方法論記事

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

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DOI：

10.3791/62074

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2021年7月29日

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1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

この記事について

サマリー

ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。

要約

過去には、腸上皮モデル系は形質転換細胞株および初代組織に限定されていた。これらのモデル系は、前者が元の組織生理学を忠実に表していないため、固有の限界があり、後者の利用可能性は限られている。したがって、それらの適用は基礎的および医薬品開発研究を妨げる。成体幹細胞ベースのオルガノイド(以下、オルガノイドと呼ぶ)は、それらが由来する正常または罹患した上皮組織のミニチュアである。それらは、異なる胃腸(GI)管領域から非常に効率的に確立することができ、長期的な拡張性を有し、インビトロでの治療に対する組織および患者特異的応答をシミュレートすることができる。ここでは、腸管オルガノイド由来上皮単層の確立が、上皮バリアの完全性、透過性および輸送、抗菌タンパク質分泌、ならびに組織学を測定する方法とともに実証されている。さらに、腸管オルガノイド由来単層は、増殖する幹およびトランジット増幅細胞、ならびに重要な分化上皮細胞で富化することができる。したがって、それらは、標的細胞およびそれらの作用機序に対する化合物の効果を研究するために調整することができるモデル系を表す。オルガノイド培養は、いったん確立されると、細胞株よりも技術的に要求が厳しいですが、生体内上皮の複雑さと患者間の不均一性を真に表すため、医薬品開発の後期段階での失敗を減らすことができます。

概要

腸上皮は、腸の管腔内容物と下層組織との間の物理的障壁として作用する。この障壁は、タイトジャンクションによって接続された主に吸収性腸細胞の単一の上皮層を含み、隣接する細胞間の強力な細胞間接続を確立する。これらの細胞は、腸の頂端(管腔)側と側底側を分離する分極上皮ライニングを形成し、同時に消化された栄養素および代謝産物の傍細胞輸送を調節する。腸細胞に加えて、ゴブレット、パネス、および腸内分泌細胞などの他の重要な上皮細胞も、それぞれ粘液、抗菌ペプチド、およびホルモンを産生することによって腸の恒常性に寄与する。腸上皮は、ロイシンに富む反復含有Gタンパク質共役型受容体5陽性(LGR5+)幹細胞を腸陰窩の底部で分裂させることによって絶えず補充され、上方に移動して他の細胞型に分化するトランジット増幅(TA)細胞を産生する1。食物アレルゲン、薬効化合物、微生物病原体への曝露などの遺伝的および環境的要因による腸上皮恒常性の破壊は、腸のバリア機能の破壊につながる。これらの状態は、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病、および薬物誘発性GI毒性を含むいくつかの腸疾患を引き起こす2。

腸上皮に関する研究は、膜挿入物、臓器オンチップシステム、ウッシングチャンバー、腸リングなどのいくつかのin vitroプラットフォームシステムを使用して行われます。これらのプラットフォームは、形質転換細胞株または一次組織をモデルとして使用して、膜の頂端側および側底側の両方にアクセスする分極上皮単層を確立するのに適している。結腸直腸(アデノ)癌細胞株Caco-2、T84、HT-29などの形質転換細胞株は、分極腸腸細胞または粘液産生細胞にある程度分化することができるが、いくつかの細胞型が欠落しており、様々な受容体およびトランスポーターが異常に発現しているため、in vivo上皮を代表するものではない3.さらに、細胞株は単一のドナーに由来するため、患者間の不均一性を表すものではなく、複雑さと生理学的関連性の低下に苦しんでいます。Ussingチャンバーおよび腸管輪として使用される一次組織は、in vivo状況をより代表的ですが、それらの限られた可用性、短期的な生存率、および拡張性の欠如により、ハイスループット(HT)研究の媒体としては不適切です。

オルガノイドは、腸、腎臓、肝臓、膵臓、肺などの異なる器官から確立されたインビトロ上皮培養物である。それらは、長期的で安定した拡張性ならびに遺伝的および表現型の安定性を有することが証明されており、したがって、外部刺激に対する忠実な応答を有する元の器官の上皮の代表的な生物学的ミニチュアである4,5,6,7,8,9。オルガノイドは、切除または生検された正常、罹患、炎症、または癌組織のいずれかから効率的に確立され、不均一な患者特異的応答を表す10、11、12、13、14、15、16。本稿では、オルガノイド培養物由来の腸上皮単層を確立する方法を実証する。単層は、小腸ならびに結腸および直腸オルガノイド培養物から首尾よく確立されている。このモデルは、上皮細胞の薬物への輸送と透過性、ならびに上皮に対するそれらの毒物学的効果を研究する機会を作り出す。さらに、このモデルにより、免疫細胞および細菌との共培養が腸上皮との相互作用を研究することができる17、18、19。さらに、このモデルは、患者固有の方法で治療に対する応答を研究し、上皮バリアに焦点を当てた治療の次の波を探すためのスクリーニング努力を開始するために使用することができる。このようなアプローチは、クリニックに拡張され、パーソナライズされた治療への道を開くことができます。

