    注:MYOBプレートはNGMプレートと同じ結果をもたらしますが、調製がわずかに簡単です。
  2. 実験株を一貫して十分に供給するように維持します。
    注:飢餓は神経変性に影響を及ぼし、死にかけている頭部ニューロンの数を減らすことができます。ワームの栄養が不十分または飢えている場合は、新しいプレートに盛り付け、数世代待ってから実験を続けます。飢餓の世代を超えた影響は、数世代後には衰えるでしょう。

3. ノマルスキー微分干渉コントラスト(DIC)とスコアリングによる頭部神経細胞の変性定量化

  1. 線虫興奮毒性株(ZB1102: glt-3(bz34)IV;nuIs5 V)を定量化の実験的コントロールとして使用し、正常な興奮毒性レベルを表します。このプロトコルは、同じ動物が異なる発達段階を経るわけではありません。代わりに、混合段階の動物集団のスナップショットを提供し、合計でさまざまな動物から情報を収集して、すべての発達段階を表します。
    注: nuls5 導入遺伝子[Pglr-1::GαS(Q227L)]。Pglr-1::GFP]45 (シナプス後からグルタミン酸作動性への結合に活性化されたGαsとGFPを発現する)は、バックグラウンドのGluR非依存性壊死性神経変性レベルを~1 ~1 Dying頭部ニューロン/動物(発生中の任意の時点で)生成します。 glt-3(ko)の添加は、 シナプス後 nuIs5発現ニューロンの壊死性神経変性をGluR依存的に増加させ、第3幼虫期(L3)で4〜5個の死にかけている頭部ニューロン/動物まで増加する37。
  2. 試験株には、最近完成した遺伝的交配株の動物を使用するか、新鮮な交配株から調製した-80°C凍結ストックから目的の株を解凍します。表現型と神経変性を採点する前に、数世代(≥4)待ちます。
  3. 十分に給餌された動物の混合段階の集団のプレートから寒天の小片を切り取って取り出し、寒天チャンクを裏返してカバーガラスに取り付けます。
    注:動物はまだ動くことができますが、今ではやや拘束されており、麻酔薬なしで観察することができます。このようなチャンクは、新しいチャンクと交換する前に ~1 時間使用できます。
  4. x10 接眼レンズと x40 または x63 対物レンズを備えた倒立 DIC スコープを使用して、カバースリップを手動でスライドさせて動物をランダムにスキャンします。以下で説明する他のイメージングステップは、倒立顕微鏡または直立顕微鏡のいずれかで行うことができますが、寒天チャンク内の線虫の検査には倒立スコープが必要です。
  5. 各動物の発達段階は、子宮の形状によって識別されます(wormbook.org の子宮図を参照)。
  6. 各動物について、その発生段階と死にかけている(つまり、空胞化した)ニューロンの数を記録します。頭の中で死にかけているニューロンの総数、小胞後神経節で死にかけているニューロンの数(特定の細胞を簡単に識別できる)、尾部で死にかけているニューロンの数(グルタミン酸の影響を受けず、内部制御として機能し、感作性導入遺伝子 nuIs5 が完全に活性化していることを確認)を数え、記録します。
  7. このデータを、特定の系統の動物を発生段階のカテゴリごとにグループ化したテーブルに記録します。
  8. 各セッションで、いくつかの発達段階のワームからランダムにデータを収集します。統計分析に十分なデータを収集するために、数日間にわたって複数のスコアリングセッションを実行します。複数の段階で神経変性レベルを記録し、 図1Cのような棒グラフを作成します。
    注:この方法では、特定の治療または突然変異がすべての段階で神経変性レベルを上げたり下げたりする(分布を上下にシフトする)か、神経変性のピークを前または後の発達段階にシフトする(分布を左右にシフトする)かを判断できます。
  9. 遺伝子型の同一性を知らされていない状態でデータ収集を行います。遺伝系統の2つの独立した分離株で確認し(分離株間の他の/予期しない遺伝的違いの意図しない影響の危険性を最小限に抑えるため)、分析のためにデータをプールします。
  10. 各系統で、各発生段階における頭部(小胞後神経節を含む)の変性ニューロンの数の平均とSEMを計算します(図1D)。必要に応じて、死にかけている後膀胱神経節のみおよび尾ニューロンについても同様の分析を行います。

