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方法論記事

細胞透過性ペプチドによる膜不安定化を調べる蛍光漏れアッセイ

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DOI:

10.3791/62028

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2020年12月19日

 ,  ,  ,  , 
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

この記事について

サマリー

蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。

要約

細胞貫通性ペプチド(CpP)は、細胞膜を横断し、細胞に貨物を移動することができるキャリアとして定義されます。この活性に必要な主な共通の特徴の1つは、CCPと血漿膜(脂質)の相互作用、特に膜自体の細胞外マトリックス(ヘパラン硫酸塩)の成分との相互作用から生じる。実際、直接転位またはエンドサイトーシス依存の内在化とは無関係に、脂質二重層は、細胞膜のレベルと細胞内トラフィック(内皮小胞)のレベルの両方で内在化プロセスに関与している。本稿では、蛍光漏れ測定法における大ユニラメラ小胞(LUV)製剤の様々なステップを説明する詳細なプロトコルを紹介し、CPP膜不安定化/相互作用の可能性を検出し、内部化メカニズムにおけるそれらの役割に対処する。細胞膜含量を反映した脂質組成物を有するRVは、蛍光色素とクエンチャーの両方を封入するために生成される。また、発光培地にペプチドを添加し、また、LUV上でのペプチド膜相互作用の誘導は、このように、蛍光の有意な増加を漏出を明らかにする用量依存的に誘導する可能性がある。例は、最近開発されたトリプトファン(W)-およびアルギニン(R)が豊富なアンフィパシーペプチド(WrAP)を備えており、様々な細胞株における迅速かつ効率的なsiRNA送達を示した。最後に、これらの相互作用の性質と脂質に対する親和性を理解し、膜転座および/または内膜脱出を改善するために議論される。

概要

90年代に発見された後、細胞透過性ペプチド(CpP)は、原形質膜1,2を介した貨物の効率的な細胞送達を促進するために開発された。CpPは、通常、短いペプチド、一般的に8〜30個のアミノ酸、多種多様な起源を有する。彼らは最初に「直接転位」キャリアとして定義され、細胞膜を横断し、エネルギー要件も受容体関与も含み無い任意のエンドサイトー状態経路とは無関係に細胞に貨物を移すことができたことを意味する。しかし、さらなる調査は、これらの最初の観測は、主に、実験用アーティファクトおよび/またはメタノール3を用いた固定プロトコルによる蛍光過大評価から来たことを明らかにした。今日では、CPPの取り込みは、貨物の性質、CPPと貨物の間の使用リンク、研究されたセルラインなどの異なるパラメータに応じて、エンドサイトーシスとエネルギー独立転座4、5、6、7の両方で行われることが広く受け入れられています。

CpPは、CPPとその貨物8、9、10、11との間の化学的リンク(共有戦略)または静電/疎水性相互作用(非共有性戦略)を含む2つの戦略に従ってトランスフェクション剤として使用することができる。両方の戦略は、いくつかの貨物の細胞移動における効率を示しているが、CCPによる内在化のメカニズムの理解は依然として論争の下にあり、エンドサイトーシス経路または直接浸透間のバランスは12,13を測定することは依然として困難である。一連の実験ツールと戦略は、エンドサイトのプロセスの関与に明確に対処するために利用可能であるが、直接転位は、しかし、それは形質膜成分とのより離散的な相互作用を意味するので、より特徴付けが難しいようです。生体膜は通常、リン脂質から膜タンパク質まで、細胞の種類や環境(ストレス条件、細胞分裂など)によって異なる多くの成分で構成されています。この組成物の多様性、そして結果的に普遍的な細胞膜モデルの欠如は、単一の方法での研究を可能にしません。しかし、これらの限界を回避するために、ステップバイステップのアプローチは、人工膜または膜抽出物で開発された。小さな単層小胞から単層のアプローチまで、すべてのモデルは明らかに特定の質問14、15に答えるために関連していた。中でも、大きな単層小胞(RV)は、ペプチド/膜相互作用を内部化プロセスの重要なポイントとして研究するための適切な膜模倣モデルを構成しています。

この文脈において、以下のプロトコルは、陰イオン蛍光色素とリポソームに封入された対応するポリカチオンクエンチャーの両方のモニタリングを通じて、ペプチドおよびペプチド/膜相互作用がLUVの完全性に及ぼす影響の調査を記述する。このツールは、直接膜転座を行うことができるかどうかを理解するために、CPP/膜相互作用を研究するために使用されます。通常は異なる膜相互作用ペプチドを比較するために適用されますが、このLUV蛍光漏れアッセイは、CpPs-貨物コンジュゲート(共有戦略)とCPP:貨物複合体(非共有戦略)の両方を調査するためにも使用できます。