このプロトコールにおける上皮単層はヒト正常腸管オルガノイドから調製されるが、このプロトコルは他のオルガノイドモデルに適用され、最適化され得る。上皮オルガノイド単層は、幹細胞増殖を支持するためにWntを含有する腸管オルガノイド増殖培地中で培養され、腸管陰窩細胞組成物を表す。腸オルガノイドは、Wnt、Notch、および上皮成長因子(EGF)経路を調節することによって、腸細胞、パネス、ゴブレット、および腸内分泌細胞などの異なる腸上皮脂肪を有するように富化することができる。ここで、膨張培地中で単層が樹立された後、それらは、先に説明したように、より分化した腸上皮細胞に向かって駆動される20、21、22、23、24、25。スクリーニング目的のために、目的の化合物、その標的細胞、および実験条件の作用様式に応じて、単層を選択した細胞組成物に向かって駆動して、関連する機能的読み出しを有する化合物の効果を測定することができる。

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プロトコル

1. 培養用試薬の調製

注: バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行し、細胞培養の操作に関する標準ガイドラインに従ってください。紫外線は、バイオセーフティキャビネットを起動する前に10分間使用されます。使用前および使用後、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールに濡らしたティッシュペーパーで洗浄する。細胞外マトリックス(ECM)の三次元滴の形成を容易にするために、96、24、および6ウェルプレートの予温ストックを37°Cのインキュベーター内に準備しておく。

  1. 基礎培地調製
    1. 5 mL の 200 mM グルタミン、5 mL の 1 M 4-(2-ヒドロキシエチル)-1ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、および 5 mL のペニシリン/ストレプトマイシン (pen/strep) 溶液 (10,000 U/mL または 10,000 μg/mL) を加えて、500 mL のアドバンストダルベッコ改変イーグル培地にハムの栄養混合物 F-12 (Ad-DF) 培地ボトルに基礎培地 (BM) を調製します。これは、少なくとも4週間、4°Cの冷蔵庫に保存することができる。
  2. Wnt ソース
    1. 先に説明した方法26に従ってWnt3a馴化培地(Wnt3aCM)を調製する。
      注:最近、ヒト腸管オルガノイドの拡大もサポートする次世代の代理Wnt(NGS-Wnt)が生成された27。
  3. 腸管オルガノイドベース培地調製
    注:すべての成長因子および試薬を製造業者の推奨に従って使用してください。小さなアリコートを使用し、凍結融解サイクルを避けます。機能性成長因子は、オルガノイド培養を成功させるために不可欠である。
    1. BMに1 μM A83-01、2.5 mM N-アセチルシステイン、2x B27サプリメント、100 ng/mLヒト上皮成長因子(hEGF)、10 nMガストリン、200 ng/mL hNoggin、および100 μg/mLの初代細胞用抗菌製剤を補充して、濃縮された2x 腸オルガノイドベース培地(2x IBM)を調製する( 材料表を参照)。
    2. 2x IBMをアリコートし、-20°Cで最大4ヶ月間凍結する。必要に応じて、アリコートを4°Cで一晩、または室温(RT)で数時間解凍します。
    3. 腸管オルガノイド拡張培地(IEM)を調製するには、2x IBMに50%Wnt3aCMまたは50%BMおよび0.5nM NGS-Wnt、250ng/mLヒトRspondin-3(hRspo3)、10mMニコチンアミド、および10μM SB202190を補充する。
  4. 腸管オルガノイド分化培地調製
    1. 2x IBMに50%BM、250ng/mL hRspo3、および1.5μM Wnt経路阻害剤(IWP-2)を補充して腸球分化培地(eDM)を調製する。eDMを4°Cで最大10日間保存する。
    2. 2x IBM に 40% BM および 10% Wnt3aCM または 50% BM および 0.1 nM NGS-Wnt、250 ng/mL hRspo3、10 μM DAPT および 100 nM PD0325901 のいずれかを補充することにより、組み合わせ分化培地 (cDM) を調製します。cDMを4°Cで最大10日間保存する。
  5. 細胞外マトリックス(ECM)の操作
    注:細胞外マトリックス(ECM)( 材料表を参照)は、製造元の推奨に従って準備してください。
    1. 氷上で一晩ECMを解凍する。ECMを5mLピペットを用いてボトルから15mL円錐管に移し、両方とも-20°Cで予備冷却した。 アリコートを-20°Cで1回だけ再凍結する。 解凍後、ECMを4°Cの冷蔵庫に最大7日間保管してください。使用前に氷上で少なくとも30分間インキュベートする。
      メモ: ECM を適切に混合し、陰窩またはオルガノイドを埋め込む前に、ECM が冷たくなっていることを確認してください。

