チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

リグニンは、植物細胞壁の重要な耐荷重成分の1つであり、地球上で2番目に豊富なポリマー^である。化学的には、リグニンは、芳香族ポリマーの自然な再生可能な供給源を形成し、生体材料^2、3の天然の再生可能な供給源を形成する高分子量の複合フェノール化合物で構成される架橋ヘテロポリマー^である。この天然ポリマーは、植物の成長、発達、生存、機械的支持、細胞壁剛性、水輸送、鉱物輸送、宿泊抵抗、組織および臓器の開発、エネルギーの沈着、および生物および非生物^{的ストレス4、5、6、7}からの保護において重要な役割を果たす。リグニンは主に3つの異なるモノリニョールで構成される:針葉ニル、シナピルおよびp-コマリルアルコールはフェニルプロパノイド経路^8、9に由来する。リグニンの量とモノマーの組成は、植物種、組織/器官の種類、および植物の開発の異なる段階に基づいて異なります¹⁰.リグニンは、ソースとモノリグノール組成物に基づいて、針葉樹、広葉樹、および草リグニンに大別される。針葉樹は、主に4%p-コマリルと1%のシナピルアルコールと95%の針葉樹アルコールで構成されています。硬質木材は、同じ割合で針葉樹およびシナピルアルコールを有し、一方草リグニンは針葉樹、シナピルおよびp-コマリルアルコール^11、12の様々な割合で構成されている。単量体の組成は、細胞壁のリグニン強度、分解、分解、分解、ならびに分子構造、分岐、および他の多糖類^13,14との架橋を決定する際に極めて重要である。

リグニン研究は、採餌、繊維産業、製紙産業、バイオエタノール、バイオ燃料、バイオ製品の重要性を増^{しています。}各種化学方法(例えば、臭化アセチル、酸洗剤、クラソン、過マンガン酸酸化)と共に、インストゥルメンタル法(例えば、近赤外(NIR)分光法、核磁気共鳴(NMR)分光法、および紫外線(UV)分光法)を用いた^9,17。リグニンの分析方法は、一般に電磁放射、重力測定、および溶解度に基づいて分類される。電磁放射によるリグニン推定の原理は、特定の波長で光を吸収するリグニンの化学的性質に基づいていました。これらの結果は、リグニンが炭水化物よりも強いUV吸光度を有するという原理に基づいて推定された。1962年、ボルカーとサマヴィルは、塩化カリウムペレットを使用して、木¹⁸のリグニン含有量を推定しました。しかし、この方法は、非リグニンフェノール化合物の存在および適切な絶滅係数の欠如による草本サンプルからのリグニン含有量の推定に欠点がある。1970年、ファーガスとゴリングは、グアイアシルおよびシリンギル化合物吸収マキシマが280nmおよび270nmであることを発見し、ボルカーおよびサマヴィル法¹⁹の絶滅係数問題を修正した。その後、フェノールを特徴付けるための高感度技術である赤外線分光法が、少量の植物バイオマスサンプルによるリグニン推定にも用いられた。このような技術の一例は、拡散反射率フーリエ変換分光測定であった。しかし、この方法はUV法²⁰と同様の適切な標準を欠いている。その後、リグニン含有量はNIRS(近赤外分光法)およびNMR(核磁気共鳴分光法)によって推定された。しかし、これらの方法には欠点があり、リグニンの化学構造を変えない、その純度²⁰を保持する。

