方法論記事

ウーパールーパーおよび心エコー検査におけるクライオ損傷誘発性心臓再生と再生進行を評価するための偏りのない定量的組織学

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DOI:

10.3791/61966

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2021年5月10日

 , 
1Department of Clinical Medicine (Comparative Medicine Lab), Aarhus University

この記事について

サマリー

ここでは、ウーパールーパーの心室心筋に凍結損傷を誘発するための手術プロトコルを紹介します。さらに、再生過程中の梗塞画分を心エコー検査で非侵襲的に推定するプロトコルと、切除された心臓の梗塞分率を正確に測定するプロトコルを不公平な定量的組織学で提示します。

要約

ウロデール両生類、サンショウウオ、イモリは、心室切除後に完全な心筋再生を行うことができる哺乳類に最も近い系統群を表しています。切除モデルは、心臓修復に関与するプロセスに関する基本的な知識を生み出しました。しかし、このモデルは、組織の損傷、アポトーシス、壊死、線維症、および肥大がすべて虚血誘発性心筋梗塞の主要な有害な結果である臨床状況とはあまり関連していません。一方、凍結傷害誘発性心筋梗塞は、虚血誘発性心筋梗塞により類似しています。ここでは、四肢動物モデルで心臓修復の基本的なメカニズムを調査するためのツールを提供するウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)の凍結損傷手順について詳しく説明します。また、心エコー検査によりin vivoで梗塞の大きさを非侵襲的に推定する定量的手法や、ex vivoで偏りのない定量的組織型を用いて梗塞の大きさを正確に測定する定量的手法を提供しています。

概要

虚血性心疾患は、世界中で死亡の主な原因です1,2。虚血誘発性心筋梗塞は、心筋細胞の広範な細胞死をもたらします3。迅速な医学的介入は即時死亡のリスクを減らすことができますが、その後のヒトが従来の哺乳類モデル動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタなど)と共有する線維化反応は、最終的に心肥大、不整脈、および心不全につながる可能性のある瘢痕組織形成をもたらします4。哺乳類とは対照的に、心臓の再生は、ゼブラフィッシュ5やサンショウウオ6などの一部の非羊膜動物モデルで十分に確立されています。伝統的に、これらの種では、部分的な心室切除またはピンチ5,6,7,8,9,10の後に心臓の再生が研究されてきました。しかし、2011年に3つのグループがそれぞれゼブラフィッシュ11,12,13の凍結傷誘発性心筋梗塞技術を開発しました。凍結損傷技術は、ゼブラフィッシュの心臓心室の大部分で壊死とアポトーシスを引き起こし、線維性組織の初期蓄積をもたらすため、虚血性梗塞後の哺乳類の心臓の病理学的発達を心室切除術と比較してより密接にモデル化します11,12,13.さらに、マウスとブタにおける冠状動脈結紮による凍結傷害誘発性心筋梗塞と虚血誘発性心筋梗塞の方法論的比較により、凍結傷害技術が哺乳類動物モデルにおいて有用な代替手段であることが証明されました14,15。ゼブラフィッシュの凍結損傷モデル16,17に関与する方法に触発されて、我々は、再生能力19で有名な両生類であるウーパールーパー18でも同様のモデルを開発し、組織除去ではなく組織損傷後のこの四肢動物の心臓修復に関与するメカニズムの調査を可能にした。

ここでは、ウーパールーパーで凍結損傷誘発性心筋梗塞を実行する方法に関する詳細なプロトコルを紹介します。私たちは、生存率、回復力、および実験の再現性を向上させる迅速で低侵襲の重要なステップに特に重点を置いています。さらに、心エコー検査を使用してin vivoで解剖学的再生を評価するための適切な技術、および偏りのない立体学に基づく定量的組織学を使用してex vivoで評価するための適切な技術について指導します。

ウーパールーパーの凍結傷害誘発性心筋梗塞は、この四肢動物の心筋再生に関与する基本的なメカニズムを調査するために適用できます。ウーパールーパーは、心室の少なくとも45%に影響を与える凍結損傷誘発性心筋梗塞に耐性があり、比較的だらしない生活習慣で行動を変えることなく、一回拍出量と心拍出量が減少しますが、より深刻な損傷は動物の健康を損なう可能性があります。

