マイクロパターン配列を用いた単一細胞からの蛍光レポータータイムコースの取得方法を紹介する。このプロトコルは、単一細胞アレイの調製、ライブセルスキャンタイムラプス顕微鏡のセットアップと動作、および接着部位あたりの細胞統合蛍光時間コースの自動事前選択、視覚制御および追跡のためのオープンソース画像分析ツールを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングは、高スループットで個々の細胞からの蛍光信号の時間コースを収集するための汎用性の高い方法です。一般に、培養細胞からの単細胞時間コースの獲得は、細胞の運動性および細胞形状の多様性によって妨げられる。接着剤マイクロアレイは、単一細胞条件を標準化し、画像解析を容易にします。LISCAは、単一細胞マイクロアレイと、走査時間経過顕微鏡と自動画像処理を組み合わせたものです。ここでは、単細胞蛍光時間コースをLISCA形式で取る実験ステップについて説明する。また、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)用のmRNAコードを用いて微小パターン配列に付着した細胞をトランスフェクトし、走査時間経過顕微鏡を介して数百個の細胞のeGFP発現動態を並行して監視します。画像データスタックは、選択した細胞の輪郭に蛍光強度を統合して単一細胞蛍光時間コースを生成する新開発のソフトウェアによって自動的に処理されます。mRNAトランスフェクション後のeGFP発現時間コースは、mRNAの発現および分解率を明らかにする単純な運動翻訳モデルによって十分に記述されていることを実証する。アポトーシスのシグナル伝達の文脈における複数マーカーのイベント時間相関に対するLISCAのさらなる応用が議論される。
概要
近年、単細胞実験の重要性が明らかになってきた。単一細胞からのデータは、細胞間変動、細胞内パラメータ相関の分解能、およびアンサンブル測定1、2、3に隠されたままの細胞動態の検出の調査を可能にする。数千個の単一細胞の細胞動態を並行して調べるには、数時間から数日間の期間にわたって標準化された条件下で細胞を監視し、定量的なデータ分析4を行う新しいアプローチが必要である。ここでは、マイクロ構造化アレイとタイムラプス顕微鏡と自動画像解析を組み合わせた単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングを紹介します。
マイクロ構造化単一細胞アレイを生成するためのいくつかの方法が確立され、文献5,6に掲載されています。ここでは、マイクロスケールのプラズマ開始タンパク質パターニング(μPIPP)について簡単に説明します。μPIPPを用いた単一セルアレイ製作の詳細なプロトコルは、リファレンス7にも記載されています。単一細胞配列を用いると、各細胞に対して定義された微小環境を提示する標準化された接着スポッ....
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プロトコル
図2:単細胞マイクロアレイ(A)と走査タイムラプス顕微鏡(B)を組み合わせたデータ取得タイムラプス実験の準備として、2Dマイクロパターンの接着四角形を持つ単一細胞配列を用意し(1)、続いて細胞播種とマイクロパターン上の細胞の位置合わせ(2)、および6チャンネルスライドへの灌流システムの接続を行い、タイムラプス測定中の液体処理を可能にする(3)。走査タイムラプス実験(4)を設定し、細胞は、タイムラプス実験(5)の間に灌流系を介してmRNAリポプレックス溶液を注入することによって顕微鏡にトランスフェクトされる。スケールバー:200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. マイクロストラクチャード単一セルアレイ製造 (図2A)
- μPIPPアレイの製造....
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結果
LISCAアプローチは、単一細胞から効率的に蛍光時間コースを収集することができます。代表的な例として、トランスフェクション後の単細胞eGFP発現を測定するためにLISCA法がどのように適用されるかの概要を示す。LISCA実験のデータは、効率的なmRNA薬の開発に重要であるmRNA送達キネティックスを評価するために使用されます。
特に、翻訳の時点の発症と発現速度に関する2つの脂質ベースのmRNA送達系の影響を単細胞レベルで示す。細胞を培養し、そのバッチを2つの集団に分けた。プロトコルセクションに記載されているように、1つの亜集団がリポプレックスでトランスフェクトされた。他の亜集団は、同じ最終mRNA濃度を有する同じmRNAを用いてトランスフェクトしたが、送達系として脂質ナノ粒子(LNP)を用いて、マイクロ流体混合12を用いて製造した。異なる脂質組成とリポプレックスとLnPsのmRNA送達系の異なる製造のために、我々は取り込み動力学が影響を受けるべきであるように翻訳キネティクスに影響を与えることを期待する。LISCA法を用いて、トランスフ.......