重量測定クラソン法は木質茎のリグニン推定のための直接かつ最も信頼できる分析方法である。重量測定リグニン推定の基礎は、非リグニン化合物の加水分解/可溶化と、重力測定²¹のための不溶性リグニンの収集である。この方法では、糖質は、濃縮_H2SO4でバイオマスの加水分解により除去され、リグニン残基^20,22を抽出する。この方法で推定されるリグニン含量は、酸不溶性リグニンまたはクラソンリグニンとして知られている。Klason法の適用は、植物種、組織タイプおよび細胞壁タイプに依存する。タンニン、多糖類、タンパク質などの非リグニン成分の可変量の存在は、酸不溶性/可溶性リグニン含量の推定における比例差をもたらす。したがって、クラソン法は、木質茎^17、23などの高リグニン含量バイオマスのリグニン推定にのみ推奨される。臭化アセチル(AcBr)、酸不溶性リグニン、チオグリコール酸(TGA)などの溶解方法は、様々な植物バイオマス源からのリグニン含有量の推定に最も一般的に使用される方法である。Kim et al. は、可溶化によるリグニン抽出のための 2 つの方法を確立した。第1の方法は、セルロースとヘミセルロースを可溶化して不溶性残基としてリグニンを抽出し、第2の方法は、リグニンを可溶性画分で分離し、セルロースとヘミセルロースを不溶性残基^として残す。

溶解度に基づくリグニン推定に用いられる類似の方法は、チオグリコール酸(TGA)および臭化アセチル(AcBr)法²⁵である。TGAおよびアセチルブロマイド法はいずれも、280nmでの可溶化リグニンの吸光度を測定することによってリグニン含有量を推定する。しかしながら、AcBr法はリグニン可溶化の過程でキシランを分解し、リグニン含量²⁶の誤った増加を示す。チオグリコレート(TGA)法は、TGAとリグニンのベンジルアルコール基のチオエーテル群との特異的結合に依存するので、より信頼性の高い方法である。TGA結合リグニンは、HClを用いて酸性条件下で沈殿し、リグニン含量は280nm27での吸光度を用いて推定される。TGA法は、構造修飾の少ない、リグニン推定の可溶性形態、非リグニン成分からの干渉が少なく、TGAとの特異的結合によるリグニンの正確な推定という付加的な利点を有する。

このTGA法はリグニン含量推定に用いられる植物バイオマス試料の種類に基づいて修飾される。ここでは、稲わらのTGA法を綿^{組織に変更} ・適応し、リグニン含有量を推定した。簡単に言えば、乾燥粉末植物試料を、タンパク質可溶化緩衝液及びメタノール抽出を行い、タンパク質およびアルコール可溶性画分を除去した。アルコール不溶性残基を、酸性条件下でTGAおよび沈殿したリグニンで処理した。市販の竹リグニンを用いてリグニン標準曲線を生成し、回帰直線(y =mx+c)を得た。「x」値はリグニンの平均吸光度値を280nmで使用し、回帰直線から「m」と「c」の値を入力して、綿花植物バイオマスサンプル中の未知のリグニン濃度を計算しました。この方法は5つの段階に分けられます: 1)植物サンプルの調製;2)水とメタノールでサンプルを洗浄;3)TGAと酸を用いてペレットを処理し、リグニンを沈殿させる。4)リグニンの沈殿;5)サンプルの標準的な曲線調製およびリグニン含有量推定。最初の2つの相は、主に、水、PSB(タンパク質可溶化バッファー)およびメタノール抽出が続く植物材料調製物に焦点を当て、アルコール不溶性物質を得る。次いで、TGA(チオグリコール酸)とHClで処理し、第3相においてリグニンと複合体を形成した。最後に、HClを使用してリグニンを沈殿させ、水酸化ナトリウムに溶解して^280nm28で吸光度を測定した。

