マウスにおける経胸壁ドブタミンストレス心エコー法による心機能の微妙な変化の解明

Summary

左心室機能障害は、多くの心臓疾患の最終的な共通経路を構成しています。ここでは、心疾患のマウスモデルの左心室機能の包括的な評価と心臓表現型のための経胸壁ドブタミンストレス心エコー検査アプローチの詳細なプロトコルを提供します。

Abstract

左心室(LV)機能障害は、多数の心臓疾患の最終的な経路を開きます。ヒトにおける非侵襲的な高周波経胸壁ドブタミンストレス心エコー法により、心機能の微妙な変化を明らかにする還元主義的な調査アプローチが可能になりました。ここでは、この手法をマウスで使用するためのプロトコルを提供し、生理学および病理学におけるLVアーキテクチャと機能の拡張分析を促進し、ストレスのない心臓に隠された心臓病のモデルの変化の観察を可能にします。この調査は、1匹の同じ動物で実施でき、基礎的および薬理学的にストレス誘発性の測定の両方が可能です。適切な麻酔、画像ベースのLV分析、観察者内および観察者間の変動性の考慮、およびドブタミンの腹腔内注射後にマウスで達成できる正の強心反応を得るための詳細な基準を概説します。小動物モデルにおけるヒトの生理学と疾患の特性を再現するために、評価における重大な落とし穴、例えばマウスにおける顕著なバウディッチ効果を強調します。トランスレーショナルの目的をさらに達成するために、ヒトとマウスにおけるストレス誘発効果を比較します。トランスレーショナルスタディに用いる際には、マウスとヒトの生理学的な違いに注意を払う必要があります。実験の厳密さから、マウスモデルでは空間的および時間的解像度の制限により、患者で評価された一部のパラメータは注意してしか使用できないことが示されています。

Introduction

ヒトの多くの心臓病の特徴は、左心室(LV)の収縮期および/または拡張期の機能障害です。構造異常の検出、診断、収縮期心不全の管理、および心不全の症状のある患者の拡張期機能の評価には、心エコー検査が基本的な評価方法として使用されます。

症状は非特異的であり、心不全の臨床症候群の患者の3分の1以上が実際の心不全に苦しんでいない可能性があるため、患者の^{臨床症状1}に対して客観的な心エコー図の相関を見つけることが重要です。さらに、休息状態または静止状態では潜在性であるいくつかの症状は、活動またはストレスの条件下で発生する可能性があります。冠動脈疾患の患者では、冠動脈灌流のすでにわずかな変化が局所壁運動異常につながる可能性があります。しかし、これらの微妙な変化は、ストレスのない心臓に心疾患の変化が隠れている可能性があるため、従来の心エコー検査では評価できません。心臓の生理病理学をより深く理解するために、ストレス心エコー検査は、運動または薬理学的に誘発されたストレスの条件下での心筋の構造と機能の動的評価を提供し、症状と心臓所見を一致させることができます²。また、小動物では、この方法は非侵襲的で信頼性の高い生体内ツール^3,4,5を表しています。ヒトと同様に、心筋のストレス反応は、マウスやラットの薬理学的薬剤を介して誘導することができます。ドブタミンは頻繁に使用される薬物であり、ドブタミンストレス心エコー検査はヒトで広く行われています^6,7が、心臓ストレス反応を評価するために小動物モデルで使用されることもあります8,9,10,11。ドブタミンは、主にβ1-アゴニスト効果を持つ合成カテコールアミンであり、心臓の正の変力およびクロノトロピーをもたらします。ヒトからマウスへの正しい翻訳を達成するためには、心エコー検査の技術と概念的枠組み、例えばマウスの小型化と急速な心拍数に関連する技術的な制限を考慮する必要があります。ドブタミンストレス心エコー検査におけるヒトの目標心拍数は[(220歳)×0.85]であり、健康なボランティアで平均心拍数が約150±10%増加する^12,13。マウスの場合、そのような式はありません。駆出率(EF)は、ヒトのストレス心エコー検査によって5〜20%増加すると説明されています^12,14。マウスのEFは、心拍数にもよりますが、58±11%(< 450 bpm)から71±11%(≥ 450 bpm)の間で報告され^{、心拍数が高くなる}と20%近く変化します4。マウスで心拍出量を増加させる主なメカニズムは、心拍数の増加です。このメカニズムの一部の原因は、バウディッチ効果または階段現象、つまり周波数依存性のカルシウム媒介性陽性-変力性心応答であり、これはヒトよりもマウスでより顕著である^15,16。さらに、(ストレス)心エコー検査は、観察者内および観察者間の変動の根底にあります。したがって、高度に標準化された手順が不可欠です^17,18。

