ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

Summary

ベーカーの酵母ミトコンドリアゲノムは8つのポリペプチドをコードする。現在のプロトコルの目的は、すべてのラベルを付け、後で別々のバンドとして視覚化することです。

Abstract

ミトコンドリアは、好気性呼吸が可能な真核細胞の必須のオルガネラである。それらは円形ゲノムおよび遺伝子発現装置を含んでいる。ベーカー酵母のミトコンドリアゲノムは8つのタンパク質をコードする:シトクロムcオキシダーゼの3つのサブユニット(Cox1p、 Cox2p、およびCox3p)、ATPシンターゼ(Atp6p、Atp8p、およびAtp9p)の3つのサブユニット、ユビキノールシトクロムcオキシド還元酵素のサブユニット、シトクロムb(シtb)、およびミトコンドリアリボソームタンパク質Var1p。ここで説明する方法の目的は、これらのタンパク質を ^35Sメチオニンで特異的に標識し、電気泳動によってそれらを分離し、画面上の離散バンドとして信号を視覚化することである。この手順には、いくつかの手順が含まれます。まず、酵母細胞は、ガラクトース含有培地で、対数後期増殖段階に達するまで培養される。次に、シクロヘキシミド処理は細胞質翻訳をブロックし、ミトコンドリア翻訳産物でのみ ^35Sメチオニンの組み込みを可能にする。次に、すべてのタンパク質を酵母細胞から抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。最後に、ゲルを乾燥させ、蓄電池蛍光体スクリーンでインキュベートする。スクリーンはリンイメージャーでスキャンされ、バンドが明らかになります。この方法は、変異酵母株と野生型のミトコンドリアにおける単一ポリペプチドの生合成速度を比較するために適用することができ、これはミトコンドリア遺伝子発現欠陥の研究に有用である。このプロトコルは、全酵母ミトコンドリアmRNAの翻訳速度に関する貴重な情報を提供します。しかし、適切な結論を出すためには、いくつかの制御と追加の実験が必要です。

Introduction

ミトコンドリアは真核細胞の代謝に深く関与するオルガネラである。彼らの電子移動鎖はATP、複数の生化学的経路で使用される主要なエネルギー通貨を細胞に供給する。また、アポトーシス、脂肪酸、ヘム合成、その他のプロセスに関与しています。ミトコンドリアの機能不全は、ヒト疾患の有名な原因^である1.これは、オルガネラ²の構造成分または調節成分をコードする核またはミトコンドリア遺伝子の突然変異から生じる可能性がある。ベーカーの酵母 サッカロミセス・セレビシエ は、いくつかの理由でミトコンドリア遺伝子発現を研究するための優れたモデル生物です。まず、そのゲノムは完全に配列^3であり、よく注意を付けており、この生物で行われた長い調査の歴史のおかげで、すでに文献で大きなデータが利用可能です。第二に、核ゲノムによる操作は、その急速な成長速度と高効率の相同組換えシステムのために比較的迅速かつ容易である。第三に、パン酵母 S.セレビシエ は、ミトコンドリアゲノムによる操作が開発された数少ない生物の1つです。最後に、ベーカー酵母は、発酵可能な炭素源を含む培地で成長することができるので、呼吸欠陥変異体の単離と研究を可能にするエアロベ-嫌気性の栄養体です。

パン酵母 S.セレビシエ のミトコンドリア遺伝子発現を翻訳レベル⁴で研究する方法について説明する。その主な原理は、いくつかの観察から来ています。まず、酵母ミトコンドリアゲノムは8つのタンパク質のみをコードする:シトクロムcオキシダーゼの3つのサブユニット(Cox1p、 Cox2p、およびCox3p)、ATPシンターゼ(Atp6p、Atp8p、およびAtp9p)の3つのサブユニット、ユビキノール-チトクロムcオキシド還元酵素のサブユニット、シトクロムb(シtb)、およびミトコンドリアリボソームタンパク質^Var1p5。この数は少なくて、その全ては適切な条件で単一のゲル上で電気泳動により分離することができる。第二に、ミトコンドリアリボソームは真核生物⁶ではなく原核生物クラスに属し、したがって、抗生物質に対する感受性は酵母細胞質およびミトコンドリアリボソームにおいて異なる。シクロヘキシミドによる細胞質翻訳の阻害を可能にし、標識アミノ酸⁽³⁵S-メチオニン)がミトコンドリア翻訳産物にのみ組み込まれる条件を提供する。その結果、実験は、8つの製品のそれぞれに対するミトコンドリア翻訳の全体的な効率を反映して、デノボを合成したミトコンドリアタンパク質におけるアミノ酸の取り込み速度に関する情報を提供する。