1. 植物サンプルの調製

1. 温室から生後2ヶ月の綿花を集める(図1A)。
2. 植物の周りの土を緩めることによって無傷の外側根で土と根を分離するために植物の鉢を穏やかに反転させる(図1B)。
3. 収集した植物を水で満たされたトレイで十分に洗い、すべての汚れを取り除きます(図1C)。
4. ペーパータオルを使用して、分離した根、茎、葉組織を乾燥させ、ラベルを付けます(図1D)。真菌汚染を防ぐために、室温で2日間空気乾燥します(図1E)。
5. サンプル組織をラベル付き容器/アルミホイルに移し、温度制御インキュベーターで49°Cで7~10日間インキュベートする(図1F)。
   注:温度が高いとリグニン構造が変になることがあります。あるいは、凍結乾燥機を使用して、植物バイオマスに化学変化を起こすことなく1〜2日間サンプルを乾燥させることができます。
6. インキュベーター乾燥組織を5mmサイズに切断するか、あるいはバイオマスグラインダーを用いて植物組織を粉砕するために刃を使用する(図1G、図1H)。
   注:各サンプルを切断/粉砕した後、バイオマスグラインダー/ブレードを洗浄する必要があります。
7. 切断された組織/バイオマス接地された植物材料を粉砕バイアルに移し、液体N₂を備えた冷凍工場または極低温粉砕機を使用して1mmサイズの細かい粉末に粉砕する。
8. 10 CPS(各サイクルスパン2分)の割合で3サイクルのサンプルを均一な粉末に粉砕する(図1I、1J、1K)。
   注: この時点で実験を一時停止することができ、サンプルは長期保存のために気密容器内の室温で保存することができます。

2. 水、PSB、メタノールでサンプルを洗浄

1. リグニン含有量推定に使用されるすべての空の2 mLマイクロフュージチューブの重量を測定し、ラボノートブックに記録します。
2. 20mgの粉砕サンプル粉末を予め計量したチューブに移します。組織およびティッシュの粉と管を量り、実験室のノートでこれらの重量を記録する。
3. ヒートブロックまたはオーブンで20mgの組織粉末を1時間、20mgの組織粉末で2mLマイクロフュージチューブ(開いた蓋付き)をすべてインキュベートします。
4. インキュベーション後、室温(RT)で10分間サンプルを冷却します。
5. 各マイクロフュージチューブに1.8mLの水を加え、渦を混ぜて混ぜます。次いで、25,200xg(15,000 rpm)でRTで10分間遠心分離機を10分間、上清を捨て、(図2)。。
6. 各保持ペレットにタンパク質可溶化バッファー (PSB) (表 1)の 1.8 mL を加え、ボルテックスで混合します。遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間、上清を捨てます。
7. 各サンプルについて、ステップ 2.6 をもう一度繰り返します。
8. 各ペレットに1.8mLの水を加え、渦を混ぜて、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)で10分間混ぜます。遠心後、ペレットを保存し、上清を捨てます。
9. 保持されたペレットに、1.8 mLのメタノールを加え、60°Cのヒートブロックに20分間インキュベートします。次いで、25,200xg(15,000rpm)で遠心分離機を10分間RTで10分間行う。遠心分離後、上清を捨ててペレットを保持する(図2)。
10. 各サンプルについて、ステップ 2.9 を再度繰り返します。
11. 空気はRTでペレットを乾燥させるか、真空乾燥によって直ちに進行する。真空乾燥乾燥器を使用して30°Cで2〜3時間、またはペレットが完全に乾燥するまで乾燥した。
    注:実験は、この時点で夜間の空気乾燥によって一時停止するか、真空乾燥によって継続することができます。
12. 乾燥後、乾燥したペレットでサンプルチューブの重量を量り、ラボノートブックのそれぞれの空のチューブ重量の横に重量を記録します。2つの値を減算してペレットの重量を推定します。これらの重みは、リグニン抽出プロセスの終了時にリグニン推定に使用されます。
13. リグニン抽出のこの時点で、リグニン標準曲線の生成のための市販の竹リグニンが含まれる。0.5 mg 単位で 0.5 mg から 5 mg までの範囲の別々のチューブに市販の竹リグニンを測定 (0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg, 5.0 mg).3回の技術的複製のために各濃度を3回測定します。
    注:ここから、上記のステップで測定された標準は、乾燥したサンプルと同じ方法で処理されました。

