呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

非セグメント化負感覚(NNS)RNAウイルスは、狂犬病、エボラ出血熱、および呼吸器間質ウイルス(RSV)1、2のような多くの重要なヒト病原体^を含む。RSVは、世界中の幼児および高齢者における気管支炎および肺炎などの呼吸器疾患の主な原因^である。現在、RSV⁴を予防または治療するための有効なワクチンや抗ウイルス療法は利用できません。ライフサイクルの一環として、RSVゲノムは、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型として、抗ゲノムを産生し、その結果、子孫ゲノムを生成する鋳型として機能します。ゲノムおよび抗ゲノムRNAはいずれも、核タンパク質(N)によって完全に封入され、ヌクレオキャプシド(NC)3を形成する。NCはRSVポリメラーゼによる複製と転写の両方のテンプレートとして機能するため、ポリメラーゼがRNA合成用テンプレートにアクセスするには適切なNCアセンブリが^{不可欠です。}興味深いことに、NNSウイルスポリメラーゼの構造解析に基づいて、いくつかのNタンパク質が一過性にNCから解離して、RNA合成後にRNAに対してポリメラーゼのアクセスを可能にし、RNAに再結合することを仮説する^{6、7、8、9、10、11、12。}

現在、RSV RNA重合アッセイは、短裸RNAテンプレート^13,14に精製されたRSVポリメラーゼを用いて確立されている。しかし、裸のRNAテンプレートを使用する場合、RSVポリメラーゼによって生成された非プロセスおよび中止産物に観察されるように、RSVポリメラーゼの活動は最適に達しない。ウイルス特異的なRNAを用いるNCの欠如は、RSV RNA合成のさらなる機械化的理解のための主要な障壁である。したがって、本物のRNAテンプレートを使用することは、RSV RNA合成の基礎知識を進めるために重要な必要性になります。RSVおよび他のNNS RNAウイルスからのヌクレオカプシド様粒子(NCLPs)の既知の構造は、NCLPs中のRNAがランダムな細胞RNAまたは平均ウイルスゲノムRNA15、16、17、18、19であることを明らかにする。一緒に、主なハードルは、Nが宿主細胞で過剰発現したときにNCLPsを形成するために非特異的に細胞RNAにNが結合することです。

このハードルを克服するために、まずRNAフリー^(N0)を取得し、本物のウイルスゲノム^RNAをNCLP20に組み立てるプロトコルを確立しました。このプロトコルの原理は、Nをシャペロンと共発現させることにより組換えRNAフリー^N(N0)を大量に得る、RSVホスフォタンパク質のN末端ドメイン(P_NTD)である。精製された^N0Pは、RSV特異的なRNAオリゴを添加することによってNCLPに刺激され、組み立てることができ、そして組立プロセス中に、シャペロンP_NTDはRNAオリゴの添加時に変位する。

ここでは、RSV RNA特異的なNCの生成と組み立てのためのプロトコルについて詳しく説明します。本プロトコルでは、分子クローニング、タンパク質調製、 インビトロ アセンブリ、および複合アセンブリの検証について説明する。我々は、分子クローニングのためのタンパク質共発現のためのバイシストロニック構築物を生成するためのクローニング戦略を強調する。タンパク質調製については、細胞培養、タンパク質抽出、タンパク質複合体の精製の手順について説明します。次に、RSV RNA特異的NCの インビトロ アセンブリの方法について検討する。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と負染色電子顕微鏡(EM)を使用して、組み立てられたNCLPを特徴付け、可視化します。

1. 分子クローニング

注:リガーゼ独立クローニング(LIC)は、RSVビシストロニック共発現コンストラクトプラスミドを作るために使用されました。LICは、1990年代初頭に開発された方法であり、T4 DNAポリメラーゼの3'-5'Exo活性を使用して、ベクターとDNAインサート^21,22との相補性を持つオーバーハングを作成する。構築物は、オープンリーディングフレーム(ORF)のN末端で10x Hisタグで構成される2BT-10ベクターDNAを使用して作られました(図1)。