要するに、凍結損傷を誘発するために、麻酔をかけたウーパールーパーの胸部に腹側切開が行われます。心室には鈍的解剖を使用してアクセスし、予冷したクライオプローブを10秒間適用して凍結損傷を誘発します。腹側切開部を縫合し、意識が回復した後も行動に変化の兆候がなく、動物はすぐに回復します。対照動物/偽動物は同様の治療を受けますが、非冷却クライオプローブを経験します。心筋の機能は、以前に健康なウーパールーパーの心臓について網羅的に説明されたように、心エコー検査(高周波超音波システムが必要、≥20 MHz)を使用して監視でき、梗塞画分は再生プロセス中に非侵襲的かつ繰り返し推定できます。梗塞した心臓は、3ヶ月間の再生過程でいつでも採取でき、組織学のために凍結切片を作製し、標準的な手順(例えば、エオシン&ヘマトキシリンまたはマッソンのトリクローム染色)を用いて染色することができます。特に、マッソンのトリクローム染色により、心室の梗塞部分と健康な部分を明確に区別できます。心室の梗塞画分は、以前に心臓研究について説明した立体学的手法を用いて決定される21。

プロトコル

このプロトコルは、すべての機関(オーフス大学)および国(デンマーク国立動物実験検査官プロトコル#2015−15−0201−00615)の動物管理規則およびガイドラインに準拠しています。

1. クライオプローブの調製

  1. 直径1mmの銅線を3本10cmに切ります。
  2. 銅のストランドを1本の糸に巻きます。
  3. ガストーチで銅紐の一端を溶かし、直径2mmの球形の端部を形成します。
    注:銅は熱伝導率が高く(0°Cで401 W m-1 K-1 )、管理しやすい温度(融点1084.6°C)で成形できますが、銅表面は特に血液と接触すると時間の経過とともに腐食する傾向があり、熱伝導率が著しく低下します。そのため、銅ベースのクライオプローブは時々研磨する必要があります。クライオプローブにも使用できる、より安定した代替金属としては、銀(熱伝導率428 W m-1 K-1 、0°C、融点961.8°C)と金(熱伝導率318 W m-1 K-1 、0°C、融点1064.2°C)があります。
  4. 2mLシリンジからピストンを取り外し、柔らかいゴム製のヘッドを引き抜きます。
  5. 銅紐の非球形の端をシリンジに挿入し、ピストルに結びます
  6. ピストンをシリンジの元の位置に戻します(図1A)。
    注:クライオプローブを使用しないときは、ピストンを完全に引き戻して銅ストリングを保護する必要があります。使用中は、ピストンを奥まで押し込み、銅弦を冷却槽に露出させます。