3. TGAと酸を用いてリグニンを沈殿させるペレットの処理

1. 上記のステップから処理されたサンプルを、測定された標準と共に、TGA(チオグリコール酸)処理に供する。
2. 各ペレットに3 N HCl(表1)と100μLのTGAを1mL加えます。
3. 80°Cの予熱熱ブロック内で80°Cの加熱ブロックで3時間、発煙器での渦とインキュベート(図2)。
   注:80°Cの加熱工程は監視する必要があります。高圧の蓄積は、蓋を開ける可能性があり、化学物質の流出につながる可能性があります。スクリューキャップチューブは推奨されていますが、このような流出を防ぐための代替として、このステップ中に2 mLチューブを緩くキャップすることができます。
4. インキュベーション後、RTで10〜15分間冷却し、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間冷却します。
   注:酸と有機溶剤から発生する廃棄物は、換気キャップ付きのガラス容器に分離して保管する必要があります。TGA酸廃棄物と酸廃棄物の収集には、別々のガラス容器を使用してください。
5. 遠心後、上清を捨ててペレットを保持します。水1mLを加え、渦を巻いて混ぜ、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間混ぜます。
6. 遠心分離後、上清を捨て、ペレットを37°Cシェーカー/サーマルミキサーで24時間24時間、ペレットを24時間混ぜます(図2)。
   注:このインキュベーション時間は1時間⁷に短縮することができます。
7. インキュベーション後、2mLマイクロフュージチューブを25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間遠心します。
   注:手順は、強い酸や自然界で腐食性である他の化学物質の使用を含みます。したがって、適切なPPEを着用することは、リグニン推定のプロセス全体を通じて推奨されます。TGAは、強い不快な臭いを持っており、自然の中で腐食性です。したがって、ヒュームフードでのみ使用することをお勧めします。

4. リグニンの沈殿

1. 上清を新しい2 mLマイクロフュージチューブに移し、濃縮HClの200 μLを加え、4°Cで4時間または一晩インキュベートする(図2)。
   注: この時点で、冷凍工程を夜間まで延長することで、抽出プロセスを一時停止できます。
2. 遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間、1 mLの1 N NaOHに溶解させた。
3. 10分間RTでシェーカーにインキュベートし、NaOHでペレットを完全に懸濁させる。
4. 最後に、分光光度計を用いて280nmのサンプルの吸光度を測定し、標準リグニン曲線と比較します。
5. キャリブレーション曲線回帰直線値、および抽出したサンプルの吸光度を280nmで使用して、リグニンの未知の濃度を測定します。

5. サンプル中の標準曲線の調製とリグニン推定

1. TGA処理の実験サンプルと同じ方法でリグニン標準を処理します。
2. 0.5 mg、1mg、1.5 mg、2mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mgおよび5mgから始まる0.5mg単位の商業竹リグニン標準を測定する。次いで、TGA、HCl、1 N NaOHに溶解し、続いて280nmで吸光度を測定して処理する(図3A)。
3. リグニン濃度と吸光度の測定値を使用して、標準リグニン曲線の散乱プロットを生成する(図3B)。
4. 散布図で生成された回帰直線y =mx+cを使用して、リグニン標準曲線回帰直線から280nmおよび「m」および「c」値で抽出されたサンプルの平均吸光度から「x」値を使用して調製したサンプルの未知のリグニン含有量の推定に使用する。
5. mg(約15mg)でメタノール抽出後の真空/空気乾燥植物バイオマス試料の総重量で得られたy値のリグニン含有量を割り、mg当たりのリグニン濃度を得た。次に、この値に 100 を掛けて、mg 当たりのリグニンパーセントを計算します。