Protocol

1. 酵母培養製剤

1. 適切な培地で新鮮なプレート上の冷凍ストック培養物から酵母をストリーク。24~48時間30°Cの培養器にプレートを入れます。
   注:温度感受性変異体は、許容温度で成長させてください。
2. イノキュレート酵母培養物は、15mLチューブ中の新鮮なストリークから2mLのYPGal培地(2%ペプトン、1%酵母エキス、2%ガラクトース)で、30°Cで200rpmで一晩撹拌してインキュベートする。
3. 600nmの波長で培養物の光学密度を測定する_(OD600)。
4. 滅菌チューブで0.2吸光度単位に相当する体積を取り、ペレット酵母細胞は室温で30sの9,000 x g で、上清を捨てます。
5. 5sの渦で0.5mLの無菌水で細胞を洗浄します。ペレット酵母細胞は室温で30sの9,000xgで上清を捨てる。 新鮮なYPGal培地の2 mLで細胞を希釈します。
6. OD 600が1.5~1.9の値に達するまで_、200 rpmおよび30 °Cで撹拌をインキュベートします。
   注:酵母の成長率はさまざまですので、待つ準備をしてください。早朝に1.3~1.6のステップを行うのが妥当です。通常は4~5時間かかりますが、時間は長くなります。

2. 放射性同位体の組み込み

1. マイクロ遠心チューブ内の1つの光学ユニットに相当する培養体積を移動します。3,000 x g でチューブを 1 分間回転させ、上清を捨てます。5sの渦で0.5mLの滅菌水で洗浄します。
   1. ペレット酵母細胞は室温で30sの9,000xgで上清を捨てる。 無菌翻訳バッファーの 0.5 mL で酵母細胞を再懸濁します。15 mLチューブに懸濁液を入れる。
      注:翻訳バッファーは、2%のガラクトース(w/v)と50 mMのリン酸カリウムとpH 6.0を含む溶液です。
2. 0.2 mg/mLの最終濃度まで細胞懸濁液にシクロヘキシミドを加えます。200rpmおよび30°Cで5分間撹拌するためにインキュベートし、細胞細胞翻訳を阻害する。
   注:シクロヘキシミド溶液(エタノール中20mg/mL)は、実験の前に新鮮な調製する必要があります。クロラムフェニコールは、同濃度⁷でアニソマイシンと置換に成功することができる。
3. ^35~30μCiの35 μCiを細胞懸濁液に加え、200 rpmと30°Cで30分間撹拌します。
   注 ^:35S-メチオニンと ³⁵Sシステインの混合物も使用することができます。純粋な ³⁵S-メチオニンは最も強い信号および最もよい信号対雑音比をもたらす。一般的に、メチオニンはミトコンドリアタンパク質におけるこのアミノ酸の含有量が高いため、システインよりも効果的である。しかし ^、35S-メチオニンとシステインのEasyTag混合物は、より安価であり、同等の結果を与える⁷.
   注意 ^:35S-メチオニンは放射性である。放射性物質の取り扱いについては、通常の安全慣行に従ってください。
   注:放射能の組み込みは、時間の経過とともに総信号がオフに達するため限界に達することはよく知られています。この制限に達すると、異なる翻訳製品が合成されるレートを決定することはほとんど不可能です。ミトコンドリア翻訳の速度を解析するには ^、35S-メチオニンとのインキュベーション時に信号強度が直線的に増加する状態であることが不可欠です。一般的な実験室の野生型株の場合、信号は30分よりもはるかに短いインキュベーション時間のためにすでに飽和しています。トランスレーショナルミュータントは非常に異なる動作をすることができます。少なくとも新しい株を扱う場合は、放射能の組み込み、したがって翻訳速度の運動を確立するために、時間コースを実行する必要があります。このために、数分間(例えば、2.5、5.0、7、5、10、20分)のサンプルを採取することをお勧めします。
4. ラベル付けされていない「冷たい」メチオニン(最終濃度は20 mM)とピューロミシン(最終濃度は1〜10 μg/mL)を加えて標識を停止します。200rpmおよび30°Cで10分間撹拌をインキュベートする。
   注:このステップは、リボソームにペプチドの翻訳を終了する時間を与えるために重要です。それ以外の場合は、全長より短いすべてのポリペプチドが異なるサイズで検出されます。このステップでは、ミトコンドリア翻訳製品の安定性を決定するために、タイムコース実験(パルスチェイス)を行うことができます。この場合は、30分間隔(例えば、30、60、90、および120分)のサンプルを取るインキュベーションを続けてください。

