MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

代謝産物は、代謝産物の中間体または代謝の産物、ヌクレオチド、アミノ酸または有機酸、脂質、生物学的機能およびプロセスの重要な構成要素である。代謝産物の研究であるメタボロミクスは、基礎、翻訳、および臨床研究の文脈における生化学的相互作用の探求と役割の理解を可能にする。代謝産物は、生物のフェノタイプと強く関連しており、細胞代謝中に生じる生化学的活動に関する情報^{を提供する1。}したがって、ゲノミクスやプロテオミクスに加えて、メタボロミクスは生理学的および病理学的状態の両方を理解する上で重要なツールとして登場しました。例えば、メタボロミクスは、既存の薬剤の背後にあるメカニズムとその耐性を解明するために使用されます。医薬品開発において、異種代謝は、種を越えた代謝産物の活性または毒性を評価するのに有用であり、後に個別化医療²を支援することに変換される。メタボロミクスの広範な適用にもかかわらず、代謝産物のイメージングは、代謝産物の化学的反応性、構造不均一性、および広い濃度範囲³のために困難であり得る。しかし、高エネルギー化合物、グルコース、乳酸、解糖、ペントースシャント経路、およびTCAサイクル中間体を含む不安定代謝産物の濃度は、リン脂質、神経伝達物質、シグナル伝達化合物、組織酵素が死後のイシュ血症の収穫手順中に活動する数秒以内に変化し、数分で進行する可能性がある^。.正確なメタボロミクスデータ取得を確実にするために、適切かつ慎重なサンプル調製は^7、8を極めて重要である。代謝産物を測定するための現在確立されたプラットフォームには、NMR、酵素アッセイ、質量分析(液体およびガスクロマトグラフィーを含む)があり、最後の点を以下に説明する。

MALDI-MSIは、個々の分子種の検出を通じて複雑なサンプルの分析を可能にする最先端の技術です。MALDI MSIは、生物学的試料中の様々な分子化合物を迅速かつ再現的に測定することができるという利点を与えます。質量分析イメージングは、さらに、その複合代謝産物に基づいて組織生物学を表す画像の生成を可能にし、また、サンプル⁹中の代謝産物の空間分布を維持しながらそれを行う。MALDIは、抗体標識、構造修飾、または免疫染色に使用されるような他の特殊な試薬を使用せずにサンプル中の検体を検出する能力と、単一の実験内で何百もの分子を監視する能力と相まって、MSイメージングが代謝プロファイリングに与える利点のほんの一部を含む^{10、 11}.2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)や9-アミノアクリジン(9-AA)などの一般的に使用されるマトリックスに加えて、最近発見された新しいマトリックスN-(1-Naphthyl) エチレンジロイクロ塩化 (NEDC) は、様々な低分子量代謝物の分析に適しており^、MS2.

MALDI MSIの広範な適用にもかかわらず、装置の高いコストおよび実験手順の複雑さは、個々の研究所でのより広い実装を防ぐ。したがって、MALDI MSI研究の大部分は、共有コア施設を通じてサポートされています。スライド調製およびマトリックスコーティングを含むサンプル調製は、MALDI MSIにおける最も重要なステップです。しかし、スライドの準備は通常、個々の研究者の研究室で行われ、後のMALDI MSI取得に潜在的なバリエーションを生み出します。ここでは、MALDI MSI測定に進む前に生体試料のサンプル調製のための詳細なプロトコルを提供し、発達マウス脳のメタボロミックプロファイリングを例として用いることを目指しています。

このプロトコルは、ニューヨーク市立大学(CUNY)先端科学研究センター(ASRC)の制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)のガイドラインに従っています。