本プロトコルは、最近開発されたトリプトファン(W)とアルギニン(R)が豊富な媒性ペプチド(WRAP)16で最初に例示される。WRAPは、ペプチドベースのナノ粒子を形成し、いくつかの細胞株16において小さな干渉RNA(siRNA)を迅速かつ効率的に送達することができる。WRAPペプチド単独またはsiRNA搭載WRAPベースナノ粒子の蛍光漏れ特性をモニタリングし、細胞内在化のメカニズムを特徴付けた。我々は、内部化のメカニズムが主に直接転座7を含むことを示した。第2の例では、WRAPペプチドをタンパク質/タンパク質干渉ペプチドiCAL36(WRAP-iCAL36)17に共有結合し、膜を不安定化させる能力を、penetratin 18(Penetratin-iCAL36)と結合したiCAL36に対する蛍光漏れアッセイで比較した。

最後に、この方法の利点と限界は、技術的な観点から、生物学的関連性に関して議論される。

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プロトコル

1. 大型ユニラメラベシクル(RV)の調製

  1. 蛍光漏れ測定のための細胞膜模倣として使用するためのLUVを準備します。
  2. ハミルトンガラス注射器ホスファチジルコリン(DOPC、786.11 g/mol)、スフィンゴミエリン(SM、760.22 g/mol)、コレステロール(Chol、386.65 g/mol)をモル比4:4:2で混ぜます。脂質溶液は、25 mLガラス丸底フラスコで25mg/mLのメタノール/クロロホルム(3/1;体積/体積)溶媒で可溶化した各脂質のストック溶液から得られます。4 μmolの DOPC、4 μmol SM、および 2 μmol の Chol に基づいて、脂質溶液は、それぞれ 126 μL、117 μL、および 31 μL を混合してストック溶液から得られます。
    注意:メタノールは有毒で可燃性の溶媒であり、クロロホルムは有毒で発がん性があります。どちらもフードの下で適切な保護で処理する必要があります。
  3. 乾燥した脂質膜の形成まで60°Cで45〜60分の真空下でロータリーエバポレーターを使用してメタノール/クロロホルムを蒸発させます。
  4. 2つのストックHEPESバッファソリューションを準備します。HEPES バッファー 1 を 20 mM HEPES (238.3 g/mol) と 75 mM NaCl (58.44 g/mol) を混合して準備し、pH を 7.4 に調整します。20 mM HEPES と 145 mM NaCl を混合して HEPES バッファー 2 を準備し、pH を 7.4 に調整します。HEPESバッファーは、4°Cで1ヶ月間保存することができます。
    メモ:オスマメーターを使用してバッファの浸透圧を確認することをお勧めします。
  5. 膜不浸透性蛍光色素クエンチャーカップル、8-アミノナフタレン-1、3、6-トリスルホン酸、12.5mM(ANTS、427.33 g/mol)の二ナトリウム塩、45 mM(DPX、422.16)の臭化液中にp-キシレンバイスピリジウム臭化物を溶解して脂質水和液を調製する。DPXとアリを混合すると、黄色の溶液が出ます。12.5 mMのANTSと45 mMのDPXの濃度を達成するために、HEPESバッファー1の4 mLにそれぞれ21.4mgおよび76mgを溶解する。
    注:脂質ハイドレーション溶液は、チューブをアルミホイルで包むことで4°Cで2週間保存することができます。
  6. リコンセシスマルチラメラ小胞(MLV)は、乾燥した脂質水和溶液の1mLで乾燥した脂質膜を再懸濁し、乾燥した脂質膜を溶解するまでボルテックスすることにより行う。小さな脂質凝集体が前のステップに悪影響を及ぼすため、溶液が完全に可溶化していることを確認してください。また、ガラス丸底フラスコの壁面を確認して、残っている脂質フィルムがないことを確認します。
    注: 溶液は可溶化後に青白色と淡黄色で表示されます。
  7. 小胞を5回凍結/解凍サイクルにして、単層小胞を得る。凍結ステップのために液体窒素に30sのガラス丸底フラスコを入れて、解凍ステップのために2分間水浴に残すことによって、各サイクルを実行します。
    注:浴水の温度は、脂質の溶融温度よりも5〜10°C高くする必要があります。
  8. 2つのフィルターを挿入して脂質押出機を準備し、各ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)押出機片にHEPESバッファーを用いて予備加湿をサポートし、金属押出機キャニスターに入れ加工する。
  9. 1つのフィルターサポートの上部にHEPES加湿ポリカーボネート膜(0.1 μmの細孔サイズ、直径25mm)を入れます。
  10. 2つの金属押出機キャニスターを組み立て、ねじ込みます。
  11. 組み立てた押出機をホルダーに入れ、各ポリテトラフルオロエチレン押出機片の先端部に適当な穴に1mLシリンジを導入します。押出は、ポリカーボネート膜を通して一方のシリンジから他方への検査された液体の通過に相当する。
  12. 1 mL シリンジの 1 つに HEPES バッファーを 1 mL ロードして押出機をテストし、漏れや問題がないことを確認します。
  13. 1 mL HEPES バッファーを MLV サンプルに交換します。
  14. MLVサンプルを一方のシリンジから他方のシリンジに少なくとも21回通し、同じサイズの均一なRVを得ることによって押出を行う。
    注:押出は、脂質混合物の溶融温度よりも高い温度で行われるべきです。