4. 特異的変性頭部神経細胞の同定

  1. 個々の(または小グループの)動物を寒天パッド46に取り付け、テトラミソールでワームを麻痺させる(下記のセクション5を参照)。
  2. 蛍光とDICスコープ(直立または倒立)を組み合わせることで、特定の空胞化したニューロンを特定します。
  3. 液胞化したニューロンの特定のニューロン同一性を決定するには、そのGFP標識プロセスを追跡し、細胞体の位置とプロセスの形状を、WormAtlas47を使用してglr-1を発現することが知られているニューロンのものと比較します。
    注:あるいは、同定は、ホバート研究室48から間もなく登場するマルチカラーラベリングによってニューロンを迅速に識別する新しい方法によって支援することができる。

5. レポーター株の蛍光顕微鏡による神経細胞ミトコンドリア形態のライブイメージング

  1. シナプス後ニューロンのミトコンドリア変化のイメージングのために(元の興奮毒性株の細胞質GFPで標識されている)mito-mCherry蛍光を調べてください。
  2. 試験の興奮毒性株と、シナプス後ニューロンのミトコンドリアを赤色蛍光で標識する株を交配する(蛍光タンパク質とTOM-20のN末端との間の融合を glr-1 プロモーターの下で発現させることによる;コンストラクトと株の詳細については、49を参照)。動物は、通常の落射蛍光顕微鏡(直立または倒立)または共焦点顕微鏡を使用して画像化できるようになりました。
  3. ニューロンの生存に影響を与えずに線虫を麻痺させるには、新たに調製したアガロースパッドに5 μLの10 mMテトラミソールをピペットで移します。パッド調製に関する詳細なプロトコルについては、Arnold et al.46 を参照してください。
  4. テトラミソールドロップの中央に動物を置き、カバースリップで取り付けます。
  5. カバースリップの側面をマニキュアで密封し、マニキュアを乾かします。
  6. テトラミソール処理から20分以内に、DICおよび蛍光イメージングを備えたスコープを使用して、20倍の対物レンズを使用して線虫を特定します。
  7. 線虫の頭部(または目的のニューロン)が見つかったら、100倍の油対物レンズに移動し、体細胞内のミトコンドリアの蛍光標識に焦点を当てます。
  8. DIC、GFP、およびTxRedフィルター設定を使用してZスタック画像をキャプチャします。

6. ニューロンミトコンドリアの形態学のスコアリングと定量化

  1. ミトコンドリアの形態は、線虫のライブイメージング中、またはImageJまたは他のイメージングソフトウェアを使用した画像取得後に解析します。
  2. 特定のニューロンの同定と繰り返しの解析を容易にするために、小胞後神経節の3つのニューロン、RIGL/RおよびAVGを同定します(場合によっては、細胞死体が興奮毒性でクリアランスされているため、2つしか存在しません)。
  3. ミトコンドリアを糸状、中間、断片化の3つの主要なグループに分類します50,51,52。
    注:糸状ミトコンドリアは、ニューロンの体細胞に連続した薄い構造として現れ、通常は核を取り囲んでいます。中間ミトコンドリアは、少なくとも1つの見かけの糸状ネットワークの組み合わせとして現れますが、破断はあり、体細胞にいくらかの断片化があります。断片化されたミトコンドリアは、ミトコンドリアネットワークに完全な切れ目を示し、外観が膨らみ、体細胞全体に散在しています(図2A)。
  4. 線虫ごとに、糸状、中間、または断片化されたミトコンドリアを持つニューロンの割合を、合計で少なくとも 30 匹の線虫にスコアを付けます。
  5. 一元配置ANOVAとそれに続く、株53間の各ミトコンドリア形態に対する事後テューキーの検定を使用して統計分析を実行する。