2. 凍結傷害誘発性心筋梗塞

  1. ウーパールーパーを 200 mg/L のベンゾカイン麻酔薬に浸して麻酔します。30分間の浸漬で、~2.5時間の完全麻酔が得られます。
    注:ベンゾカインは水に不溶性であり、最初に3 mL(ベンゾカイン200 mgあたり)アセトンに可溶化し、その後水浴に加える必要があります。.ベンゾカインに長時間浸漬すると回復が損なわれる可能性があるため、ベンゾカインでの時間を注意深く監視する必要があります。.
  2. ウーパールーパーを腹側を上にして手術皿に置きます(右利きの外科医の場合は頭を左に向けます)。胸部を除くすべての体の部分を麻酔薬溶液に浸したティッシュワイプで包み込み、固定します(図1B)。
    注:動物を湿ったティッシュワイプで包むと、水生両生類にとって重要な湿った環境が確保され、目に獣医の軟膏が不要になります。その後のステップではオートクレーブ滅菌済みの器具を使用して、手術中の無菌性を確保します。
  3. 虹彩切除ハサミを使用して、胸部の正中線からわずかに右に皮膚に ~1 cm の縦方向の切開を行います (図 1C)。
  4. 鉗子を使用して、胸帯の軟骨板を解放します。
    注:胸帯は繊細な構造であり、後の創傷治癒や動物の移動と福祉を損なう可能性があるため、その要素を損傷しないように注意する必要があります。
  5. 露出した心膜を切開して、下にある心臓構造を損傷することなく静かに開きます。心膜液が漏れる前に、これを鈍い2ゲージ針を搭載した1mLシリンジに吸引します(図1D)。
  6. 創傷の縁と軟骨板を離すために、創傷に開口部(~1 cm)を設定した鈍い鉗子を配置します(図1E)。
  7. 銅線を露出させた状態でクライオプローブを液体N2 に少なくとも2分間置きます。
    注:銅線の質量が小さすぎる(つまり、短すぎる)場合、または冷却が不十分な場合、望ましくない不完全な経壁凍結損傷が発生する可能性があります。
  8. 露出した心室を綿棒またはしっかりと巻いたティッシュワイプで優しく拭き、心室表面に液体が存在しないことを確認します(図1F)。
  9. -196°Cに冷却したクライオプローブを液体N2 から取り出し、露出した心室に直接塗布します(図1H)。それは心室に付着します。クライオプローブの配置は、他の心臓構造への損傷を避けるために、心室の外側を頂点に向かって行う必要があり、健康な心筋と梗塞性心筋の両方を含む顕微鏡検査のためのその後の横切片を可能にする必要があります。10 秒後、以前に採取した心膜液をクライオプローブの先端に塗布します (図 1I)。これにより、プローブが解凍され、心室からの剥離が可能になります。
    注:過剰な水がある心室にクライオプローブを適用すると、プローブの加熱が速すぎると不完全なクライオ梗塞が起こり、心室の表面全体を覆う薄い水層が瞬時に凍結すると、心筋の損傷が広すぎるかのいずれかになります。どちらの状況も望ましくありません。凍結損傷の誘発が成功した場合、心室に小さな赤い円形の腫れが現れます(図1J)。偽動物を取り扱う場合、非冷却クライオプローブを同様の方法で10秒間配置します(図1G)。
  10. 心室の上に心膜を載せ、傷口を開いたままにしていた鉗子を取り外し、胸帯の軟骨板を再配置します。
    注:心機能を評価するためにその後の心エコー検査を行う場合は、軟骨プレートの下に発生しやすい微細な気泡であっても、すべてのエアポケットを取り除くことが重要です。これらの気泡は、組織を静かに押すか、オートクレーブ滅菌した両生類のリンゲル液(6.6 g/L NaCl、0.15 g/L KCl、0.15 g/L CaCl2、0.2 g/L NaHCO3 蒸留水)を創傷表面に加えて気泡を溶解することで除去できます。
  11. 溶解可能な糸(3-5ステッチ)を使用して皮膚を縫合します(6-0)(図1K)。
  12. 傷口の上に持ち上げたウェットティッシュワイプで手術部位を覆い、麻酔液に浸します。
  13. 動物と一緒に手術皿を氷の上に2時間置いて、創傷表皮の初期形成を可能にし、動物が非滅菌水生環境にさらされる前に創傷の端を密閉します。
  14. 動物を水槽の水が入ったきれいな容器に移します。ザ・ 動物 それはこの時までに意識を取り戻しているはずです。動物が完全に意識を取り戻し、協調的な動きを取り戻すまで観察します。手術後2日間は摂食と水交換を停止し、ウーパールーパーを専用の水槽に単独で保管して、障害が再発する前に創傷を閉鎖できるようにします。
    注:意識を取り戻した後、ほとんどのウーパールーパーは空気を飲み込みたいという願望を持っています。このプロセスを容易にし、必要な動きの量を制限するために、手術後1〜2日間、手術直後の水槽内の水位を下げることが有益です。低濃度のベンゾカイン(20 mg / L)は、手術後24時間の鎮痛薬として使用できます。.

3. 心エコー検査による梗塞分率の非侵襲的測定

  1. ステップ2.1で説明されているように、ウーパールーパーを麻酔します。
  2. 腹面を覆う3〜5 mmの麻酔液を入れた小さな容器に動物を仰臥位に置きます。
  3. 超音波トランスデューサーを動物の長軸に沿って、胸部の正中線の少し右側に配置します。
  4. 梗塞率の2次元推定[IF(超音波、2D)]では、Bモードで梗塞帯と心室が最大になるまでトランスデューサーを並進させます(図2A-D、 補足資料1-2)。
  5. > 50 フレーム/秒で ≥3 心周期を取得します。
  6. 拡張末期の心室 (CSAv) と梗塞帯 (CSAi) の断面積を測定し、次の式を使用して球形心室形状と半球形梗塞帯形状を仮定して 2 次元梗塞分率を推定します。
    figure-protocol-1 (1)
    注:心室とインフラクションゾーンの形状の幾何学的仮定を評価するために、トランスデューサーを90°回転させて心臓の短軸ビューを表示することができます(図2E-F、 補足資料3)。
  7. 梗塞分率を3次元的に推定するには、心室拡張期末に心室のごく一部しか見えないまで、トランスデューサーを左または右に配置します。
  8. 0.5 mm(小動物の場合、体重≤ 20 g)または1 mm(大型動物、体重> 20 g)のステップ(z)で、トランスデューサーを心室を横切って動かし、ステップ/スライスごとに少なくとも3回の心周期を獲得します。
    注:妥当な精度を得るには、8〜12スライス(n)を取得する必要があります。
  9. 各スライス (j) の拡張末期で CSAv と CSAi を測定し、次の式を使用して心室と梗塞形状の幾何学的な仮定なしに 3 次元梗塞画分[IF(超音波、3D)] を推定します。
    figure-protocol-2 (2)
    注:2次元取得と3次元取得の両方を使用して、Dittrich et al.(2018)20のセクション3および6で説明されているように、心機能(一回生量と心拍出量)を幾何学的に測定できます。同様に、パルス波速度取得速度時間積分(図2G)も、Dittrich et al.(2018)20のセクション3で説明されているように、心機能の測定にも使用できます。
  10. ステップ3.9で描画したCSAvとCSAiの関心領域を、スライス間にz間隔のバイナリマスクとして抽出し、拡張期末期と収縮期末期の心室と梗塞ゾーンを3次元的にモデル化します(図2H、 補足資料4)。