1. 組織を収穫する

1. アルミボートを準備します。長方形のアルミニウム10cm x 20cmを準備し、中央に折り畳んで10cmの二重層正方形を作ります。一方の側にサンプル情報にラベルを付け、もう一方の側を折り畳んで、底面が約4cm x 4cmのボートを形成します。
2. 発泡スチロールボックス内の液体窒素(LN₂₎でボートを予冷します。
   注:ボートが小さすぎると、サンプルがボートから落ちて、LN₂に直接接触して凍結し過ぎる可能性があり、凍結切断中に断片化が発生する可能性があります。
3. IACUCガイドラインに従って子宮頸部脱臼により動物を安楽死させ、関心のある組織を直ちに解剖する。
   1. 動物麻酔とスナップ凍結の間隔をできるだけ短く保ち、組織採取中の代謝産物、特に死後の虚血による脳内の陰唇代謝物の変化を最小限に抑える。
      注:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で動物を灌流すると虚血の持続時間が長くなり、不安定代謝物の濃度がさらに変化し、関節の実際の結果が誇張されます。したがって、血液や体液の汚染が個々のプロジェクトの代謝物の劣化や洗い流しよりも懸念されない限り、PBSで組織を灌流または洗浄することは推奨されません。
4. 液体窒素に浮かぶアルミニウムボートにすぐに組織を入れ、発泡スチロールボックスの蓋を閉じ、組織の大きさに応じて2〜10分間凍結します:2分、5分、出生後1日目(P1)の7分、P21、P60マウス脳、P60ラット脳それぞれ10分。
   注:過剰凍結が凍結中に組織の断片化につながる可能性があるため、長時間(例えば、P1マウス脳の場合は5分)組織を凍結しないでください。
5. 鉗子でボートを取り外し、ホイルを折ってティッシュを包み、ドライアイスで輸送し、後で使用するために-80 °Cで保管してください。直後に切り離し続ける場合は、ドライアイスのサンプルをクライオスタットに運びます。
   注:代謝物をよりよく保存するために、MALDIイメージングに進む前に、サンプルを無傷の組織に保存し、それを切り離すことをお勧めします。組織は、24ヶ月まで-80°Cで保存することができます。

2. 組織をクライオセクション

注意:インジウム酸化チドキシ(ITO)スライドを取り扱う場合は、常に手袋を着用してください。スライドに直接呼吸を避けるか、組織セクションに人間の唾液の汚染を防ぐためにマスク(オプション)を着用してください。