2. オルガノイド培養

  1. 凍結オルガノイドからの培養の確立
    注:BMをRTに到達させ、12mLのアリコートを37°Cに加温し、凍結オルガノイドを含む1つのクライオビアルを解凍する手順を開始する前に準備を整える。
    1. オルガノイドクライオビアルを37°Cの水浴中で攪拌して、氷のほんの一握りだけが残るまで急速に解凍する。直ちに500μLの温かいBMをクライオバイアルに滴下し、数回上下にピペットをかけて凍結培地を希釈し、内容物を慎重に混合する。
    2. P1000ピペットを用いて、オルガノイドを15mL円錐管に移し、チューブの底部を穏やかに混合しながら、別の1mLの温かいBMを滴下する。数回上下にピペットをかけて凍結培地を希釈し、内容物を慎重に混合する。
    3. オルガノイドを含む15mL円錐形チューブに最大12mLの温かいBMを滴下し、10mL滅菌ピペットで上下にピペットしてオルガノイドを穏やかに再懸濁する。
    4. オルガノイド懸濁液を85× g および8°Cで5分間遠心分離する。 ペレットを乱すことなく上清を慎重に廃棄し、オルガノイドを10μM Y27632または他のrho関連コイル形成プロテインテインテインセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)を添加したIEMの30%v/vに再懸濁する。チューブを氷の上に置きます。
    5. オルガノイドを含む15mL円錐管にECMの70%v/vを加える。15 mL円錐管を氷上に保ったオルガノイド懸濁液と、懸濁液5 μLの種子を混合して密度を確認します(図1A)。密度が適切であればめっきを続けます。密度が高すぎる場合は、それぞれ 30 ~ 70% v/v の同じ比率で IEM/ECM ソリューションを追加します。
    6. 予温した24ウェルプレートの各ウェルにおいて、10μLの5つの別々の滴をピペッティングすることによってオルガノイド懸濁液の種子50μLを調製した(図1B)。プレートを裏返し、バイオセーフティキャビネットに5分間放置します。プレートを逆さまにしたまま37°Cのインキュベーターに移し、さらに30分間放置する。
    7. 各ウェルに10 μM ROCK阻害剤を含む500 μLのIEMを加え、プレートをインキュベーターに移した。成長を監視するために定期的に1滴の画像を撮影し、古い培地を吸引し、500μLの新鮮なIEMを添加することによって、2〜3日ごとにIEMをリフレッシュする。
    8. オルガノイドは、解凍から適切に回復し、処理する適切なサイズに達したら通過させます(図1C)(セクション2.2で説明)。
  2. 腸オルガノイドの継代
    注: 使用する前に、ECM を氷上で少なくとも 30 分間冷やし、IEM を RT に少なくとも 1 時間保管してください。
    1. 1つの培養ウェルからの培地を使用して、1250 μLの低保持フィルターチップを使用してオルガノイドドームを分解し、ウェルの内容物を標識された15mL円錐管に移す。1 mLのBMでウェルを洗浄し、それを同じ15 mLの円錐管に移した。
    2. 他のすべてのウェルで手順2.2.1および2.2.2を繰り返します(最大半分のプレートまたは600 μLのECM滴を洗浄し、1つの15 mL円錐管に加えることができます)。
    3. BMを加えてチューブを12 mLまで充填し、10 mLピペットを使用して10倍に上下にピペットします。85 × g で8°Cで5分間遠心分離する。
    4. BMを除去する前に、顕微鏡下で、すべてのオルガノイドが15mL円錐管の底部でペレット化されているかどうかを確認します(図1D)。オルガノイドペレットにオーバーレイするECMがない場合、またはECM層がクリーンであるか、またはペレット化されたオルガノイドと比較して破片、単一細胞、または非常に少数のオルガノイドを含む場合は、上清を吸引し、P200ピペットを使用してオルガノイドペレットをオーバーレイするECMを非常に慎重にピペットでピペットします。