1. SSPI消化を用いてLICベクターの線形化を行う。
   1. SSPI 10Xバッファーの10 μL、5 U/μLの濃度で4μLのSSPI酵素、5μgのベクターミニプレップDNAの等価容量、滅菌ddH₂O~100 μLを組み合わせます。
   2. 37°Cで3時間消化をインキュベートする。
   3. ベクターDNAの抽出のために1.0%アガロースゲルでダイジェストを実行します。
   4. ゲル抽出キットを使用して、抽出と精製を行います。ベクターDNAの最終容積を_ddH2Oの30μLで中断し、-20°Cで保存します。
2. N_1-391フォワードプライマー、N_1-391リバースプライマー、P 1-126フォワードプライマー、およびP_1-126リバースプライマーを使用して、N 1-391および_P1-1-126用のDNAインサーを準備する(表1)。
   注:55°Cと60°Cの間の融解温度を確保するために線形化されたベクトルと十分な重複があります。 逆プライマーについては、同じ理由で線形化ベクトルの逆相補鎖と十分な重複がある。
   1. 表2および表3の条件を用いてDNAインサートのPCR増幅を行う。
   2. 増幅したDNAインサートを抽出します。前のステップのPCR産物を1.0%アガロースゲルで実行し、ゲル抽出によってバンドを抽出して精製します。抽出したDNAの最終容積を15μLの_ddH2Oで中断する。
3. T4 DNAポリメラーゼ処理のベクターおよび挿入DNA(表4)
   注:ベクターDNAと挿入DNAに対して、治療を個別に行う必要があります。
   1. 混合物を室温で40分間インキュベートする。その後、75°Cでポリメラーゼを20分間加熱不活性化する。反応混合物を-20°Cに保存する。
4. LICベクトルと挿入ベクトルをアニールします。
   1. 2 μLのLICベクターDNAと2 μLの無菌ddH 2 Oでネガティブコントロール_を設定します。
   2. 0.2 mLチューブに、以前のT4 DNAポリメラーゼ反応からの2μLのDNA挿入DNAと2μLのLICベクターDNAを組み合わせます。
   3. 室温で10分間焼鈍反応を行います。
   4. 25 mMの濃度で1.3 μLのEDTAで反応を焼き付けます。
   5. 反応を100μLの大腸菌Top10の有能な細胞に変換し、アンピシリン選択プレート^23、24にプレートします。
5. 正の構造を特定します。
   1. プラスミドミニプレップ溶液を準備します。これは、LB培地でコロニーピッキングと接種を介して行うことができます。通常、3コロニーで十分である。
   2. 混合物を一晩37°Cでインキュベートする。
   3. 4,560 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
   4. P1バッファーの250 μLでペレットを再懸濁し、スピンミニプレップキットを使用してプラスミドミニプレップを準備します。
   5. AseIまたは他の制限酵素を用いて、ミニプレップ製品の消化分析を行います。
   6. 0.8%アガロースゲルにサンプルをロードし、消化されたプラスミドを実行します。UVランプの下でゲルを分析します。
   7. 正の製品の順序を検証するには、シーケンス サービスを使用します。
6. 共発現DNA挿入物を取得する。
   1. PCRを行い、以前に構築した_2BT-10 N_1-391 および2BT-10 P 1-126をテンプレートとして使用して、N_1-391 および_P1-126 を得る。
   2. 表 2 および表 3 の PCR 条件を使用して、表2および表 3の PCR 条件を使用して、1 番目の PCR を N_{1-391 から N 1-391}を取得する 1^番目の PCR を実行し、N_1-391フォワード プライマーおよびリバース プライマー 5'-GTGAAGATCCGGCTGATGCAATGCGGGGGGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3'.
   3. フォワードプライマーを使用して2BT-10 P_1-126コンストラクトからP_1-126を得るために2^番目のPCRを実行する:5'-CCGCCGCATTGCATCAGCAGGATCTCACTGC
      AGGACTCGAGTCTAGA-3'と_P1-126 リバースプライマー( 表2 および 表3のPCR条件を使用)
   4. 最後に、前の2つのPCR反応の混合産物に対してオーバーラップPCRを行い_、N1-391 と_P1-126をマージする。N_1-391 フォワードプライマーとP_1-126 リバースプライマーを使用します。表 5 および 表 6の PCR 条件を使用します。
7. ベクターとDNAインサートに結合します。
   1. ステップ1.3のプロトコルに従ってT4 DNAポリメラーゼとの重複PCR産物を処理する。
   2. ステップ1.4のプロトコルに従ってLICベクターおよびPCR産物をアニールする。
   3. ステップ 1.5 のプロトコルに続く正の構造を特定します。