2. ルブの浄化

  1. 非カプセル化されたANTSおよびDPX過剰を除去するためにカラム精製を準備する。
  2. 液体クロマトグラフィーカラム(ルアーロック、ノンジャケット、1.0cm x 20cm、ベッド容積16mL)に0.01%NaN 3(65g/mol)を含む水媒体に再懸濁された架橋デキストランゲル(G-50)を、無色部分の上部から1cm下に1cm下に導入します。
  3. タップを開き、液体を流して架橋ドキストランゲルを落ち着かせる。
  4. 20mLのHEPESバッファー2で溶出してカラムを洗浄し、カラムの出力フローを廃棄します。
  5. カラム上の溶媒のデッドボリュームが最小になったら(<100 μL)、架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるために十分な後にタップを閉じます。
  6. 押し出したてのSUV(黄色)をコラムに置き、架橋されたデキストランゲルに入ります。
  7. 列にHEPESバッファー2を連続的に加え、LUV精製を行う。
  8. 約2mLのHEPES緩衝液2(架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるためにカラムの上部を定期的に充填することを忘れないでください):フリーイエローANTSおよびDPX溶液はリポソームよりも遅く移行します。
  9. チューブ(1.5 mL)内の精製されたLUVの収集を開始します。
  10. カラムからの溶離液の滴を観察し、それらが乳白色になると、リポソームが含まれています。チューブを変更して、LUV含有分率を回復します。
  11. 滴がもはや青白色(〜1 mL)になるまでエルテ。その後、別の分数で別の0.5 mLを溶出し、溶出を停止します。
    注: キットや個々の分子量として、UV の溶出量を校正するために、幅広い分子量で規格が利用可能になりました。
  12. 蛍光色素の漂白を避けるために、チューブをアルミニウム箔でチューブに包みます。
  13. 20 mL HEPES バッファー 2 でカラムを洗います。
  14. その後、RVは4°Cで1週間保存することができます。
    注意:LUVの安定性は、LUVの濃度と構成、およびイオン強度に依存する可能性があるため、LUVのサイズはダイナミック光散乱(DLS)機器を使用して制御する必要があります(セクション4を参照してください。各テストの前に、LUV サイズと同質性の特性を示します。

3. LUV の濃度を定量化する

  1. リン脂質定量キットによるLUV濃度を推定し、コリン濃度19の評価を可能にする。このアッセイは、極性頭部を含むコリンを含むリン脂質が実質的である場合に適用される可能性があります(rvvの>50%)。
  2. 18mgのクロモーゲン基質を3mLのバッファーに溶解して色試薬を調製する。
  3. ポリスチレンキュベットをロード, 10 x 10 x 45 mm, 色試薬の 3 mL.
  4. 純色試薬をブランク条件(ブランク)として使用してください。LUVサンプル(テスト)または既知のコリン濃度の標準溶液の20 μLを追加します(標準)。
  5. よく混ぜ、37 °Cのすべての条件(ブランク、テスト、および標準)で5分間インキュベートします。
  6. 試験試料の吸光度(光学密度、OD)を測定し、スペクトロフォトメーターで600nmでコントロールするブランク溶液を用いて標準溶液を測定します。
  7. 既知の濃度の標準と比較して、コリン相当のRVの脂質濃度を推定することを可能にするOD値をチェックしてください。
  8. 次の式を使用して計算を実行します。
    C[LUV] (モル / l) = (OD サンプル / OD 標準) x C[標準] (モル / l)
    注:リン脂質定量キットは、C[標準]=3.87 mmol/L.ODサンプルおよびOD標準のモル濃度に対応する54mg/dLのコリンクロライド(139.6 mg/l)標準溶液を提供し、それぞれLUVおよびコリン溶液の吸光度を600nmで測定した。