      注:オルガノイドはECMに閉じ込められ、遠心分離力が低いためコンパクトなペレットとして沈殿しません。ECMにオルガノイドが含まれている場合は、チューブを450 × g で8°Cで5分間再度遠心分離し、2.2.4に記載されているように上清を慎重に除去します。複数の 15 mL 円錐管がある場合は、ステップ 2.2.4 の後にプールできます。
    5. 各ペレットに1mLのBMを加え(オルガノイド培養および密度に応じて50〜200μLの容量)、慎重に再懸濁する。オルガノイドを少なくとも5倍に上下にピペッティングして剪断し、泡の形成を避けます。顕微鏡でオルガノイドが破壊されていないか確認してください(図2A)。オルガノイドが破壊されている場合は、ステップ 2.2.7 に進みます。オルガノイドが破壊されない場合は、さらに5倍にピペッティングします。今度は、プラスチックチューブの壁をピペットチップで触れて、オルガノイドを破壊するためにより機械的な力を発揮します。
      注:オルガノイドの破壊に必要な容量に応じて、嚢胞性(図1C)および出芽(図1E)オルガノイドの機械的剪断は、低保持率の1250μLフィルターチップ(図1F)に取り付けられた200μLまたは10μLプラスチックピペットチップのいずれかで可能です。オルガノイドを含むECMを200 μL以上処理する場合(6ウェルプレートの1ウェルまたは24ウェルプレートの4ウェル)には、狭くしたガラスピペット(図1F)の使用が推奨されます。
    6. オルガノイドが破壊されているかどうかを確認するために、もう一度顕微鏡下で確認してください。中断された場合は、次の手順に進みます。そうでない場合は、オルガノイドを20倍までピペッティングし、顕微鏡下でオルガノイドを定期的にチェックします。オルガノイドがまだ破壊されていない場合は、懸濁液に25%v/v細胞解離試薬1( 材料表参照)を加え、37°Cのウォーターバス内で2分間インキュベートし、オルガノイドを最大20倍ピペッティングし、顕微鏡下でオルガノイドを定期的にチェックして、単一細胞に消化されていないことを確認します。
    7. 15mLの円錐管に最大12mLのBMを加え、オルガノイドペレットを上下にピペッティングして洗浄する。85 × g で8°Cで5分間遠心分離する。 上清を捨て、オルガノイドペレットにIEMとECMを加えて終濃度を70%v/v ECMに調整する。
    8. 継代のために回収したIEM/ECMの2倍の容量でオルガノイドペレットの再懸濁を開始し、懸濁液5 μLをシードして密度を確認します。密度が適切であればめっきを続けます(図2B)。密度が高すぎる場合は、IEM/ECM ソリューションを追加します。予め加温した6ウェルプレートの各ウェルに200 μLの懸濁液を加え、10 μL容量の別々の滴を作る。
    9. プレートを裏返し、バイオセーフティキャビネットに5分間放置します。プレートを逆さまにしたまま37°Cのインキュベーターに移し、さらに30分間放置する。各ウェルに10μM ROCK阻害剤を含む2mLのIEMを加え、プレートをインキュベーターに移した。
    10. 成長を監視するために定期的に1滴の画像を撮影し、古い培地を吸引し、2mLの新鮮なIEMを加えることによって、2〜3日ごとにIEMをリフレッシュする。
  3. 上皮単層調製のための腸管オルガノイドの継代
    1. 継代オルガノイドは、1つの例外を除いてセクション2.2に記載したのと同じ継代プロトコールに従うことによって単層調製のために収穫する3日前に。ステップ2.2.7では、単層調製のために回収されたときに、オルガノイドをIEM/ECMの開始体積の1〜1.5倍に再懸濁して、より高い密度および膨張電位を有するようにする(図3A)。