7. 神経変性のリスクがあるニューロンのFACSに対する線虫解離のためのバッファーおよび試薬調製

  1. M9緩衝液を以下のように調製する:3gのKH2PO4、6gのNa2HPO4、5gのNaCl、H2O〜1L。フィルター滅菌した1 M MgSO4 1 mLを1 mL加えます。室温で保存してください。
  2. 以下のように卵緩衝液を調製する:118 mM NaCl、48 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2 ;滅菌するためのオートクレーブ。2 M の HEPES pH 7.3 ストック溶液 (0.2 μm ボトルトップフィルターでろ過済み) を 2 M 加え、最終濃度 25 mM にします。1 N NaOH(10 mL以下)でpHを7.3に調整します。浸透圧計を使用して、最終的な浸透圧が335〜345 mOsmであることを確認します。フィルター 卵バッファーを0.2μmボトルトップフィルターで滅菌します。4°Cで保存します。
    注:MgCl2 ・6H2OおよびCaCl2・2H2Oを使用してそれぞれのMgCl2 およびCaCl2 ストック溶液を調製すると、塩は溶解しやすくなります。また、10倍の卵バッファーのストックを作成し、必要に応じて滅菌脱イオン水で希釈することもできます。
  3. 次のようにSDS-DTTを調製します:20 mM HEPES pH 8.0、0.25%SDS、200 mM DTT、3%スクロース。組織培養フードで、0.2 μmシリンジフィルターでSDS-DTTを滅菌します。300 μLのアリコートを-20°Cで保存し、ホイルで覆って光から保護します。
  4. 次のようにプロナーゼ溶液を調製します:卵緩衝液中の15 mg / mLプロナーゼの解離日を準備します。.氷の上に保存します。

8. ニューロン特異的FACSの年齢同期

  1. 興奮毒性遺伝子型(および必要に応じて他の突然変異)と、選別に容易に使用できる強力な蛍光マーカーのトランスジェニック発現を組み合わせた動物を使用してください(例:FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54。20°Cの2つまたは3つの100mm NGM/MYOBプレートで、プレートが主に妊娠した虫でいっぱいになるまで動物を育てます。
  2. M9バッファーを使用してプレートからワームを洗い流します。ガラス製の10 mL血清ピペットを使用して、線虫を50 mLの円錐管に移します。
  3. 室温で2.5分間、250x g で遠心分離し、上清を除去します。
  4. ワームペレットを10 mLの漂白剤溶液(滅菌脱イオン水中の2%10 N NaOHおよび5%新鮮な家庭用漂白剤)に再懸濁します。
  5. チューブをシェーカーに水平に置き、低速で揺らします。ワームがチューブの底に落ち着かないようにしてください。漂白剤はワームのキューティクルを割って開きますが、卵殻によって保護されている胚には影響しません。
    1. この漂白ステップには約5分かかりますが、これは異なります。過白化が発生しないようにするには、毎分サンプルを取り出してプロセスを監視します:ガラス顕微鏡スライド上の各チューブから10μLを静かにピペットで動かし、解剖顕微鏡を使用してワームを検査します。
  6. 妊娠したワームのほとんどが割れて開いたが、完全には溶解していないら、円錐形のチューブに卵の緩衝液を充填して漂白ステップを停止します。
  7. 卵子/胚を回収するには、チューブを250x g で2.5分間遠心分離し、上清を取り除き、卵バッファーで再度洗浄します。
  8. さらに4回の洗浄を繰り返します。
  9. ペレットを静かにピペッティングして卵を再懸濁し、4つの100 mm播種NGM/MYOBプレートに広げます。胚を孵化させ、20°Cで3日間成長させます。
    注:プレートは、主に重力のあるワームでいっぱいになっているはずです。
  10. この漂白剤/年齢同期プロトコルを繰り返して、年齢同期を繰り返します。
  11. 卵を8枚の100 mm NGM/MYOBプレートにピペットで移します。動物を孵化させ、目的の幼虫の段階になるまで20°Cで成長させます。