2. タンパク質の発現と精製

注:37°Cでの培養細胞のNとPの両方の共発現の二カストロニック構築には大腸菌を使用するが、一晩で還元温度(16°C)で発現を行う。コバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを介してタンパク質複合体を精製する(図2)。

1. タンパク質の生産には 大腸菌 BL21(DE3)株を使用してください。OD_600が0.6 に達するまでLB(ルリアブロス)培地で37°Cで4 L細胞培養を成長させます。
2. 温度を16°Cに下げます。 1時間後、0.5 mMイソプロピル1-チオ-Dガラクトピラノシド(IPTG)を一晩で発現誘導する。
3. 4,104 x gで細胞を25分間遠心し、上清を捨てます。
4. 細胞ペレットを200 mLのリシスバッファーA(50mMリン酸ナトリウム、pH 7.4、500 mM NaCl、5 mMイミダゾール、10%グリセロール、および0.2%NP40)で再懸濁する。50 mLのリシスバッファーを使用して、1 Lの細胞培養から細胞ペレットを再懸濁した。
5. 15分間、3秒間、3秒間超音波処理して細胞をライセします。その後、遠心分離細胞を37,888 x gで40分間用いた。
   注:プロトコルは、-80°C冷凍庫で超音波処理する前に細胞を凍結することによって一時停止することができます。
6. 上清をコバルト重力カラム(直径xの長さ:2.5cm x 10 cm)に積み込み、5~10カラム体積(CV)のリシスバッファーで事前平衡化されたビーズの約10mLを使用します。
7. 5 CVのバッファーB(50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 M NaCl、10%グリセロール、および5 mMイミダゾール)と5 CVのバッファーC(50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、10%グリセロール、および5 mMイミダゾール)でカラムを洗浄します。
8. 2 CVのバッファーD(50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、および250 mMイミダゾール)を使用してビーズからタンパク質を溶出します。
9. Qカラムに対して溶出したタンパク質5xをQAバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、5%グリセロール)で希釈します。
10. QAバッファーでQカラムの5mLを洗浄してカラムを平衡化し、その後、蠕動ポンプ(例えば、ウサギ)を使用して希釈したサンプルをQカラムにロードします。
11. QAバッファーおよびQBバッファ(50 mMトリスHCl pH7.4、1.5 M NaCl、5%グリセロール)とともに、QカラムをHPLCマシンにロードします。流量を1 mL/minとして設定します。
12. 「ポンプ洗浄」プログラムを実行して、QBバッファで機械を洗浄し、QAバッファ(1~2 CV/各)を続けます。システムフローを3 mL/minに設定します。
13. UV1 を 280 nm に、UV2 を 260 nm に設定します。分数を収集するために96深い井戸プレートを使用してください。
14. 溶出剤(QBバッファ)の段階的な勾配を用いた溶出タンパク質は、各濃度の3〜4CVを適用し、0%QBから始まる度に5%ずつ割合を増加させる。N⁰Pタンパク質複合体は15%QB緩衝液で出てこるだろう。
15. すべてのタンパク質が溶出したら、100%QBバッファ(2 CV)でカラムを洗浄します。
16. ゲル濾過Superdex 200増加10/300 GLカラム(直径x長さ:1.0 cm x 30 cm)でタンパク質を分離し、バッファーE(20 mM HEPES pH 7.4および200 mM NaCl)で平衡化します。
17. SDS-PAGEでタンパク質含有分率を解析する。