4. LUVサイズと均質性の特性

  1. LUV サイズ (nm) と多分散インデックス (PdI) を決定するために、DLS 計測器を使用して測定を実行します。
  2. 溶媒/バッファーおよび使用済キュベットの粘度を示すことによって、適切な「標準操作手順」(SOP)をプログラムします。
  3. 500 μL の LUV 溶液をポリスチレンセミマイクロキュベットに入れる。
  4. DLS装置にポリスチレンセミマイクロキュベットを挿入します。
  5. 室温では、粒子分布と均質性(多分散指数、PdI)の平均サイズ(Z平均)の観点からサイズ分布を測定する。
  6. すべての結果は、3つの繰り返しサイクルでそれぞれ実行される2つの独立した測定から得られます。
    注: LUV の標準値は、0.149 ± 0.041 の PdI で 137 ± 7 nm の平均サイズになります。

5. ペプチド溶液の調製

  1. 漏れアッセイのために分析されるべきペプチドのストック溶液を準備する。
  2. ペプチド粉末(>純度>)を純水(例えば、純水500μLで1mgのペプチド)に溶解します。
    注:ペプチドを純水中で希釈し、ジメチルスルホキシド(DMSO)の可溶化を避けることを推奨し、人工物を誘導する可能性があります(例えば、膜透過20)。
  3. 5 sのペプチド溶液をボルテックスする。
  4. 5分間水超音波浴でペプチド溶液を超音波処理し、12,225 x gで5分間遠心分離します。濃度決定のために上清を収集します。
  5. 3つの独立したペプチド希釈液の280 nmで吸光度を測定し、そのモル絶滅係数ε(ペプチド配列中のトリプトファンおよびチロシン含有量に依存する)およびビール・ランバート規則を用いてペプチド濃度を計算します。
    注:ペプチドにトリプトファンおよびチロシンが含まれている場合、εモル絶滅係数はトリプトファンε= 5,690 M-1cm-1、チロシンε= 1,280 M -1 cm-1に基づいて計算されます。ペプチド配列にトリプトファンまたはチロシンが含まなければ、他の着色アッセイを行って濃度を測定することができます(例えば、BCAまたはブラッドフォード)。
  6. 純水でペプチド溶液を希釈し、最終溶液100μMにし、4°Cで保存します。
    注:純水では、4°Cの保存中にペプチド分解は起こりません。しかし、水の蒸発が起こらないように、2週間ごとにペプチド濃度を測定する必要があります。

6. 蛍光漏れ測定

  1. 蛍光漏れ測定は、室温の分光蛍光計で測定されます。励起波長および発光波長はEx= 360 nm ±3 nm、Em = 530 nm ± 5 nm でそれぞれ 5 nm に固定されています。
  2. 1 mL HEPES バッファー 2 の LUV を、水晶蛍光キュベットで 100 μM の最終濃度に希釈します。磁気攪拌機を加えて、実験中に溶液を均質化します。
  3. バックグラウンド蛍光にアクセスするには、最初の100 s(t = 0 sとt = 99 sの間)で単独でLUVを測定します。
    注: RV 単独は、バックグラウンドの蛍光と潜在的なリークにアクセスするために、実験全体(15 分)の間に測定することもできます。
  4. その後、次の900s(15分)に対するペプチド溶液のアリコートを添加した際の蛍光強度の増加として漏れを測定する。このプロトコルは、0.1 μMから2.5 μMまで試験したペプチドの濃度ごとに実行されます。
  5. 最後に、トリトンX-100(0.1%、v/v)の1μLを加えてLUVを可溶化することで100%蛍光を得て、t= 1,000 sとt=1,100sの間で完全に消し止められていないプローブを得ました。