9. FACSの全線虫細胞解離

  1. 同期したワームを目的の発達段階まで成長させます。100 mmプレートをM9バッファーとガラス血清ピペットで穏やかに洗い流し、50 mLコニカルチューブに移します。
  2. 冷たいM9を最大45mL加えます。チューブを氷の上に30分間置き、ワームが重力によって底に沈殿するのを待ちますが、プレートからの残留細菌の破片は上清に浮かびます。
  3. 上清を取り除き、新しいM9でワームを洗います。
  4. 氷の上に重力沈殿を30分間繰り返します。
  5. 上清を取り除き、M9を最大45mLまで加え、250 x g で5分間遠心分離します。
  6. ペレットを微量遠心チューブに移し、M9を最大1mL加えます。
  7. 卓上遠心分離機で14,000rpmで1分間回転し、上清を除去します。
  8. キューティクルを破壊するには、ペレットの(約)2倍の容量を使用して、ワームペレットをSDS-DTTで再懸濁し、室温で4分間ロッキングしながらL2-成体ステージでインキュベートします。
    注:SDS-DTT処理が長くなると蛍光タンパク質シグナルが急激に減少するため、SDS-DTTでのインキュベーションは4分を超えないようにしてください。SDS-DTTは光に敏感であるため、溶液が時間の経過とともに効力を失う可能性があるため、3か月以上経過してはなりません。解離は、最近調製したSDS-DTTソリューションで最適に機能します。
  9. 1x 卵バッファー (pH 7.3, 335-345 mOsm) を 1 mL まで加えて、SDS-DTT 処理を中止します。
  10. 卓上遠心分離機で14,000rpmで1分間回転し、上清を除去します。
  11. キューティクルをさらに破壊し、動物の細胞を解離するには、ペレットの3倍の容量を使用して、ペレットを室温のプロナーゼ溶液に再懸濁します。
  12. 室温で15〜30分間インキュベートします。
  13. P-200またはP-1000ピペットで5分ごとに40回ピペットを上下させ、チューブの底にピペットチップを当てます。
    注意: 先端がチューブの底に触れることによって生じる圧力は、ワームの解離を促進します。高速ピペッティング中にワームが誤ってピペットシャフトに入らないように、フィルターチップを使用してください。
  14. 15分後、スライドガラス上で5μLを静かにピペッティングし、解剖顕微鏡で進行を観察して、線虫の解離の進行状況を確認します。無傷のワームのほとんど (~90%) がバーストすると、プロセスは完了です。
    注:プロナーゼインキュベーションは、多くの線虫が無傷のままである場合に延長できます。
  15. 細胞培養フードに、1x 卵バッファーを最大1.5 mLまで加えて、プロナーゼ処理を停止します。
  16. FACSチューブに移し、5mLの卵緩衝液を加え、800 x g で5分間遠心します。
  17. 上清を取り除き、3 mL pf 卵バッファーに再懸濁します。
  18. 新しいFACSチューブに70μmのセルストレーナーキャップを装着し、ストレーナー上に細胞懸濁液をピペットで移動させ、800× g で1分間遠心します。排出細胞懸濁液を回収します。
  19. 新しいFACSチューブに5μmのセルストレーナーキャップを装着し、ストレーナー上に細胞懸濁液をピペットで移動させ、800 x g で1分間遠心します。
  20. 卵緩衝液に最終濃度0.5 μg/mLのDAPIを添加し、光から保護するために蓋/カバーを付けて氷の上に置きます。
  21. できるだけ早くFACSを実行してください。蛍光タンパク質のシグナルは、時間や光のばく露とともに減少するため、できるだけ早く解離プロトコルを行い、解離が完了した直後にFACSを実施することが重要です。
    注:ワーム解離プロトコルは、Millerラボ55,56,57、Murphyラボ58、およびShahamラボ59からのプロトコルから適応されました。