4. 梗塞分率を測定するための偏りのない定量的組織型

  1. ステップ2.2〜2.6で説明されている麻酔をかけたウーパールーパーの心臓を探ります。
  2. 26ゲージの針を備えた1mLシリンジを使用して、5μL / gの体重1000IU / mLヘパリン両生類リンガー溶液を静脈洞にゆっくりと注入し、抗凝固剤が循環中に分布するまで2分間待ちます。.
  3. 斬首と脳のパイシングによって安楽死させ、最初に流入血管を切断し、次に流出路を切断することにより、心臓全体を切除します。
  4. 心臓を流出路で静かに持ち上げて、両生類のリンガー溶液を含む60×15mm2のペトリ皿に移します。
  5. 拡大下で、静脈洞に100 IU / mLのヘパリン処理リンゲル溶液を穏やかに充填することにより、心臓に残っている血液を洗い流します。.
    注:心臓の事前固定は、緩衝ホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで心臓を灌流することによって行うことができますが、切片化は凍結温度で行われるため、これは必要ありません。続いて、スライドガラス上の切片の固定を行うことができる。完全に洗われた心臓は、青白く白っぽく見え、赤血球の痕跡は含まれていません。心室や心房の表面に小さな血栓が形成される可能性があります。それらは、その後の定量的組織学手順の精度に影響を与えません。
  6. 心臓を糸くずの出ないティッシュペーパーに移し、1分間ブロットします。
  7. 最適な切断温度のコンパウンドを1滴塗布して適切なサイズのクライオモールドを調製し、心臓を滴に移します。ハートをやさしく底まで絞ってください。
  8. より最適な切断温度のコンパウンドを適用してクライオモールドを充填し、心室が底に留まるようにします。金型を5分間放置して、最適な切断温度のコンパウンドをサンプルに分布させます。
  9. 液体窒素に浮かべたピペットチップボックスの蓋に型を置いて、型をスナップフリーズします。
    注:より制御されたスナップ凍結のために、心臓を10〜30%ショ糖溶液で1時間一晩保存し、液体窒素冷却イソペンタン(2-メチルブタン)を使用してスナップ凍結を行うことができます。私たちの経験では、最終結果はそれほど大きく変わりません。
  10. 切片化する前に、-18〜-22°Cに設定されたクライオスタットでクライオモールドを少なくとも1時間テンパリングします。
  11. スライスの厚さ10μmでサンプルを切片化し、10スライス ごとに収集して、100μmのスラブの厚さ(t)を提供します。心臓全体が切片化されるまで切片化を続けます。
    注:スライスとスラブの厚さは異なりますが、スライスの収集はブレードが心室に触れるまさにその点から開始し、心臓全体が少なくとも10〜12の等間隔のスラブで切片化されていることが重要です。スラブごとに複数のスライスを収集して、重複するセットを提供できます。
  12. ヘマトキシリンとエオシン、またはマッソントリクロームの標準プロトコルで組織切片を染色し、心外膜、心筋、弁、および梗塞ゾーンを明確に区別します。
  13. カメラ顕微鏡またはスライドスキャナーを使用して、十分な倍率で組織切片をデジタル化し、ウーパールーパールーパーの小柱状構造をはっきりと明らかにします(図2I)。
  14. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) に画像スタックを読み込み、セルカウンタープラグイン (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html) を初期化します。
  15. 多目的グリッド マクロ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt) を実行し、適切なグリッド密度のポイント グリッドを生成します。
    注:グリッド密度(グリッド面積)は、サンプルサイズと形態によって異なります。望ましい精度を提供するには、グリッドポイントと対象の各構造の少なくとも100〜200の交差を確保する必要があります。
  16. セルカウンタープラグインを使用して、ポイントグリッドと対象構造との間の交差の数をカウントします(図2I、右側の倍率)。
    注: 精度を上げるには、十字線の照準点に正確に表示される交点のみを含めることが重要です。
  17. 事前定義された点グリッド領域[Ai(p)およびAv(p)]、スラブの厚さ、および各スラブでの点グリッド交差の数(Pj)と梗塞性心筋および全心室心筋の数から、次の式を使用して梗塞率を計算します。
    figure-protocol-3 (3)