2つの異なる綿の実験ラインを、異なる組織におけるリグニン含分の違いについて比較した。各試料の抽出リグニン含量を280nmで測定し、それぞれの吸光度値を記録した。各生物学的複製の平均吸光度値をリグニン標準曲線の回帰線と比較した(表2、図3C)。回帰直線 y = mx + c は、抽出された実験線の未知のリグニン含有量を計算するために使用されます, サンプル 1 とサンプル 2.平均OD値の結果は「x」に置換され、一方、「m」および「c」値はリグニン標準曲線の回帰線から差し込まれ、mgでリグニン濃度"y"を得た(表3、図3B)。次のステップでは、リグニン含量の1mg当たりを計算し、メタノール抽出後に「y」値をサンプルの重量(15mg)で割った。次のステップでは、グラム当たりの計算(= 1,000 mg)に対してy/15値に1,000を掛けた。リグニンの % を取得するには、y/15 値を 1,000 で除算し、100 を掛けます。3つの生物学的複製(各ライン、サンプル1およびサンプル2)のリグニン%の平均を、2つの実験ラインサンプル1(11.7%)の間で比較した。サンプル2(10.3%)を示します。リグニン値は、TGA法が信頼性の高い方法であり、リグニン含有量を測定するために非常に特異的であることを示唆する生物学的複製の間で一貫していた。比較研究は、綿の2つの実験ラインの異なる組織タイプ(根、茎および葉)間でも行われ、両方のラインは葉の比較的低いリグニン含有量を示した(3.4%)茎と比較して(9.4%から9.9%)根と根(9.4%から9.2%)(表4、図4)。

図1:植物バイオマスサンプルの調製 (A)緑の家から綿の植物材料を集めた。(B)鍋をそっと反転して根を分ける。(C)水洗を徹底して、汚れを全て除去する。(D) 根、茎、葉組織を分離した。(E)組織を分離した後2日間、空気乾燥した組織。(F)空気乾燥組織は、49°Cで10日間インキュベーターに移される。(G)バイオマス粉砕機を用いて植物バイオマスサンプルを粉砕した。(H)根、茎、葉の植物バイオマスサンプル。(I)グランドサンプルは、3サイクルの10 CPSの速度で冷凍工場に接地冷凍工場に置かれ、粉砕バイアルにロードされます。(J)冷凍工場で粉砕した後、微細に粉砕された組織粉末を示す粉砕されたバイアル。(K)粉砕のために冷凍工場を使用した後、根、茎および葉の組織粉末を細かく粉砕する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TGA媒介性リグニン抽出に関与する重要なステップ。TGA法を用いた植物バイオマスからリグニン含量推定へのリグニン抽出に関与する重要なステップのフローチャート:1.冷凍工場を使用して微細粉末に十分な乾燥と粉砕による植物サンプルの調製;2. 20 mgの組織粉末をPSB、メタノールおよび水の水の流し、乾燥し、抽出アルコール不溶性材料;3. TGAと酸を使用して、リグニンを沈殿させた。4. 市販の竹リグニンを用いたリグニン標準曲線の調製;5. リグニン含有量の推定この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:試料中の標準的な曲線調製およびリグニン推定法.(A)280nmの吸光度測定値からリグニン標準曲線を生成するために用いられる市販の竹リグニンの異なる濃度を示す表。(B)表Aの値を用いてExcelプログラムで生成された散乱プロット(C)サンプル1およびサンプル2の推定根組織リグニン内容を表す棒グラフ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:プロトコルで使用されるソリューションの準備プロトコルで使用されるさまざまなソリューションの準備を示す表。

表2:リグニン標準曲線は、0.5mgから3.5mgの工業用竹リグニンを調製した。 m と c の値を示す回帰線を含む散布図。 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:280 nm(x)のサンプルの吸光度測定値と標準曲線曲線からの標準曲線回帰線'm'および'c'値を使用して未知のリグニン含有量の計算に使用されるリグニンテンプレート。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:ポスト開花期の綿花の異なる組織(根、茎および葉)からのリグニン含有量。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、利益相反はないと宣言している。