1. 組織を切り離す前に、MALDI互換ITOコーティングガラススライドの所望の数を収集します。
2. 抵抗に設定された電圧計を使用して、スライドの導電率をテストします。抵抗測定が読み取られる側にラベルを付ける:これは、組織の切片が付着する側になります。汚れを避けるために、スライドを清潔なペーパータオルの上に置きます。
3. -20 °Cに設定されたクライオスタットでスライドを事前に冷却します。
4. 組織サンプルを-80°Cから除去した場合、組織の大きさに応じて、約45〜60分間、クライオスタットチャンバー内で組織を平衡させます。サンプルがドライアイスから取り出す場合は、約30分間平衡させます。
5. 70%エタノールで凍結スタットを十分に洗浄してください。クライオスタット室の薄いチップアーティストブラシや鉗子を含むすべての必要なツールを事前に冷却してください。
6. 組織の種類に応じてクライオスタットチャンバーと検体頭部の温度を設定する:肝臓の場合は-14°C、筋肉の場合は-20°C、^皮膚9の場合は-25°C。
7. クライオ組織埋め込み化合物OCTを使用してチャックに組織を取り付け、目的の領域からOCTを避ける。
8. ステージにきれいなブレードを置き、ロックします。目的の切断角度を達成するために、ステージの位置と試料の角度を調整します。
   注:異なるタイプ/遺伝子タイプの組織を切断する場合は、ブレードのきれいな部分が使用されるようにサンプルを再配置するか、クロスコンタミネーションを防ぐために次のサンプルを切断する前に新しいブレードに変更してください。
9. 目的の領域(例えば、脳内の脳梁)が見つかるまで切断を続ける。クライオスタットで平衡化されたアーティストブラシで余分な作品を払いのけて、ステージをきれいに保つようにしてください。
10. 所望の領域が明らかになったら、10-12 μmの厚さの小さいセクションを切る。セクションが剥がれやすい場合は、クライオスタットの温度を上げ、-22°Cから-11°Cの範囲に保ちます。脳組織の最適な切断温度は-15°C~-18°Cであることがわかりました。
11. 良いセクションをカットしたら、ITOスライドに接着します(クライオスタットチャンバーで動作)。
12. アーティストブラシの先端を使用して、ティッシュの1つのセクションをITOスライドに移します。
13. スライドの下に指を置いてセクションを指温し、安全な取り付けを確実にするためにセクションを温める。組織部は、最初に5-10 sで透明に変わり、その後、約30〜60sで不透明になります。
14. 慎重にクライオスタットにスライドを脇に置きます。
15. 他の組織サンプルに対してステップを繰り返し、組織の各部分がスライド上に均等に配置され、可能な限り整列していることを確認します。
16. MALDI ターゲットは最大 2 つのスライドを保持できるため、同じコホートの複数のサンプルのセクションを 1 つのスライドまたは 2 つのスライドに配置して、同時に分析できるようにします。
17. 終わったら、真空箱にITOスライドを置き、乾燥剤とデシケータに移します。スライドを45~60分間真空乾燥します。
    注:真空デシケータがラボで利用できない場合は、-20 °C以下のスライドを常に保ち、代謝物の劣化を避けてください。
18. スライド保管および出荷:MALDIイメージングコア施設がMALDIイメージングに直接進むためにサンプルを調製しない限り、-80°Cでスライドを保存するか、またはドライアイス上のコア施設または他のMALDI研究所に出荷します。
19. サンプルを最もよく保存するには、スライドをスライドトランスポーターに入れ、窒素(オプション)で満たし、パラフィルムでシールし、ジップバッグに入れ、デシカントを含む別のジップバッグに入れます。外側のジップバッグにラベルを付けます。
20. -80 °C(最大6ヶ月)で保管するか、十分なドライアイスで出荷してください。

3. マトリックスの準備

1. マトリックスを準備します。
   注:すべての試薬はHPLCグレードでなければなりません。
   1. 10 mg/mLの濃度でNEDCを準備します。70%メタノール(100mgのNEDC、7mLのメタノール_、H2Oの3mL)の溶媒に溶解したマトリックス10mLを調製する。
   2. さらに、マトリックスを充填する前に噴霧器システムをフラッシュするために、70%メタノール:水溶液の余分な10 mLを準備します。
2. ステップ2.17でスライドが脱水されたら、大胆な点シルバーマーカーを使用して、組織セクションの外側のガラススライドの空白スペースに「X」マークを配置し、銀の「X」の上に細かい点の黒いマーカーを持つ2番目の「x」を配置します。銀の背景(太字の銀の「X」)から鋭いコントラストを持つ黒い「X」は、後にMALDI機器で後述のマススペクトル獲得のための受託マーカーとして機能します。
3. スライドをMALDIスライド金属ターゲットに積み込みます。プラスチックカバーを使用し、サンプルがプラスチックカバー上にあるドロー/アウトラインを使用します。扠置く。
4. フラットベッドスキャナーを使用して、MALDIターゲットと一緒にスライドの画像をスキャンします。ターゲットの表面のネジは、スキャナーによる組織部の損傷または汚染を防ぐためのスペーサーとして機能します。選択したスライド領域を 16 ビットのグレースケールと 2400 dpi でプレビューしてスキャンします。後で MALDI MSI で使用するためにイメージを保存します。