結果

体重が11.8 ± 1.3 g、全長が11.8 ± 0.5 cmのウーパールーパーでは、2 mm(直径)のクライオプローブで行われた凍結損傷処置により、梗塞ゾーンが完全に発達した損傷後7日目の心室心筋の45.4±14.2%をカバーする梗塞領域が得られます[図2I、健康な心臓の梗塞前(上)と梗塞7日後(下)]のセクションを比較します。この手順の死亡率は2.2%(2/90匹)です。この手順により、非侵襲的心エコー検査で視覚化、定量化、モデル化できる明確に定義された損傷ゾーンが得られます(図2C-H、補足資料1-4)。当初、凍結傷害誘発性心筋梗塞は心機能に大きく影響し、傷害前と比較して受傷後7日で一回拍出量が62.2%、心拍出量が73.9%に減少し、3か月で形態と機能が徐々に回復しました(データは示していません)。心筋凍結損傷後の行動変化は、比較的穏やかなウーパールーパーでは観察されません。

figure-results-1
図1:クライオ梗塞の手順。 A、カスタムメイドのクライオプローブは、3本の銅線を巻き、先端を球状に溶かし、2.5mLシリンジのピストンにワイヤーを取り付けて作られます。 B-L、クライオ梗塞の手順。手術部位を除くすべての身体部位をウェットティッシュワイプ(B)で包み込んだ後、正中線より少し右の胸部( B)の腹側切開を虹彩切除ハサミ(C)で行い、切り株解剖により胸帯を解放する。心膜を切開して穏やかに開き、心膜液を鈍い23ゲージ針(D)を使用して1mLシリンジに吸引します。心室が露出し、創傷は事前に定義された開口幅の鉗子で開いたままにされ(E)、心室に残っている液体はすべて拭き取りされます(F)。偽手術では、凍結損傷と同じ方法で非冷却クライオプローブ(G)を適用し、液体窒素(-196°C)で冷却されたクライオプローブを心室の側壁に当てて頂点(H)に向かわせます。10 秒後、心膜液をクライオプローブに再適用して心室から放出します (I)。これにより、明確に定義された凍結傷害ゾーン(J)が得られます。最後に、心膜と胸帯を心臓の上に置き、皮膚を溶解性縫合糸(K)で縫合します(3〜5スティッチ)。動物を2時間氷上に放置して、創傷治癒プロセスを開始します(L)。頭蓋骨は B-Lで左を向いており、利き手の右手を持つ外科医の動物の向きを表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:予想される結果。 A および B、拡張期(A)および収縮期(B)の健康なウーパールーパー心室のBモード長軸画像。 C および D、拡張期(C)および収縮期(D)の凍結傷害者(損傷後2日)のウーパールーパー心室のBモード長軸画像。 E および F、拡張期(E)および収縮期(F)の凍結傷害者(損傷後2日)のウーパールーパー心室のBモード短軸画像。 G、脈波ドップラーは、梗塞前(上)と梗塞後2日後(下)の速度時間積分を取得しました。 H、3次元超音波取得による梗塞前および梗塞後2日間の心臓のモデリング。 I、マッソントリクロームで染色された偽物(上)と梗塞後7日(下)のウーパールーパールーパー心室を通る代表的な横行組織学切片。右の拡大は、梗塞率の立体測定のための点グリッドを示しています。青と赤の円でマークされた点は、健康な組織 (青い円) と梗塞した組織 (赤い円) との交差を表します。 A-D では頭蓋骨が右に、 E-Fでは動物の右が左に向いており、これは従来の心エコー画像の表示を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足資料1:長軸、健康な心室梗塞前、Bモード(図2A-Bを参照)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足資料2: 長軸、梗塞性心室(梗塞後2日)、Bモード( 図2C-Dを参照)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足資料3: 短軸軸、梗塞心室(梗塞後2日)、Bモード( 図2E-F参照)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足資料4:図2A-Hおよび補足資料1-3に見られる梗塞前および梗塞後の同じ心臓の3次元インタラクティブモデル。Adobe Acrobat Reader 9 以降でインタラクティブ PDF ファイルを起動します。モデルをクリックして、3D フィーチャーをアクティブ化します。カーソルを使用してモデルを回転、ズーム、パンします。画面の左側にあるモデルツリーでは、すべてのセグメントをアクティブ化/非アクティブ化したり、透明にしたりできます。モデルツリーは、(+を選択して)開くことができるいくつかのサブレイヤーを含む階層として構築されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