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ディスカッション
ここでは、単細胞レベルで細胞内蛍光標識の細胞動態に従う多目的技術としてLISCAを説明した。LISCA実験を成功させるためには、プロトコルセクションの各ステップを個別に確立し、すべてのステップを組み合わせる必要があります。LISCAの3つの主要な側面のそれぞれは、重要なステップを備えています。
単一細胞マイクロアレイ製造
マイクロアレイの細胞の位置合わせは、さらなる実験ステップだけでなく、データ品質にも影響を与えるため、マイクロアレイの品質は非常に重要です。このため、パターンの幾何学および製造方法は、使用される細胞に対して適合されなければならない。本稿で説明した代表的な結果は、肝臓癌細胞株HuH7が(30μm)2の正方形のパターンに整列して生成された。このパターンジオメトリは、A549 や HEK293 などの他のセルラインにも適しています。BEAS-2B のような大きなセルでは、35 μm のエッジ長と 80 μm の 2 乗距離を持つ大きな正方形パターンを使用できます。記載された播種手順はHuH7細胞に対して最適化されるが、他の多く.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
謝辞
この研究は、ドイツ科学財団(DFG)から共同研究センター(SFB)1032への助成金によって支援されました。ドイツ連邦教育研究技術省(BMBF)による協力プロジェクト05K2018-2017-06716メディソフトの支援とバイエリッシェ・フォルシュングスシュティフトゥンからの助成金は感謝しています。アニタ・ライナーは、ミュンヘン(QBM)の定量バイオサイエンス大学院を通じてDFGフェローシップによって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アドテックポリマーエンジニアリングPTFEマイクロチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 10178071 | |
| ベーキングオーブン | バイン | ダー9010-0190 | |
| CFIプランフローDL 10x | ニコン | MRH20100 | |
| デシケーター | ロス | NX07.1 | |
| クリプスTi-E | ニコン | ||
| eGFP mRNA | トライリンク | L-7601 | |
| メスルアーチューブコネクタ | MEDNET | FTL210-6005 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャー | 10270106 | |
| フィブロネクチン | Yo タンパク質 | 663 | |
| フィルターセット eGFP | AHF | F46-002 | |
| フィッシャーブランド 半透明のプラチナ硬化シリコーンチューブ | フィッシャーサイエンティフィック | 11768088 | |
| HEPES (1 m) | サーモフィッシャー | 15630080 | |
| インキュベーションボックス | Okolab | OKO-H201 | |
| インキュベーター | バインダー | 9040-0012 | |
| L-15 フェノールレッドなし | サーモフィッシャー | 21083027 | |
| リポフェクタミン 2000 | サーモフィッシャー | ||
| テフロン製 | |||
| チューブ コネクタ | MEDNET | MTLS210-6005 | 代替品 社内製造オス ルアー |
| NaCl (5 M) | サーモ フィッシャー | AM9760G | |
| ニードルレス バルブ - オス ルアー コネクタ | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS エレメント | ニコン | イメージングソフトウェア バージョン 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | チューブシステムアセンブリ用高速硬化光学接着剤 |
| Opti-MEM | サーモフィッシャー | 31985062 | |
| PCO エッジ 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS) | 社内で調製された | ||
| プラズマクリーナー | ディーナー フェムト | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| シリコンウェーハ mit mircorstructures | 社内で製造された | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| スティッキースライド VI 0.4 | 同上 | 80608 | |
| シルガード 184 シリコーン エラストマー キット | ダウ コーニング | 1673921 | |
| タンゴ 2 | Märzhäユーザー | 00-24-626-0000 | |
| 超純水 | 社内調製 | ||
| コーティングされていないカバースリップ | 同上 | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | (交換用スポーン付き |
参考文献
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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再版と許可