ここでは、健康と疾患のモデルでマウスの心機能の微妙な変化を解明するための標準化された画像を取得するためのドブタミンストレス心エコー検査の詳細な手順を示します。主要な要素には、適切な麻酔、適切な心拍数モニタリング、およびマウスのストレス誘発イメージングにおける可能性のある落とし穴が含まれます。主要なパラメータは、LVEF の考慮を含む収縮期および拡張期機能の評価です。マウスは後負荷誘発性心機能障害に耐性があるため¹⁷、このプロトコルは、心臓弁膜症のモデルで使用するための貴重な情報も追加する可能性があります。

Protocol

すべての方法と手順は、関連するすべての規制(「実験およびその他の科学的目的で使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約」(指令2010/63/EU))に従って実施され、動物の飼育は施設のガイドラインに従って行われました。ヒト被験者からのデータは、人間の福祉に関するすべての機関、国内、および国際的なガイドラインに準拠して分析され、地方倫理委員会(20-9218-BO)によって承認されました。すべての実験は、12週齢の雄C57BL/6JRjで行われました。

1. 資機材の準備

注: 図1 は、小動物の超音波検査作業場の例を示しています。

1. 調光可能な照明を備えた静かで制御された環境で操作してください。
2. 超音波ゲルを予熱します(例:ゲルウォーマーを使用して)。ゲルを37°Cまで温めます。 これには時間がかかる場合があります。
3. プラットフォームを含むすべての器具を消毒用ワイプで清掃します。
4. 電源を入れ、プラットフォームを37°Cに予熱します。
5. 超音波装置の電源を入れます。動物IDとプロトコルID、およびその他の関連情報を入力します。体重が約30 gのマウスには、中心透過が30 MHzの高周波超音波トランスデューサを使用します。
6. アクティブガス排出システムを使用してください。
   注意: 呼気流中のイソフルランを吸着するために活性炭フィルターを使用する場合は、必ず重量を確認し、示された最大重量増加に達したらフィルターを交換してください。
7. 必要に応じて、気化器に適切な量のイソフルランを満たします。
   注意:揮発性麻酔薬を吸い込まないでください。
8. すぐに使用できる注射液を希釈するか、製造元の指示に従って塩酸ドブタミン粉末を0.9%生理食塩水に溶解することにより、2.5μg/μLのドブタミン作業溶液を調製します。溶液は、室温で保存した場合、少なくとも24時間安定です。

​
図1:小動物の心臓超音波検査場。小動物のストレス心エコー検査には、検査時間を短くする必要があるため、人間工学に基づいた設定が不可欠です。職場は、超音波装置、酸素供給と活性ガス排出を備えた小動物麻酔システム、ECGが埋め込まれた加熱心エコー検査プラットフォーム、統合レールシステムの一部としてマイクロマニピュレーターによる移動機能、および生理学的モニタリングユニットで構成されています。超音波ジェルとヒートランプを温めるためのゲルウォーマーは、便利な補助具です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.麻酔のイメージングと導入のためのマウスの準備

1. 酸素富化ガス混合物(1 L / min 100%O₂)に3%-4%v / vイソフルランを誘導チャンバーに充填します。
2. マウスの重量を量ります。マウスの尻尾をそっとつまみ、誘導チャンバーに移します。動物の動きを注意深く観察して、動物が数秒以内に鎮静されることを確認してください。
3. 必要に応じて、麻酔システムに接続されたノーズコーンへのガス流量を変更します(安定した鎮静を維持するために、1.0〜1.5vol%イソフルランと1 L /分 100%O₂ )。マウスを誘導チャンバーから取り外し、予熱したプラットフォームに慎重に置きます。足がプラットフォームに埋め込まれたECGセンサー上にあることを確認します。
4. 強膜の乾燥を防ぐため、両目に軟膏ジェルを塗ります。
   注:応力測定には時間がかかります。
5. ECGセンサーにごく少量の電極クリームを塗布します。動物を粘着テープで四肢すべてに優しく固定します。粘着テープの小さな部分を使用して、動物の頭の位置をノーズコーンに固定します。ECGは、画像取得中の心拍数を記録するために使用されます。生理学的イメージングシステムを調整して、安定したクリアなECG信号を実現します。
   注意: 電極クリームが多すぎると、ECG信号の品質が悪くなる可能性があります。
6. 処置中のストレスから動物を保護するために、心拍数の範囲を400〜450 bpmに維持して、適切な鎮静深度を確認してください。心拍数はECGによって取得されます。範囲内で 50 bpm の変動が許容されます。
   注:動物の動きは、鎮静のレベルが狭すぎることを示している可能性があります。麻酔はマウスの心抑制につながってはなりません。鎮静は、上記の目標心拍数を得るために調整することができます。
7. 潤滑剤を使用して、体温を継続的に監視するために直腸体温計をそっと挿入します。温度を生理学的範囲(マウスの系統と実験設定に応じて通常36.5°Cから37.5°C)に保ちます。環境制御されていない動物の心臓超音波検査室では、赤外線照明の使用が検討され得る。
8. 化学脱毛クリームを使用して、胸から体毛を取り除きます。清潔なdを使用するamp 胸をきれいに拭くペーパータオル。残っているクリーム成分をすべて取り除いてください(図2A)。
   注:脱毛剤を塗布する前にも電動クリッパーを使用できます。これで、動物をイメージングする準備が整いました。イメージング時間を短くすることが重要であるため、イメージング前の全準備は3分以内に完了する必要があります。