3. 酵母細胞のリシスとタンパク質の抽出

1. 30 sの9,000 x gで遠心分離によって酵母細胞を収集します。5sの渦で0.5mLの無菌水で細胞を洗浄します。ペレット酵母細胞は室温で30sの9,000xgで。 上清を捨てます。
   手記。プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは-20°Cで保存してください。
2. 75 μLのリシスバッファーをペレットに加え、渦を5~10秒に加えます。
   注意:溶解バッファーは、水の中で1.8 M NaOH、1 M β-メルカプトエタノール、および1 mM PMSFの溶液です。タンパク質のアルカリ加水分解につながるリシスバッファーによる過度のインキュベーションを避けてください。すぐにステップ 3.3 に進みます。
3. pH 6.8で0.5 Mトリス-HClバッファの500 μLを加えます。渦は簡単に。

4. タンパク質の沈殿

注意: メタノールとクロロホルムは有機溶媒です。有機物を取り扱う際の通常の安全慣行に従ってください。

1. 600 μL のメタノールをサンプルに加えます。5 sの渦。
2. サンプルにクロロホルムを150μL加えます。5 sの渦。
3. 12,000 x gで 2 分間のサンプルを遠心分離します。サンプラーで上のフェーズを慎重に廃棄します。
4. 600 μL のメタノールをサンプルに加えます。チューブを数回反転して慎重に混ぜます。
5. 12,000 x gで 2 分間のサンプルを遠心分離します。上清を捨てます。
6. ペレットを80°Cで2分間エアドライします。
   注:液体はすべて蒸発する必要があります。ペレットを十分に乾燥させなかった場合、ゲル中のタンパク質の異常分離を有するリスクがある。しかし、ペレットを過剰乾燥させることはできないので、4°Cで一晩保存することも可能です。
7. 沈殿タンパク質を60 μLの1xレムリサンプルバッファーに溶解します。
8. 40°Cで10分間加熱します。
   注:凝集を引き起こすので、95 °Cでサンプルを沸騰させないようにしてください。集計がまだ形成されている場合は、2分間12,000 x g でサンプルをスピンし、上清を収集します。サンプルは-20°Cで保存することができます。 プロトコルはここで一時停止することができます。