3. 上皮単層調製

  1. 24ウェルおよび96ウェルの両方の膜インサート上の上皮単層を、様々な利用可能なプレートタイプで培養した(表1)。ハイスループットシステム(HTS)メンブレンインサートは、メンブレンインサートとレシーバープレートを備えた一体型トレイが含まれているため、両方のサイズに使用します。24ウェルフォーマットの場合、別々の取り外し可能なメンブレンインサートを備えたプレートの使用も可能です。
    注:異なる膜タイプ(ポリエチレンテレフタレート(PET)またはポリカーボネート)および孔径(0.4〜8.0μm)が利用可能であり、実験ニーズに応じて使用することができる。単層は、PET膜を備えたインサートが使用される場合にのみ明視野によって画像化することができる。光密膜は、頂端から基底側区画への蛍光光漏れを遮断し、蛍光標識された基質の動的輸送または透過性を研究する際に考慮することができる。現在のプロトコルは、24ウェルメンブレンインサートを使用しています。96ウェル膜インサートの適応は、セクション5で説明されています。オルガノイドの密度、形態、およびサイズ(図3A)に応じて、6ウェルプレート(セクション2.3で播種したように)の6ウェルは、膜挿入物の完全な24ウェルプレートを播種するのに十分である。
  2. ECMによる膜インサートのコーティング
    注:十分な細胞を持つことに疑問がある場合は、細胞を数えた後に挿入物をコーティングしてください。これは、高価な膜インサートの不要なコーティングおよび損失を防止するためである。
    1. メンブレンインサートをバイオセーフティキャビネット内の支持プレートに置きます。ECM 40xを氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)でCa2+およびMg2+で希釈し、希釈したECMを150μLを各インサートの頂端区画にピペットで固定する。プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
  3. 播種用細胞の調製
    1. 細胞解離試薬2のアリコートを水浴(37°C)に予め温める。6ウェルプレートの各ウェルに対して2mLの試薬を調製する。
    2. オルガノイド(セクション2.3で調製)を含む培養プレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移す。手順 2.2.1.-2.2.4 で説明するように、オルガノイドを処理します。複数のチューブを 1 つのチューブにプールしないでください。
    3. 6ウェルプレートの最大3ウェルからのオルガノイドを含むチューブを充填し、DPBS(Ca2+およびMg2+なし)で最大12mL、および10mLピペットを使用して10倍上下にピペットする。85×gで8°Cで5分間遠心分離し、オルガノイドペレットを乱すことなく上清を吸引した。
    4. 出発物質として用いた6ウェルプレートのウェルあたり2 mLの予温した細胞解離試薬2を加え、再懸濁した。チューブを斜めまたは水平に37°Cの水浴中で5分間インキュベートし、オルガノイドのチューブの底部への沈み込みを防止する。
    5. 細胞解離試薬の全容量に応じて、5mL滅菌プラスチックピペットまたはP1000ピペットを使用して10倍にピペットを上下させる。顕微鏡下でオルガノイド懸濁液をチェックして、単一細胞と2〜4個の細胞からなるいくつかの細胞凝集塊の混合物が形成されたかどうかを確認します(図3B)。必要に応じて、混合物が 図3Bのようになるまで、ステップ3.3.4〜3.3.5(細胞解離試薬の体積を増やさないでください)を繰り返して消化を続けます。
      注:オルガノイドを単一細胞に完全に消化することは避けてください。いくつかの小さな細胞群(すなわち、2〜4個の細胞群)を有する必要がある。
    6. 細胞懸濁液に 10μM ROCK阻害剤を含むBMを最大12mL 添加することによって細胞解離を止める。450× g で8°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。同じオルガノイド培養物を数本の15mL円錐管で処理する場合は、細胞ペレットをプールし、12mLのBMに再懸濁する。
    7. BMでプリウェットした40μmのストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、フロースルーを50mLの円錐形チューブに回収する。ストレーナーを10 mLのBMで洗浄し、フロースルーを同じ50 mLの円錐管に収穫します。
    8. 緊張した細胞懸濁液を2つの新しい15mL円錐管に移す。450× g で8°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。出発物質として使用した完全培養プレートあたり10μM ROCK阻害剤を添加した4mLのIEMに細胞を再懸濁する。
    9. 少量の細胞懸濁液を1:1の比率でトリパンブルーと混合して計数する。青ではなく生の細胞を数え(図3C)、生細胞の総数を計算します。小さな塊では、個々の細胞を数えます。
    10. 10 μM ROCK阻害剤を添加したIEMの1mLあたり3×106 個の生細胞を含む細胞懸濁液を調製する。
  4. ポリエステル膜インサートに細胞を播種する
    1. ECMコーティングされたインサートからDPBSを慎重に吸引し(ステップ3.2.1)、プレートを水平に保ちます。IEMのピペット800 μLを各側方区画にROCK阻害剤を補充した。ステップ3.3.10で調製した細胞懸濁液150 μLを頂端区画のECMコーティング膜上に滴下する。プレートごとに、BMのみで少なくとも1つの「空白」ウェルがあることを確認してください。
    2. 細胞が膜上に沈降したら、セクション4.1で説明したように経上皮電気抵抗(TEER)を測定し、顕微鏡を使用して膜挿入物を画像化します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内に置く。TEERを毎日測定し、画像を定期的に取得して単層形成を監視します(図4A-D)。
  5. 爽やかな単層
    注:2〜3日ごとに培地をリフレッシュし、細胞の上に正の静水圧を維持し、細胞が膜から押し出されるのを防ぐために、次の順序で接着してください。培地をリフレッシュしながら、培地の吸引時に見える単層がピペットチップによって損傷を受けていないことを確認してください。
    1. 膜インサートを含むプレートの基底側区画から培地を除去する。次いで、膜挿入物の頂端区画から培地を注意深く吸引する。
    2. 150 μLの新鮮なIEMを各頂端コンパートメントに滴下し、次に800 μLの新鮮なIEMを各側方コンパートメントに加える。
  6. 所望の腸上皮細胞型のための単層の濃縮
    1. 単層がIEMで合流し、約100 Ω・cm²のTEER値(ステップ4.1.1.4で計算)に対応するようにします。顕微鏡で、単層が完全に形成されたかどうか(図4D)、および穴がないかどうか( 図4B、Cを参照)を確認します。
    2. 膜インサートの側底および頂端コンパートメントからIEMを慎重に取り外し、セクション1.4で準備したようにeDMまたはcDMのいずれかと交換する。この単層を特異的分化培地中でさらに3〜4日間培養し、所望の特定の細胞型で富化されたオルガノイド細胞を得る。セクション 3.4 で説明されているように、2 ~ 3 日ごとに培地をリフレッシュします。
    3. TEERを毎日測定し、必要に応じて定期的に画像を取得します(図5A-C)。
      注:完全に組織化された濃縮単分子層を示すTEER値は、オルガノイド培養ごとに異なる。通常、TEER 値は 600 に増加し、分化培地で 3 日後に最大 1000 Ω・cm2 (ステップ 4.1.1.4 で計算) まで増加し、3 ~ 5 日間安定です。