図2:動物とトランスデューサーの位置決め (A)マウスは、4本の手足すべてが銀色のECG電極に固定された状態で加熱されたプラットフォームに取り付けられています。体温測定のために直腸体温計を挿入します。鼻は麻酔システムのノーズコーンに優しく挿入されます。(B)傍胸骨長軸ビュー(PSLAX)のプローブ向き。ステップ 3.2 を参照してください。(C)傍胸骨短軸ビュー(PSSAX)のプローブ向き。ステップ 3.3 を参照してください。(D)頂端4チャンバービュー(4CH)のプローブ向き。ステップ 3.4 を参照してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 基本的な心血管イメージング

注:画像は、2つの基本的なトランスデューサ位置(傍胸骨および頂端超音波ウィンドウ)(図2)と少なくとも3つの超音波モダリティ(B(rightness)モード、M(otion)モード、およびドップラーモード(カラードップラーおよびパルス波(PW)ドップラー)(図3、図4、図5)を使用して取得できます。イメージングの基本については、以前に公開された記事^16、18を参照してください。後で取得した応力画像と比較するために、鮮明な画像を取得することが重要です。

1. 予熱した超音波ジェルを泡のない状態で胸に塗ります。
   注意: 非加熱超音波ゲルは、心拍数に影響を与える急速な体温低下をもたらします。
2. 胸骨傍長軸(PSLAX)ビューを実行します。
   注:PSLAXは、LVをその長軸で視覚化するために実行されます。これにより、例えば、大動脈基部の寸法と近位大動脈の寸法、およびLVの長さを得ることができます。
   1. 頭を研究者の反対側に向けて、テーブルを左に約10〜20°、前に5〜10°傾けて、心臓をできるだけ前方に向けます。トランスデューサーを心臓の長軸と一直線に傍rastern状に配置し、マーカー(ノッチ)を動物の右肩に向けています(図2B)。
   2. マイクロマニピュレーターを使用して、最適なビューを調整します。画像コントロールパネルのコントロールを使用して、画像を最適化します。中室レベルで少なくとも 1 つの 2D B モード画像と 1 つの M モード画像を取得します。
   3. 特定の質問に必要な場合は、追加の画像を取得します。少なくとも 100 フレームと少なくとも 3(-6) の完全な心筋サイクルを取得します。
3. 傍胸骨短軸(PSSAX)ビューを実行します。
   注:PSSAXは、LVを短軸で視覚化するために実行されます。このビューから、例えば、左心室収縮末期容積(LVESV)、左心室拡張末期容積(LVEDV)、一回拍出量(SV)、および心拍出量(CO)を計算できます。
   1. 角度を変更せずに、トランスデューサーを時計回りに90°回転させます(マーカーが動物の左肩を指しています)(図2C)。基底、中室(乳頭筋のレベル)、および頂端ビューで少なくとも1つのBモード画像を取得します。
   2. 最も基本的なビューと最も先端的なビューを定義するには、長軸に沿って、LVチャンバーの全心周期がまだ表示されている最も遠いポイントまでスクロールします。乳頭筋のレベルでほぼ中間位置にある中室レベルで画像を撮ります。
   3. 心室中部ビューで少なくとも 1 つの M モード画像を取得します。
      注:一部の超音波装置は、さまざまなビューのプリセットを提供します。画像を取得する前に、適切なプリセットを確認することをお勧めします。
4. 頂端4チャンバー(4CH)ビューを実行します。
   注:4CHは、主にPWドップラーを使用して僧帽弁を評価するために使用できるため、重要です。
   1. 動物が頭を下にして変更されたトレンデレンブルグの位置にあるプラットフォームを傾けます。探触子をマウスの頭に向け、マーカーを動物の左側に向けています(図2D)。
   2. 少なくとも 1 つの B モード画像と、僧帽弁と三尖弁のカラードップラー画像と PW ドップラー画像を取得します。実験問題に応じて、4CHビューで組織ドップラーを適用します。
      注:頂端4CHの位置に到達する最も簡単な方法は、PSAXビューからテーブルを傾け、トランスデューサーを角度にすることです。胸部に圧力をかけすぎないように注意してください。拡張期機能などの測定を妨げる可能性があるためです。