10. C. elegans ニューロンの同定のためのFACS機械操作の改良

  1. C. elegansニューロンを選別する際には、標準的なシース液の代わりに4リットルの冷やした(4°C)卵緩衝液を使用してください。
    注: C.エレガンス 細胞の浸透圧は哺乳類細胞よりもはるかに高く、標準的なシース液はニューロンを破裂させます。卵液の粘度は標準的なシース液の粘度とは異なるため、すべての機械の設定と校正は、卵液を添加した後に行われます。選別技術者は、レーザーが正しく機能していることを確認するために、診断ビーズを機械に通します。
  2. 選別したニューロンをその後のトランスクリプトミクス研究で使用する場合は、最低100,000個のGFP+細胞を直接800μLのTrizol-LS+10μLのRNase阻害剤に選別します。
  3. Trizolのセルを15回反転させて混合します。
  4. ドライアイス/エタノール浴で急速冷凍し、1回のRNAシーケンシング実験のためにすべてのサンプルからRNAを抽出する準備ができるまで-80°Cで保存します。
    注:ほとんどのソーティングされた細胞はトランスクリプトーム分析のためにTrizolに直接収集されますが、ソーティングの効率を顕微鏡で検証するために、卵バッファーに収集されたGFP+ソーティングされた細胞(各株から)の小さなサンプルを必ず取得してください。

11.FACSゲーティング戦略

  1. GFPの正の信号を識別するには、488 nmレーザーと530/30フィルター、502ロングパス(LP)を使用します。
  2. DAPIの陽性細胞と陰性細胞を同定するには、405 nmレーザーと450/50フィルターを使用します。
  3. GFP陽性細胞と間違われる可能性のある自己蛍光細胞を同定するには、610/20フィルターと595 LPを備えた488 nmレーザーを使用します(私信、ロックフェラー大学フローサイトメトリーリソースセンター、オペレーションマネージャー、Stanka Semova氏)。
  4. 標準的なゲーティング戦略を実行し、セルやデブリの塊を表す可能性が高い大きな側方散乱領域(SSC-A)と小さな前方散乱領域(FSC-A)を持つイベントを削除します。
  5. 序文のスキャッターシングレットを分離し、次にサイドスキャッターシングレットを分離します。
  6. GFPシグナルが高く、自家蛍光シグナルが低い細胞を単離します。
    注:自家蛍光性が高く、GFPが少ない細胞は、真のGFP陽性細胞ではありません。
  7. GFP+ゲートの閾値は、GFP-細胞(すなわちN2)をGFP+細胞55,56と比較することによって決定される。
  8. 生/死死ゲートのある死細胞を、DAPIの死細胞への選択的透過性に基づいて除去します:生死ゲートの閾値は、未染色細胞とDAPI染色細胞を比較することによって決定されます。
    注:複数のサンプルを選別する場合は、サンプル間のストリームをフラッシュして、クロスコンタミネーションがないことを確認してください。

12. FACSゲーティング戦略の効率を検証するための選別されたニューロンの顕微鏡検査

  1. ガラスの顕微鏡スライドに撥液ペンで円を描きます。
  2. 選別された細胞の懸濁液10 μLを円の内側の卵緩衝液にピペットで移します。サンプルの上にカバースリップを置き、カバースリップの周囲にマニキュアで密封します。
  3. マニキュアが乾いたら、直立/倒立蛍光顕微鏡で、選別された細胞が実際に主にGFP +細胞であることを確認してください。
    注:各ソートセッションの後にこのチェックを実行して、FACSゲーティング戦略57を検証する。

13. 品質管理自動電気泳動システムによるRNA抽出とRNA品質定量

注:すべてのRNA作業は、RNaseによる汚染を避けるために細心の注意を払って実行する必要があります(試薬、消耗品の慎重な調製、およびRNaseに安全なベストプラクティスを含む)。