4. マトリックスの堆積

注:サブリメテーション、液滴インクジェット印刷、自動マトリックス噴霧器、アーティストのエアーブッシュ⁹を使用した手動スプレーなど、MALDIスライドに微細な結晶サイズのマトリックスの偶数層を適用する方法は複数あります。このプロトコルの例として、再現性の高い自動マトリックス噴霧器を用います。

1. 起動:マトリックス噴霧器ユニットをオンにして、バルブが LOAD に配置されていることを確認し、噴霧器ソフトウェアを起動します。排気ファンが良好に動作していることを確認します。アクティブベントが正常に機能していない場合は、溶剤ポンプを起動しないでください。
2. [Comms]タブですべてが通信していることを確認し、後圧が~500 psi (または 3.4 MPa) で、.1 mL/min で溶剤ポンプを起動します。
3. 窒素タンクを30 psiに設定して、マトリックス噴霧器への圧縮空気流を開始します。次に、噴霧器前面の圧力調整器を10psiに調整し、必要に応じて噴霧器ノズル温度を設定します。
   注:祈りの空気圧が5 psiより低い場合、噴霧器ノズルは保護のために加熱することはできません。
4. バルブが LOAD 位置に残っている場合は、70 mL のメタノールでループをフラッシュし、6 mL のマトリックスでループを満たします。
5. ティッシュスライドを噴霧器のホルダーに入れ、動きを防ぐために両端をテーピングし、マトリックスによってMALDIターゲットの金属クランプの汚染を避けるためにマトリックスフリーエッジを維持します。
   注:貴重なサンプルスライドに進む前に、最初に空白の顕微鏡スライドでマトリックススプレーをテストすることを強くお勧めします。
6. 噴霧を開始するために流量と温度が安定していることを確認してください。
7. 空のガラススライドを使用して事前にテストした方法を選択します。
8. スタート を押 します。ノズル温度を設定し、選択した方法に合わせてポンプの流量を調整します。バルブを [負荷] から [スプレー位置] に切り替えて、[ 続行]をクリックして確認します。
9. システムの実行を許可しますが、方法に応じてスライドあたり5〜20分かかります。バルブを スプレー から 負荷 位置に切り替え、完了したら [続行 ]をクリックして確定します。
10. 噴霧器からスライドを取り外し、顕微鏡下でマトリックスコーティングのパターンを調べて、微細なマトリックス結晶の均一な層を確保します。
11. マトリックスの堆積後、スライドを金属MALDIホルダーに入れてすぐに使用します。試料スライドが1つしかない場合は、別のブランクスライドを追加して、MALDIホルダーの2つのスペースを埋めます。
12. メーカーの指示に従って使用した直後にシステムをクリーンアップし、噴霧器ノズルの詰まりを防ぎます。
13. サンプルスライドがマトリックスでコーティングされた後、MALDIイメージング装置に直ちに進むか、ステップ2.19で説明したのと同じダブルジップバッグ調製物を使用してドライアイスで出荷します。
    注:MALDI機器などの緊急時には、コーティングされたスライドを真空状態または-20°Cで最大24時間保存しますが、一部の代謝物の劣化は、完全に研究されていない貯蔵中に起こる可能性があります。

代表的な実験は 、図1に示すワークフローに従って行われました。出生後1日目、21日目、60日目の発達C57BL野生型マウス脳(成人)は、CUNY IACUCガイドラインに従って上記のように収穫され、液体窒素に浮かぶアルミニウムボート上でそれぞれ2、5、7分間凍結した。凍結組織は、標本頭部とチャンバーの両方に設定された−15°Cの厚さ10μmのセクションで凍結切除された。組織の凍結分を、MALDIイメージング用のITOコーティングガラススライドの冷却済み導電性側に穏やかに移した。ITOスライド上の取り付けられた凍結部分は、室温で45分間真空中で乾燥させ、続いて自動マトリックス噴霧器を使用してマトリックス堆積を行った。マトリックスNEDCを用いて代謝物を検出し、メタノール/水中10mg/mLのマトリックス溶液(70/30、v/v)を、各サイクル間で5秒間乾燥して12サイクルの流量0.1mL/minとノズル温度75°Cで堆積した。1300 mm/minの噴霧速度、2 mmのトラック間隔、10 psiのN2 ガス圧力、3 L/分の流量、ノズル高さ40mmのノズル高さを使用しました。