4. ドブタミンストレスイメージング

注:目標心拍数に達したら、目標心拍数が安定している限り、標準化されたビューを取得する必要があります。これには通常、PSLAX と PSSAX の間で複数の切り替えが必要です。PSLAXとPSSAXの切り替えは90°回転するだけで済むため、ビューを簡単に画像化できます。

1. 比較可能性を確保するために、同じ麻酔を維持している1匹の動物でドブタミンストレステストを実施します。開始心拍数が400〜450 bpmの範囲で安定していることを確認してください。ECGの読み取り値を記録し、取得した画像と一緒に、また画像に保存します。ECG信号がクリアであることを確認してください。それ以外の場合は、明確なECG信号が表示されるまで、4つの手足すべてを再テープで固定してみてください。
2. 再度、PSLAXを実行しますview (BモードおよびMモード画像)。画像を「ベースライン」画像として保存します。必ず、保存し、初期心拍数も覚えておいてください。
3. シリンジを事前に充填し、27 Gの針と1 mLのシリンジを使用して、5 μg/g体重のドブタミンを腹腔内に注入します。.心拍数を注意深く監視します。目標心拍数に達するまで心エコー画像を記録し、心拍数の増加を後で分析するために使用します。ドブタミンの用量にもよりますが、約1分後に15〜30%の増加後に、ドブタミンによる持続的な有意な心拍数の増加が達成されます。.
   注:感染を防ぐために、すべての動物に常に使い捨ての滅菌注射針を使用してください。ドブタミン感受性および(準)最大負荷は、マウス系統によって異なり、実験設定に依存する可能性があり、実験前に定義する必要があります。ドブタミンの投与量を実験設定に合わせて調整することをお勧めします。.
   注意: 鋭利で感染する可能性のあるアイテムの使用については、機関のガイドラインに従ってください。針は常に承認された医療廃棄物容器に廃棄してください。
4. 目標心拍数に達し、約30秒間安定した状態が保たれたら、ステップ3で説明したようにPSLAX BモードおよびMモードの画像を取得します。
5. 再度、トランスデューサを時計回りに回転させて、ステップ3で説明したようにPSSAXビューを取得します。ここでは、基底部、中室(乳頭筋のレベル)、心尖レベル、心室中室(乳頭筋のレベル)レベルのBモード画像とMモード画像を取得します。目標心拍数が安定していることを確認して下さい。それ以外の場合は、PSLAXの位置に戻し、イメージングを再開します。
   注:ドブタミン¹² (この記事では説明していません)を連続的に注入しないと心拍数が低下するため、画像は2分以内に取得する必要があります。PSLAXおよびPSSAX画像は、関連する応力誘発測定のほとんどに不可欠です(「代表的な結果」セクションを参照)。
6. 次に、アピカル4CHビューを再度実行します(手順3.4で説明しました)。PWドップラーを使用して、目的のフローパターンを測定します(ステップ3.4.2で説明)。ストレスを受けていない条件下では、PWドップラーを使用して、心室の受動的な充填を表す2つの特性波(E(arly)波)と心房収縮後の能動的な充填(A(試行)波)を表します。心拍数が増加すると、これらの波は融合する傾向があり、ドブタミン誘発ストレス下では明確に測定できない場合があります。

5. 最終ステップ

1. 約5分後、心拍数が再び減少し始めると、すべてのビューがキャプチャされていることを確認してください。
2. 清潔な湿らせたペーパータオルを使用して、超音波ジェルを胸からそっと取り出します。テープ固定を慎重に取り外します。ひげを引き抜かないように、動物の頭を固定するテープには特に注意してください。
3. 麻酔をオフにしてください。アクティブガスエキゾーストを使用する場合は、必ずガス消耗を続けてください。起床期間中は、動物を分離した加熱ケージのペーパータオルの上に置きます。動物をよく観察してください。胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、放置してはいけません。目を覚まし、完全に回復したら、動物をケージに移します。
   注:この技術の非最終的性質のため、動物は関連するすべての規制に従って実験内にとどまることができます。