注:サンプルがドラフト内にフェノールおよび/またはクロロホルムを含んでいるすべての手順を実行します。

  1. 細胞のバイアルをTrizolで室温で解凍します。
  2. フィルターチップP200ピペットチップを使用して、数回ピペットを上下に動かし、サンプルを均質化します。
  3. 室温で5分間インキュベートします。
  4. 溶解に使用するTrizol試薬1 mLあたり0.2 mLのクロロホルムを加え、チューブにしっかりとキャップをします。
  5. チューブを15回反転させ、20〜25°Cで2〜3分間インキュベートします。
  6. サンプルを 12,000 × g で 15 分間、4 °C で遠心分離します。 混合物は、下部赤色フェノール-クロロホルム、中間相、および無色の上部水相に分離します。
  7. RNAを含む上部水相のみを回収し、新しい低DNA/RNA結合1.5 mLチューブに移します。
    注:場合によっては、セルソーターからトリゾールにドロップアウトした卵バッファー内の細胞の比率が1:3サンプル:トリゾール-LS比より大きい場合、卵バッファーの塩分含有量が高いと層が反転する可能性があります。これが発生した場合は、Trizol-LSをさらに追加し、反転と遠心分離を繰り返します。.これは、選別後のサンプル量の増加に注意することでも回避できます。1:3の比率が維持されない場合は、RNA抽出を開始する前に十分なトリゾールを追加してください。
  8. RNAをさらに精製するには、RNA抽出カラムケミストリーを使用します。
  9. 品質管理自動電気泳動システムを使用して、RNA完全性数(RIN)を測定し、その後のRNAシーケンシング実験にインプットするためのRNA RINが8.0以上であることを確認します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

興奮毒性の線虫モデルと空胞化変性ニューロンの同定
ここに示されているデータは、以前の出版物37,38から複製されています。興奮毒性誘発性神経変性を模倣するために、グルタミン酸トランスポーター遺伝子ノックアウト(glt-3)をニューロン感作性トランスジェニックバックグラウンド(nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L);Pglr-1::GFP)])。トランスジェニックコンストラクトは、GLutamate Receptor 1(GLR-1、AMPA受容体の重要なサブユニット)を発現するニューロンで発現し、これらの同じニューロンで発現するGFP蛍光を介して追跡されます。DICを用いてニューロンの変性が観察され、液胞が腫脹して現れます(図1B)。死にかけている頭部ニューロンの数は、nuIs5

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一般的な論争や失敗は、興奮毒性が解読が非常に難しいプロセスを提示することを示唆していますが、線虫の興奮毒性の分析は、この重要な形態の神経変性において保存されたニューロン細胞死経路を明らかにするための特に魅力的な戦略を提供します。研究者は、このシステムで利用可能な豊富な研究ツールのコレクション、特に動物の透明性(in vivo分析が可能)と生存可能な変異体の大規模なレパートリー(CGCから無料で入手できる、またはEMS突然変異誘発やCRISPRなどの技術によって社内で調製)に頼ることができます。さらに、研究の進歩は、線虫神経系でよく説明された役割を媒介することが知られている特定のニューロンの同定が比較的容易であることから恩恵を受けています。実際、特定のニューロンの変性を同定し定量化し、ミトコンドリア損傷やトランスクリプトミクスの解析に対象とすることができるようになった38 。これにより、特定の脆弱性や耐性を付与する細胞タイプ特異的なプロセスを特定することができます。

<...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真野研究室と李研究室(現在および最近)のすべてのメンバーの助けとサポートに感謝します。線虫の壊死性神経変性の解析を開拓し、継続的な支援を提供してくださったMonica Driscoll博士(ラトガース大学)に感謝します。クリス・リー博士(CCNY)のサポートとアドバイス。Jeffery Walker (CCNY Flow Cytometry Core facility)、Dr. Bao Voung (CCNY)、Stanka Semova (Rockefeller Univ. Sorting Faculty Core) は、細胞ソーティングに関する実践的なサポートとアドバイスを提供してくれました。Dr. Chris Rongo (Rutgers Univ.) 試薬;David Miller博士(ヴァンダービルト大学)、Coleen Murphy博士(プリンストン大学)、Shai Shaham博士、Menachem Katz博士、Katherine Varandas博士(3人ともロックフェラー大学出身)は、C.エレガンス解離プロトコルについて。