4. 上皮単層アッセイの読み出し

  1. 経上皮電気抵抗(TEER)の測定
    注:TEER測定は、上皮単分子層28,29などの生理学的障壁の生物学的モデルにおけるタイトジャンクションダイナミクスおよびバリア機能の完全性を分析する方法として広く受け入れられている。タイトジャンクションでの細胞相互作用の増加による分化後のTEERの増加は、手動TEER計または自動TEER測定ロボットを使用して測定することができる。
    1. 手動TEERメーターを使用したTEERの測定
      1. 電極を70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で空気乾燥させます。BMの入ったチューブに電極を入れ、手動のTEERメーターに電極を接続します。 ファンクション スイッチを回して 、オーム(Ω)で測定します。 電源 スイッチをオンにします。
      2. 短い電極をインサートの頂端コンパートメントに配置し、一方、長い電極を側方コンパートメントに配置します(図6A)。単層に触れないでください。
      3. ブランクウェル(Rブランク)の抵抗を測定し、残りのサンプル(Rサンプル)を同じ方法で測定します。異なる条件のサンプル間で電極をBMで洗浄する。電極を最初にデミ水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄し、風乾させます。
      4. TEER(Ω・cm2):[R試料 (Ω)-Rブランク (Ω)]×膜面積(cm2)を算出する(表1 及び 図6B)。
    2. 自動TEER測定ロボットによるTEER測定(材料表)
      1. メンブレンインサートを含む96ウェルおよび24ウェルHTSプレートにHTSシステムを使用する場合は、自動TEER測定を実行します。TEER測定には、両方のタイプ(24-および96-HTSメンブレンインサート)で異なる電極を使用します。自動TEER測定ロボットを使用してTEERを測定するには、製造元の指示に従ってください。
  2. 上皮バリアの完全性と透過性の測定
    注:このプロトコルは、単層の完全性の指標として、頂端から側方コンパートメントへのルシファーイエロー透過性を導入する。このセクションでは、単層透過性、ひいてはバリア完全性を評価するための1時間のインキュベーションステップ後の側底区画における蛍光測定について説明する。この測定はエンドポイントアッセイであり、化合物がバリアの完全性に及ぼす影響をテストする場合に特に役立ちます。
    1. 氷の上でルシファーイエローを解凍し、BMをRTに平衡化させる。膜インサートの1つの24ウェルプレートについて、BM中の60μMルシファーイエローの5mLの作業溶液を調製する。
      注:ルシファーイエローは光に敏感です。暗所の1.5 mL滅菌チューブで希釈液を準備し、バイオセーフティキャビネットのライトをオフにしてすべての手順を実行します。
    2. ステップ3.5.1で説明したように、膜挿入物の側底側および頂端区画から培地を慎重に除去する。必要に応じて、損傷した障壁を通るルシファーイエロー漏れの陽性対照としてピペットチップを使用して、未処理の単分子層を1つ引っ掻きます。
    3. 各頂端区画に60 μMルシファーイエローを含む150 μLのBMを加え、各側方コンパートメントにルシファーイエローを含まないBMを800 μL加える。プレートをシェーカー上に置き、37°C、50rpmで60分間置く。
    4. その間に、ステップ4.2.1で調製した作業溶液から始めて、BM中のルシファーイエローの標準曲線を準備する。3nMの濃度に達するまで各ステップで1:3に希釈する。陰性対照(BMのみ)を含める。
    5. 各標準物質100 μLを3連で96ウェル透明プレートに移す。60分間のインキュベーション後、膜インサートを取り出し、各側方ウェルから100 μLを3連で96ウェル透明プレートに移した(ステップ4.2.3)。プレートリーダーを用いて、励起波長430nm、発光波長530nmでプレートの蛍光を測定する。
    6. 陰性対照値(BMのみ)を補正した後、検量線値を使用して、側底区画内のルシファーイエロー濃度(最終受信機濃度(μM))を計算した。
    7. 見かけの透磁率係数(Papp)を下記式に従って算出する(図6C):
      figure-protocol-1
    8. メンブレンインサートを含む24ウェルプレートの場合、次の式を使用します。