3. ウイルス特異的NCのインビトロアセンブリ

注:RSV特異的NC(N:RNA)のインビトロアセンブリを、調製した^N0P複合体をRNAオリゴとインキュベートすることによって行った。次いで、SECクロマトグラフィーを用いて^、N0Pと過剰RNAから組立体を分離した(図2)。

1. 精製された^N0P複合体をRNAオリゴと共に1時間室温で1:1.5の分子比で混合してインキュベートし、通常1mg/mLの濃度でタンパク質^N0Pの1mLは次のステップに十分である。同じ量のN⁰Pタンパク質のみを含む対照サンプルを設定します。
2. ゲル濾過Superdex 200は、バッファE(20 mM HEPES、pH 7.4、200 mM NaCl)で10/300 GLカラムを増やす前平衡化します。
3. サンプルを21,130 x g で15分間遠心し、降水量を取り除き、上清をSECカラムにロードします。
4. N:RNAアセンブリサンプルと^N0PコントロールサンプルのSECクロマトグラフィー画像を比較し、A₂₆₀/A₂₈₀比を組み合わせて、組み立てられたN-RNA、N-0 P、およびフリーRNAのピークを特定します。
5. ピーク画分を収集するか、SDS-PAGEゲルを実行するか、グリッドを作成します。
6. 組立N-RNA複合体については、N-RNAピークの全ての分画を収集し、RNA抽出を行い、尿素PAGEゲルを実行して、最初のステップで混合およびインキュベートされたRNAと同じ特定のRNAの長さを再確認します。

4. 負の染色グリッドを作る

注:負の染色電子顕微鏡(EM)は、分子を炭素膜に吸着し、重金属原子の層に埋め込む方法です。負の染色EMは高い画像コントラストを生み出し、粒子を見やすく計算的に整列させます。別の利点は、粒子を炭素膜に吸着させることが、通常、分子を誘導して、好ましい配向が少ないグリッドに付着させることである。分子が同じ向きにある場合、それらを構造的に異なるクラスに分離するのは簡単です。したがって、負の染色EMは、サンプル調製^25、26を導く適切な技術である(図3)。

1. 小さなガラスビーカーに5mLのddH₂Oを電子レンジで加熱するか、沸騰するまでタングステンヒーターを使用する。
2. ウラニルの37.5mgの量を量り、加熱されたddH₂Oの5 mLに加えて0.75%ウラニルの形成染色溶液を作る。光から保護するために、アルミニウム箔で覆われたビーカーの下でかき混ぜます。
3. 染色液に4μLの10M NaOHを加え、光から保護された15分間撹拌を続けます。
4. 0.22 mm フィルターを使用して、テスト チューブにフィルターを適用します。
5. グロー放電を使用して、連続カーボンコートEMグリッド親水性²⁷を作ります。
   メモ:グリッドは、電源に接続されたチャンバー内に配置されます。高電圧を印加すると、チャンバー内のガスがイオン化し、マイナスに帯電したイオンがカーボングリッドに付着して親水性になります。
6. パラフィルムストリップをカットして折ります。パペット2滴のバッファーは、パラフィルムの片側のバッファの40μLを、もう一方の側に40μLの染色溶液の別の2滴をピレットします。
7. EMカーボングリッドを作るためには、3 μLのタンパク質サンプルを1分間塗布します。
8. ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロットします。
   注:グリッドはバッファで2倍、1xは各ステップの後に0.75%ウラニルフォーマット染色溶液をブロットして洗浄されます。
9. 0.75%ウラニルフォーマット染色液の2番目のドロップで30秒間グリッドサーフェスを保持します。
10. 余分な汚れ溶液を除去し、グリッドを空気乾燥させるために、ブロッティング紙に対してグリッドをブロットします。
11. イメージングの前にグリッドボックスにグリッドを保存します。