7. 漏出の定量化

  1. テストされた各条件で同じポイント数を維持するために、t = 1,090 s の後に取得された値を抑制します。
  2. 最小蛍光 F分を計算するには、t = 0 s と t = 49 s (LUV 単体) の間の平均 50 ポイントを作成します。
  3. t = 1,041 s と t = 1,090 s (Triton X-100 を持つ LUV) の間の平均 50 ポイントを作ることによって、最大蛍光 Fmaxを計算します。
  4. 次の式に従って、各時点(t = x)における漏れ率(%リーク)を計算します。
    %リーク(t=x) = (F(t=x) - F最小) / (F最大 - F最小値) x 100
  5. 同じ条件に対して異なる LUV 準備 (n ≥ 2) で取得された値の平均と標準偏差を計算します。
  6. 時間の関数で漏れ率%リーク(t=x)をプロットします。

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結果

蛍光漏れ測定の原理を 図1に示す。詳細には、蛍光色素とクエンチャー(蛍光シグナルなし)をカプセル化した大きなユニラメラ小胞(RV)を、目的の生体分子で処理します。脂質膜とのペプチドの相互作用により、膜透過性、再編成、あるいは破裂を意味する可能性があるため、蛍光色素およびクエンチャーは、RVから放出される。バッファー内のその後の希釈は、増加した蛍光シグナルをもたらす。

このスキームは、自由なペプチドを用いたテストを表示しますが、システムの利点は、脂質膜を不安定化させる疑いがある貨物共役ペプチド、ペプチドベースのナノ粒子または他の生体高分子もテストする能力にあります。特に試験された分子に関してプロトコルの予備的な最適化が必要であるが、この蛍光漏れアッセイは、膜相互作用成分の多種多様に拡張されるかもしれない。本プロトコルでは、CCPとそれらの複雑化(非共有戦略)または共役(共有戦略)形式で得られたい...

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ディスカッション

提示された蛍光漏れアッセイは、細胞透過性ペプチドによる膜不安定化に対処するための簡単で迅速な方法です。容易に行うと、それはまた、異なる膜相互作用ペプチドまたは他の膜相互作用分子間の間接的な比較を可能にする。プロトコルの重要なステップに関しては、このアッセイはベースライン(LUV単独)と最大蛍光放出(トリトン条件)の間の相対的な値を提供するので、通常、我々は、LUVのコリン寄与のみを推定するリン脂質定量化キットを用いて、RVの濃度を評価する。しかし、Rouserと同僚27と同僚27 によって説明された酸消化によって、またはBartlett28 またはリン脂質を含むアンモニウムフェロチオシアネートを用いた着色法によって、より正確なLUV濃度の測定を含めることもできる。私たちの手では、漏出の相対的な定量化や膜相互作用ペプチド間の比較に影響を与えません。

LUV の使用に関しては、LUV のベースラインの状態を制御して、それらが使用可能であるかどう...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

著者たちは、エミリー・ジョッセが原稿の批判的なレビューに感謝したいと思います。この作品は、財団「ラ・リーグ・コントル・ル・ガン」「フォンダシオンARCはラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンを注ぐ」、そして「センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック」(CNRS)によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
25 mL ガラス丸底フラスコPyrex
8-アミノナフタレン-1, 3, 6-トリスルホン酸, 二ナトリウム塩 (ANTS)InvitrogenA350光から保護する 
クロロホルム Sigma-Aldrich288306
コレステロールSigma-AldrichC8667
DOPC (ジオレオイルホスファチジルコリン)Avanti Polar850375P空気から保護
押出機Avanti Polar610000
FluorimeterPTI Serlabo
50 & micro;LガラスシリンジHamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
LabAssay Phospholipid 和光 296-63801
液体クロマトグラフィーカラムSigma-Aldrich
メタノールCarlo Erba414902
Nuclepore ポリカーボネートメンブレン (0.1 & micro;m孔径、直径25 mm)Whatman800309
ポリスチレンキュベット、10 x 10 x 45 mmGrener Bio-One614101
ポリスチレンセミマイクロキュベット、DLSFisher ScientificFB55924
p-キシレン-ビスピリジニウムブロマイド(DPX)InvitrogenX1525光から保護する 
石英蛍光キュベットHellma109.004F-QS
rotavapor system ハイドルフZ334898
セファデックス G-50 樹脂アマシャム17-0042-01
アジ化ナトリウム (NaN3)Sigma-AldrichS2002
塩素酸ナトリウム (NaCl)Sigma-AldrichS5886
ソニケーター バス USC300TVWR142-6001
スフィンゴミエリンAvanti Polar860062P空気から保護する
トリトンX-100 Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS マルバーンZEN3500

参考文献

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