      figure-protocol-2
  3. 単分子膜を固定し、組織学のためのパラフィンブロックを準備する
    注:上皮単層は、それらの細胞組成、極性、および接合タンパク質、増殖、または分化マーカーなどの目的の異なるタンパク質の発現を評価するための組織学的染色に使用することができる。このセクションでは、組織学的染色のためのパラフィンブロック調製物について説明する。
    1. ステップ3.5.1で説明するように、膜挿入物の側底および頂端区画から培地を慎重に除去する。
    2. 各頂端区画に150 μLのDPBS(Ca2+ およびMg2+なし)を、各基底側区画に800 μLを加えて単層を洗浄する。DPBSを再び慎重に、まず側底コンパートメントから、次に頂端コンパートメントから吸引する。
      注:このステップ以降、側底コンパートメントは空のままです。
    3. ヒュームフード内で、150μLの4%パラホルムアルデヒドを各頂端コンパートメントに加え、RTで30分間インキュベートする。
      注:このステップ以降は、パラホルムアルデヒドは有毒であるため、ヒュームフード内でこのセクションのすべてのアクションを実行します。
    4. 膜インサートの頂端コンパートメントから固定液を慎重に吸引し、液体ハロゲン廃棄物として処分する。
      注: このステップ以降は、すべての液体廃棄物を液体ハロゲン廃棄物として処分してください。
    5. 各頂端コンパートメントに200μLのDPBS(Ca2+ およびMg2+なし)を加えて単層を洗浄し、DPBSを再び注意深く吸引する。この手順をもう一度繰り返します。
    6. 200 μLの25%エチルアルコール(EtOH)を各頂端コンパートメントに加え、RTで15分間インキュベートした。15分後、膜挿入物の頂端コンパートメントから25%EtOHを注意深く吸引する。50%EtOH溶液で繰り返し、続いて70%EtOH溶液で繰り返す。
    7. 各頂端コンパートメントに200 μLの70%EtOHを加え、プレートをパラフィルムで包みます。さらに使用するまで4°Cで保存してください。
    8. 70%のEtOHを慎重に吸引し、メスを使用してインサートから単層膜を慎重に切断する。インサートの端の周り、基底側から切り取ります。
    9. パラフィンブロックは、標準的な手順に従って準備する。
      1. パラフィンがまだ温かいときは、ピンセットでパラフィンから単層を取り出し、予冷した表面に置きます。
      2. 単層を傷つけないように注意してください。シングルエッジブレードを使用して単層を半分に切断します。
      3. カセットの底部のパラフィンが固化し始めたら、加熱ピンセットを使用して、2つの単層部品をパラフィン内に、直線側を下にして垂直方向に隣り合わせに配置し、単層がクーペ内で垂直になるようにします。
    10. パラフィンブロックの準備ができたら、ミクロトームでブロックを切断し、標準的な手順に従って厚さ4μmの切片をスライドさせます。単層がクーペで垂直になることを確認します。
    11. 先に記載した組織学的染色を行う7、9。ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)、Ki67、ムチン-2(MUC2)、およびアルシアンブルーを使用して、それぞれ一般的な形態、増殖性細胞、粘液産生および杯細胞を示す(図6E)。
      注:パネス細胞のリゾチームなどの追加の分化マーカーも使用できます。このマーカーは、パネス細胞が結腸上皮ではなく小腸上皮に存在するとして 図6E には提示されていない。
  4. 培地上清中の分泌タンパク質測定
    1. 回腸単層の頂端上清中のリゾチームレベルを測定し( 図6D参照)、 材料表に列挙されたキットを使用する。所望により、異なるサイトカインおよび目的の他のタンパク質のレベルを測定する。
  5. 遺伝子発現解析
    1. 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を用いて、上皮細胞マーカー遺伝子の発現に対する分化培地の影響を定量する。
      1. 単層を350 μLのRNA溶解バッファーで溶解し、その後、製造元の指示に従ってRNA単離します。cDNA合成およびqPCRは、前述の7、9で説明したように、材料表に記載されているcDNA合成キット、マスターミックス、およびオリゴヌクレオチドを使用して行います。