6. オフライン評価

1. 画像データをワークステーションのオフライン解析ソフトウェアに転送して、心機能の詳細な評価を行います。ストレスのない心機能とストレスを感じていない心機能の違いに特に注意してください。心拍数は常に記録して表示する必要があります。
   注: ソフトウェア分析はソフトウェアによって異なるため、このプロトコルでは説明しません。製造元の指示を参照してください。

Results

PSLAXで取得した生理学的無負荷心エコー画像を図3に示します。拡張期では、心室壁は均一に現れ(図3A)、ある程度厚くなります(図3B、C)。5 μg/g体重のドブタミンi.p.の注射は、心拍数(正のクロノトロピック効果)¹²およびLVEF(正の変力効果)の有意な増加をもたらす(図3、図6)。正の変力効果は、拡張期の左室前壁の肥厚 (LVAWd) と、収縮期 (LVAWs) と拡張期および収縮期の左室後壁 (LVPWd;LVPW) (図 3D

Discussion

ストレスによる心機能の評価は、運動試験や薬理学的^{ストレス試験を用いた}臨床現場でヒトに広く用いられている^6,7。マウスの運動直後の心エコー検査は鎮静の必要性のために非常に限られているため、ドブタミン誘発性ストレス心エコー検査は、ストレス誘発性心臓生理病理を評価するための最もトランスレーショナルな方法である可能性が高いです。心機能に関する信頼できる情報は、最終アプローチ²³におけるリアルタイムの圧力-体積分析を用いて得ることができる。心エコー検査は、長期的な検査に貴重な洞察を追加するため、3Rの原則(交換、削減、改良)の要件をさらに満たします。

患者におけるストレス心エコー検査の最も一般的な使用法は、壁の異常と心筋の生存率の検索、ならびに心臓弁膜症の評価であり、その重要性は最近のガイドライン^24,25

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
活性炭	フィルターUNO BV	180000140	http://www.unobv.com/Rest%20Gas%20Filters.html
Aquasonic 100超音波透過ジェル	カー研究所	001-02	https://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
化学脱毛ローション	一般供給	-
綿スワップ	一般供給	-
ddH2O	一般供給	-
ドブタミン	カリノファーム	71685.00.00
https://www.carinopharm.de/stammsortiment/#103 実験動物麻酔用流量計	UNO BV	SF3	http://www.unobv.com/Flowmeters.html
ガス排気ユニット	UNO BV	http://www.unobv.com/Gas%20Exhaust%20Unit.html
加熱ランプ	フィリップス	誘導
ボックス	UNO BV-http://www.unobv.com/Induction%20box.html
医療用鋭利物コンテナ	BD		305626 https://legacy.bd.com/europe/safety/de/products/sharps/
MX400超音波トランスデューサー(20-46 Mhz)	VisualSonics	MX400	https://www.visualsonics.com/product/transducers/mx-series-transducers
Octenisept消毒剤	Schuelke	173711	https://www.schuelke.com/de-de/produkte/octenisept.php
Omnican F注射針付き1ml	B.ブラウン	9161502S	https://www.bbraun.de/de/products/b60/omnican-f.html
ペーパータオル	一般供給	-
Signacreme電極クリーム	パーカー研究所	017-05	https://www.parkerlabs.com/Signacreme.asp
標準ガーゼパッド	BeeSana Meditrade	4852728
https://www.meditrade.de/de/wundversorgung/verbandstoffe/beesana-mullkompresse/ Thermasonicゲルウォーマー	パーカー研究所	82-03-20 CE	https://www.parkerlabs.com/thermasonic_apta_sbp.asp
トランスポアテープ	3M	1527NP-0	https://www.3mdeutschland.de/3M/de_DE/unternehmen-de/produkte/~/3M-Transpore-Fixierpflaster/
気化器 シグマデルタ	UNO	BV-http://www.unobv.com/Vaporizers.html
Vevo 3100 高周波前臨床超音波イメージングシステム	VisualSonics	Vevo3100	https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100 * 必要なソフトウェアパッケージ: 心臓血管パッケージ;Bモード、Mモード、パルス波ドップラーモード
Vevoイメージングステーション、レールシステム、加熱プラットフォーム、生理モニタリングユニット内蔵	VisualSonics-https://www.visualsonics.com/product/accessories/imaging-stations
VevoLab解析ソフトウェア	VisualSonics	Vers. 3.2.5	https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab *必要なソフトウェアパッケージ:Vevo Strain, LV analysis