実験のばらつきを最小限に抑えるために、凍結損傷の外科的手順は無菌手順に従うべきであり、特定の再生実験に動物を使用しようとする前に、いくつかの動物で外科的訓練を実施する必要があります。.トレーニングにより、凍結傷害の手順は、幼体(5 g、7 cm)から大型の成人(100 g、25 cm)まで、幅広い軸上動物のサイズと年齢で実施できます。クライオプローブが十分なサイズを持ち、十分に冷却されていることが、ウーパールーパーの心室に堅牢で再現性のある凍結損傷をもたらすことが重要です。非常に小さな動物(5-8 g、7-9 cm)の場合、クライオプローブはより小さな直径で構築できます。凍結傷害プロトコルは、ベンゾカインや MS-222 などの鎮痛特性を持つ麻酔薬を使用して実施することが不可欠ですが (または、二次鎮痛剤の追加適用を伴う)、フォローアップ心エコー検査は、鎮痛特性が限られている他の麻酔薬、たとえば、プロポフォールなど、アクホロートル22 のベンゾカインや MS-222 よりも心機能への影響が少ないことが説明されています。

クライオケージング法は、ヒトの心筋梗塞の臨床例により近い冠動脈結紮術のように冠動脈閉塞による虚血誘発性心筋梗塞を引き起こさないという意味で限定的です。ただし、結紮ベースの方法は、冠状血管系が非常に少なく、ほとんどが管腔酸素供給がある線維柱状両生類の心臓には適用できません。また、凍結傷害誘発性心筋梗塞は、虚血誘発性心筋梗塞の病理学的影響のほとんどを再現すると説明されています14,16。凍結損傷によって生じる損傷領域は、凍結プローブに近接した組織に高度に局在しており、冠動脈閉塞による複雑で分岐状の梗塞とは似ても似つかないものの、実験現場では健常組織と梗塞組織の境界領域を容易に認識でき、新たに形成された心筋細胞の進行を調べることができるという利点がある。

ウーパールーパーはゼブラフィッシュよりもかなり大きな動物で、3つの心室(2つの心房、1つの心室)からなる心臓や、解剖学的ではないが酸素化された電流と脱酸素化された電流23における機能的な血流の分離など、より複雑な心血管系を持っています。これは、魚類に見られる2つの心室と連続的な流れのシステムと比較して比較されます。ゼブラフィッシュで前述した凍結傷害処置は、切開された腹面16,17の術後縫合を伴わない。これは、動物の実験室の生息地で心臓が非滅菌の水生環境に不必要にさらされるのを避けるために、ウーパールーパーで必要です。

偏りのない立証学に基づく定量的組織学は、現在、梗塞画分のほとんどの定量的測定が中期梗塞帯の組織切片、場合によっては2つの隣接する切片の組織切片に描画される面積に依存している再生分野では過小報告されています24。ステレオロジーの概念は、より堅牢で偏りのない測定を提供するために、任意のモデル種の組織学的検査に適用できるため、この自由に利用できる方法を、ウーパールーパーだけでなく、すべての再生種の心臓再生の定量的評価に組み込むことを提案します。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

Casper Bindzus Foldager、Asger Andersen、Michael Pedersen(いずれもオーフス大学臨床医学科)、David Gardiner(カリフォルニア大学アーバイン校発生細胞生物学部)に対し、ウーパールーパー凍結損傷モデルと超音波検査の初期開発にご協力いただき、感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
S&Tシザー SAS-15S&T AG - 顕微手術器具虹彩切除はさみ
Vevo 2100富士フイルム、VisualSonics高周波超音波スキャナー

参考文献

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