RNAフリーN0Pタンパク質の精製
このプロトコルにより、大規模な可溶性ヘテロダイマーRSVN0P複合体が得られる。Pタンパク質のNおよびN末端部分の全長は、大腸菌のNタンパク質上の10X His-Tagと共に発現した。N0Pをコバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。N0Pは全長NとN末端Pの両方を含むが、UV吸光度A260/A280比20に基づく細胞RNAは含まれなかった(図4)。

N-RNAの組立と陰性染色による検査
その後、精製されたN0Pを刺激し、特定のRNAオリゴでインキュベートすることによりヌセロプラスミド様粒子(NCLPs)に組み立てられることを実証しました。NCLPsを、室温で1:1.5の比でRNAオリゴでN0Pを1時間インキュベートし、ゲル濾過カラムを通して組み立てた。N:RNA複合体が形成されると、3つのピークを示します:第1のピークはN:RNA、第2ピークはN0P、3番目のピークは過剰な遊離RNAです。N:RNAピークの最も高い割合は、EM20をチェックするための負の染色グリッドを作成します(図5)。

図 1.プラスミドの構造の図。A.RSV N1-391の構築;ロ。RSV P1-126の構築;C. N1-391とP1-126の共発現のためのバイシストロニック構造.第1遺伝子RSV N1-391、第2遺伝子RSV P1-126、抗生物質耐性遺伝子(AmpR)、およびプロモーターは、それぞれ黄色、シアン、ピンク、オレンジのボックスで強調表示されています。要約すると、RSV N1-391およびRSVP1-126の遺伝子インサートは別々に組み立てられ、組み立てられる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.タンパク質複合体N1-391P1-126の精製のフローチャートを示す。大腸菌細胞培養の接種と大規模な成長を概説し、遠心分離によって細胞を収穫する。その後、細胞溶解が続き、タンパク質サンプルはアフィニティークロマトグラフィー(すなわち、Co2+カラム)、イオン交換クロマトグラフィー(すなわち、Qカラム)、およびゲル濾過サイズ排除(SEC)クロマトグラフィーによって精製される。タンパク質サンプルは、SDS-PAGEゲルによってさらに分析されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.撮像のための陰性染色EMグリッドの調製。A. グローはグリッドを排出します。ロ。負の染色グリッドの手順を示します。ピンセットはグリッドを拾うために使用され、続いてタンパク質サンプルを1分間塗布する。グリッドにはブロッティングペーパーが吸い取られます。グリッドは、バッファーで2回、0.75%ウラニルの形成染色液で2回洗浄されます。グリッドは、2番目の染色液ドロップで30秒間保持されます。グリッドは、各洗浄後に消し、最終的なブロッティング後に空気乾燥されます。C. グリッドは、イメージング用のグリッド ボックスに格納されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.N1-391P1-126複合体の共精製の代表結果。A.N1-391P1-126の SEC プロファイル 。ロ。RNAを有するアセンブリN1-391P1-126のSECプロファイル。C. SDS-PAGEゲルは、N-RNA複合体のNタンパク質と、N1-391P1-126複合体のNタンパク質およびPタンパク質の両方に対するバンドのみを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.N-RNAの代表的な画像。AおよびBは、図4のN1-391-RNAピークからのN-RNAの代表的な負の染色EM画像である。N-RNA複合体は、図3に記載の手順を用いて染色される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表 1.プライマーシーケンス。

表 2.DNAインサート試薬のPCR増幅。

表 3.DNA挿入熱サイクリングプログラムのPCR増幅

表 4.T4 DNAポリメラーゼ処理。

表 5.PCR試薬を重ねる。

表 6.PCRサーモサイクリングプログラムをオーバーラップ。

著者らは開示するものは何もない。