5. SDS-ページ

1. 17.5%レムリSDS-ポリアクリルアミドゲルをキャストします。
   注:6 M尿素をゲルに加え、より良いatp8とatp9を解決することができます。勾配 15%~20% ゲルも、より良い解像度を与えることができます。
2. 各サンプルの15 μL(40~50 μg)をポケットに入れてください。
   注:ステップ_1.6でOD600 値が近い場合は、タンパク質濃度を測定する必要はありません。もしそうでなければ、洗剤適合性試薬を用いてアッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。
3. 青い染料がゲル長の約65%に達するまで、冷たい部屋でゲルを実行します。
   注:使用されるシステム(例えば、プロテアンII xiセル)のために、我々は2つのモードのいずれかを使用する:5 V / cmで16-17 hまたは15 V / cmで5 h。タンパク質はブロモフェノールブルー染料よりも速く走るものはありませんが、長時間実行するとatp8およびatp9信号がぼやける可能性があります。
4. クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、ローディングコントロールとして必要とされるスキャンや写真を作ります。
   注:負荷制御を行う別の方法は、ミトコンドリアの「家事」遺伝子、例えばポリン1に対する抗体による免疫ブロッティングです。

6. オートラジオグラフィー

1. ゲルをゲル乾燥機で乾燥させます。蓄電池用蛍光体スクリーンを3~5日間カセットに入れておいてください。
   注:乾燥したゲルをスクリーニングする代わりに、その後に電気ブロッティングしてスクリーニングすることによって、ニトロセルロース膜へのタンパク質の移動があります。それはより強い信号および鋭いバンドをもたらす。
2. リンイメージャーで画面をスキャンします。
   注:蛍光体イメージングの代替として、X線フィルムを使用して信号を明らかにすることもできます。

Results

上述したプロトコルに従って、2つのS.セレビシエ株からミトコンドリア翻訳産物を割り当てた:野生型(WT)およびAIM23遺伝子の変異型軸受欠失(AIM23Δ)、ミトコンドリア翻訳開始因子3(表1)8をコードする。ミトコンドリア翻訳製品は、SDS-PAAG9で放射性標識および分離した。サンプルは、時間コースを構築するために飽和の前に2.5分ごとに収集しました(図1A)。ゲルを染色し、乾燥させ、5日間の博覧会の後にスクリーニングした(図1A)。

実験が成功した場合、図は標準パターン⁴に従って割り当てられた8つのバンドを示しています。しかし、個々のバンドの強度は、歪みや実験条件に応じて非常に可変することができます。各バンドは1つの翻訳商品に対応しています。データ(

Discussion

遺伝子発現の調査は、現代の生命科学の中心的な部分を占めています。この複雑なプロセスに関する洞察を提供する数多くの方法が開発されました。ここでは、ベーカー酵母S.セレビシエミトコンドリアにおけるタンパク質生合成へのアクセスを可能にする方法について説明した。通常、変異酵母株対野生型のミトコンドリアにおけるmRNAの翻訳効率を比較し、研究した突然変異の結果にアクセスするために適用される。これは、ミトコンドリア^{8、11、12、13}に影響を与えることを示唆する変異を有する酵母細胞のミトコンドリア機能を研究する際に研究者が行う基本的な実験の1つである。酸素消費率とミトコンドリア膜電位の測定と組み合わされることが多い。しかし、それが提供する情報は、遺伝子発現のどのような段階が影響を受けるかを区別するのに十分ではありません。それを見つけるためには、追加の実験が必要です。まず、転写ス...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M3148
アクリルアミド	Sigma-Aldrich	A9099
過硫酸アンモニウム	Sigma-Aldrich	A3678
細菌寒天	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave細胞密度計 CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
ブランド標準使い捨てキュベット	Sigma-Aldrich	Z330361
クロロホルム	Sigma-Aldrich	288306
シクロヘキシミド	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-ガラクトース	シグマ-アルドリッチ	G5388
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G7021
デジタルブロックヒーター	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq)、安定化水溶液	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-メチオニン	Sigma-Aldrich	M9625
メタノール	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-メチレンビスアクリルアミド	Sigma-Aldrich	M7279
ニューブランズウィック イノーバ 44/44R シェーカーインキュベーター	ニューブランズウィック科学
肉からのペプトン、細菌学	ミリポア	91249
フェニルメタンスルホニルフッ化物	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
水酸化ナトリウム	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 蛍光体イメージャー	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
真空加熱ゲルドライヤー	クリーバーサイエンティフィック	CSL-GDVH
酵母抽出物	Sigma-Aldrich	Y1625