真野研究室は、NIH NINDS(NS096687、NS098350、NS116028)からIMへの資金提供を受け、NIH U54 CCNY-MSKCCパートナーシップ(CA132378/CA137788)を通じて資金提供を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天VWRAAA10752-0E
バクトペプトンVWR90000-264
BD FACSAriaIII BD
漂白剤任意の家庭用
CaCl2VWR97062-586
CaCl2·2H2O BioExpress0556-500G
セルストレーナー、PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
セルストレーナー、PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
遠心分離機 - 15-50 mL ソルバルベンチトップ LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Centrifuge - マイクロフュージ ;Ependorff 5424VWRMP022629891
ChloroformVWR97064-680
コレステロールΣC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
ドライアイスユナイテッド シティ アイス キューブ
DTTVWR97061-340
大腸菌 OP50CGCOP50
エタノール(100%)VWREM-EX0276-1S
エタノール(90%)VWRBDH1160-4LP
FACSチューブUSASci1450-2810
フィルターのヒント USA Sci1126-7810
ガラス製 10 mL 血清ピペット USA Sci1071-0810
加熱ブロック バイオエクスプレスD-2250
ヘペス VWR97061-824
液浸油 - カールツァイスImmersolFisherSci 12-624-66A
イソプロパノールVWREM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2PO4VWRBDH9268-2.5KG
低結合1.5mLチューブUSASci4043-1021
メタモルフイメージングソフトウェア分子デバイス
MgCl2VWR97063-152
MgCl2·6H2OBioExpress0288-500g
MgSO4VWR97061-438 
顕微鏡、共焦点、蛍光イメージング用ZeissLSM 880
、倒立型、蛍光イメージング用ZeissAxiovert 200 M
顕微鏡 カメラQ-ImagingRetiga R1
顕微鏡 蛍光イメージング用光源LumencorSOLA SE Light Engine
顕微鏡、Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
顕微鏡、Nomarski DICNikon Eclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
ペトリ皿、100mmFisher SciFB0875712
ペトリ皿、60mmTriTechT3308
ピペット コントローラーTEquipmentP2002
ピペット P10 ヒントUSA Sci1110-3000
ピペット P1000 ヒントUSA Sci1111-2020
ペットP200のヒントUSA Sci1110-1000
プロナーゼシグマP8811-1G
RNAseアウェイスプレーFisher Sci7000TS1
RNAseフリー血清ピペットUSA Sci1071-0810
RNAseフリー50mLチューブUSA Sci5622-7261
RNeasy microQiagen74004
SDSVWR97064-496
ストレプトマイシン硫酸塩Σ S6501-100G
ショ糖VWRAAJ63662-AP
SUPERase·RNase阻害剤Fisher SciAM2694
品質管理自動電気泳動システム:テーパステーション-高感度RNAスクリーンテープ アジレント5067-5579 
Tapestation - 高感度 RNA ScreenTape Ladder アジレント5067-5581 
Tapestation - 高感度RNA ScreenTapeサンプルバッファー Agilent5067-5580
Tapestation - IKA MS3 vortexerAgilent/IKA4674100
Tapestation - 2000 rpmのIKAボルテクサーアダプター Agilent/IKA3428000
Tapestation - ローディングのヒント Agilent5067-5152または5067-5153
Tapestation - 光学キャップ 8x ストリップAgilent401425
Tapestation - 光学チューブ 8x ストリップAgilent401428
品質管理 自動電気泳動システム: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisoleSigmaL9756-10G
TrisベースFisher SciBP152-500
Tris 塩酸塩Fisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 蒸気圧浸透圧計Fisher SciNC0044806
Wheaton Unispense μP
顕微鏡ピディスペンサーVWR25485-003

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523(2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1(1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Brockie, P. J., Maricq, A. V. Ionotropic glutamate receptors: genetics, behavior and electrophysiology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  36. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  37. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  38. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  39. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25(2015).
  40. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060(2014).
  41. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  42. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  43. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  44. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  45. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  46. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368(2020).
  47. Altun, Z. F., Herndon, L. A., Crocker, C., Lints, R., Hall, D. H. WormAtlas. , Available from: www.wormatlas.org (2019).
  48. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  49. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).
  50. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  51. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  52. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  53. Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  54. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180(2016).
  55. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  56. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42(2005).
  57. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  58. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  59. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882(2019).
  60. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  61. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  62. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  63. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  64. Zhang, S., Kuhn, J. R. Cell isolation and culture. WormBook. , Available from: www.wormbook.org 1-39 (2013).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

FACS
動画は近日公開

関連記事