MALDI質量スペクトルは、MALDI飛行時間(TOF)MSI機器によって負イオンモードで取得した。メタノール中の0.5〜1μL(n= 1-90のPnクラスター)のエマルジョンをITOスライドに堆積させ、取り付けられた組織の隣に堆積し、2次較正曲線13を適用して100〜1000m/z質量範囲の機器を較正するために使用した。レーザースポット径は、ラスタ幅50μmの「ミディアム」変調ビームプロファイルに焦点を合わせていました。m/z 50から1000までの質量範囲内のスペクトルは、500ショットで1000 Hzで獲得しました。質量スペクトルデータを記録し、高度なMALDI MSIデータ解析ソフトを用いてイメージングをさらに解析した。イオン画像は、ビン幅 ±0.25 Daで、根平均平方根(RMS)の正規化で生成されました。

図2の結果は、100ダルトン間隔毎から選択したm/zスペクトルのMALDI MSIデータ分析ソフトウェアからの出力画像を示し、低分子代謝物から高分子量脂質までのスペクトルの同定に有用性を明確に示した。各行は、出生後1日目、21日目、60日目に収集された3つの組織にわたって、特定の代謝産物種の空間情報とスペクトル情報の両方を含むそれぞれのイオンヒートマップを示しています。各代表m/zについて、地域分布とイオンの豊富さの分析を使用して、異なる年齢間の対応する種の相対的な量を比較することができます。MALDI MSI方法論の強みは、m/zによって同定された特定の種の特異性を発達的マイルストーンまたは特定の解剖学的構造に識別する能力である。一部の代謝物は、P1新生児(m/ z 320.1)で濃縮され、P60成人(m/ z 846.5)で濃縮されるか、または年齢間で均一に分布(m/ z 480.3)であることが観察されています。他の分子種は、特に灰色物質(m/z 117.1;524.3;765.1)、白質(m/z 673.4;846.5)、またはCSF/心室(m/z 239.0)で特異的に濃縮される(図2A)。ヒポキサンチン(m/z 135.0)、N-アセチル-L-アスパラギン酸(m/z 174.0)、アラキドン酸(m/z 303.2)、およびリゾホスファチジルエタノールアミンLPE(18:1)(m/z 478.3)などの脂質を含む代表的な代謝産物の空間分布(m/z 478.3)、LP E(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), ホスファチジルエタノールアミン PE (44:10) (m/z 838.5), ホスファチジルイノシトール PI(38:4) (m/z 885.6) も示されています(

図 1.MALDI-飛行時間(TOF)質量分析イメージングのワークフロー。 スナップ凍結組織は、クライオスタットで凍結切除され、ITOスライドに取り付けられています。→ 組織切片付きスライドは、自動マトリックス噴霧器を使用して、マトリックスの微細な層でコーティングされています。→質量スペクトルは、20-200umのラスターでMALDI-TOF MSI機器によって収集されます。→ データを分析し、画像は、高度な MALDI MSI データ分析ソフトウェアを使用して生成されます。スケールバー: 2 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.50 μmの横解像度で得られた質量分析から選択されたm/zスペクトルを持つ代表的な出力。(A) ヒートマップは、P1、P21、P60で特定された3つの発達マイルストーンにわたって、100ダルトンm/z間隔ごとに選択された特定の代謝産物種の空間分布を示しています。(B)P1、P21およびP60における代表的代謝物の空間分布は、ヒポキサンチン、N-アセチル-L-アスパラギン酸、アラキドン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン(LPE)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)などの異なる脂質種を含む。スケールバー、500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。