5. メンブレンインサートを含む96ウェルプレートへのアップスケーリング

注: 膜インサートを含む HTS 96 ウェルプレートを使用して、よりスループットの高い薬物スクリーニングまたは複数の培地条件のために上皮単層を調製します。

  1. 96ウェルフォーマットで単分子層を調製する際の適応
    1. 膜挿入物を含む 24 ウェルプレートについて、このプロトコルに記載されているすべての手順に従い、体積と細胞数を 表 1 に記載のものに変更します。メンブレンインサートを備えた96ウェルプレート上に単分子膜を調製するには、セクション3で説明したように、以下の相違点を伴って続行します。
      1. 図3Aで表されるオルガノイド密度を有する6ウェル培養プレートの約9ウェルは、メンブレンインサートを備えた完全な96ウェルプレートを播種するために必要である。ステップ3.2.1では、DPBS中の40倍希釈ECMの67μL(Ca2+およびMg2+を含む)で膜をプレコートする。
      2. セクション3.5では、まず膜インサートの一体プレートを別の96ウェルプレートに移して、頂端および側方コンパートメントの両方の培地リフレッシュを可能にする。

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結果

図1Aは、それらをクライオビアルから解凍した後の腸管オルガノイドの代表的な明視野画像を示す。最適な回収率を確保するためには、オルガノイドを高密度で解凍することが重要です。オルガノイドは、約10μLのECMドーム内の24ウェルまたは6ウェルプレートに播種される(図1B)。ほとんどの正常な腸オルガノイドは嚢胞性形態を有する。解凍プロセスから回復した後、オルガノイドはより大きなサイズに成長し、オルガノイド培養物に応じて3〜7日後に継代する準備ができている(図1C)。オルガノイドを採取し、ECMを洗い流した後(図1D)、機械的せん断によってオルガノイドを小さなサイズに破壊することができます。オルガノイドの形態(嚢胞性図1C、出芽図1E)に応じて、プラスチックまたはガラスピペットを使用してオルガノイドを破砕することができる(図1F)。

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ディスカッション

このプロトコールは、腸管オルガノイドの一般的な操作および維持、ならびにこれらのオルガノイドに由来する上皮単層の調製および可能な適用を記載する。今日まで、単層は、十二指腸、回腸、および正常および以前におよび活発に炎症を起こした腸組織に由来する結腸オルガノイドの異なる領域から首尾よく調製されてきた(未発表データ)。患者由来のオルガノイド単層の適用は、疾患および患者特異的な様式でのバリア機能の研究、ならびに様々な薬物治療に対する患者特異的応答の研究を容易にする。細胞株は腸腸細胞および杯様細胞を含む分化および分極単層を形成することができるが、多くの異なる酵素およびトランスポーターがこれらの細胞株において異常に発現され、複雑さおよび生理学的関連性の低下をもたらす3,30。オルガノイド培養は、細胞培養よりも技術的に要求が厳しく、面倒です。しかし、オルガノイドはin vivoの状況をより代表していますが、細胞株は複雑なセットアップで組織応答を表すことに繰り返し失敗しています。

一...

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開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は 、Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland(LSH-TKI )の官民パートナーシップ(PPP)手当によって支援されており、プロジェクト番号LSHM16021オルガノイドは、Hubrecht Organoid Technology(HUB)への毒物学モデリングのための新しいツールとして、HUBは疾患モデリングおよび毒物学部門に内部資金を供給しています。我々は、Sabine Middendorp(小児胃腸科、Wilhelmina Children's Hospital、UMC、Utrecht)およびHugo R. de JongeおよびMarcel J.C. Bijvelds(消化器科および肝臓科、エラスムスMC、ロッテルダム)の研究室が、膜挿入物に単層を設置するための初期技術サポートを提供してくれたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100%エタノールフィッシャーエメルゴ10644795
1250、300、および20 µL ローリテンションフィルターチップGreiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 mL コニカルチューブGreiner bio-one188271
24 ウェル細胞培養プレートGreiner bio-one662160
24 ウェル HTS Fluoroblok トランズウェルプレート (ライトタイト)Corning351156
24 ウェル HTS トランズウェルプレート (表 1)Corning3378
トランズウェルインサート付き24ウェルプレートCorning3470
40 & micro;m細胞ストレーナーPluriSelect43-50040-01
50 mL コニカルチューブGreiner bio-one227261
6ウェル細胞培養プレートGreiner bio-one657160
96ウェルブラックプレート 透明底Greiner bio-one655090
96ウェル高速サーマルサイクリングプレートLife Technologies Europe BV4346907
96ウェルHTS Fluoroblok トランズウェルプレートコーニング351162
96ウェルHTSトランズウェルプレート(表1)コーニング7369
96ウェル透明培養プレートGreiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Accutase Cell Dissociation ReagentLife Technologies Europe BVA11105-01Cell解離試薬 2
Advanced DMEM/F-12Life Technologies Europe BV 12634028
B27 supplementLife Technologies Europe BV17504001
細胞培養顕微鏡(光学顕微鏡)Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
CentrifugeEppendorf
CO2インキュベーターPHCBI
DAPTSigma-AldrichD5942
DEPC 処理 H2OLife Technologies Europe BV750024
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) と Ca2+ および Mg2+Life Technologies Europe BV14040091
DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなしLife Technologies Europe BV21600069
EnzChek Lysozyme Assay KitLife Technologies Europe BVE22013
EVOM2 メーター STX電極付きWTI
GastrinBio-Techne Ltd3006
ガラスピペットVolac
GlutaMAXLife Technologiesヨーロッパ BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
Human NogginPeprotech120-10C
Human Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Ki67 一次抗体SanbioBSH-7302-100
Ki67二次抗体AgilentK400111-2
Kova International Glasstic Slide with Counting gridsFisher Emergo10298483
Laminar flow hoodThermo scientific
Lucifer Yellow CH dilithium saltSigma-AldrichL0259
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR)Corning356231細胞外マトリックス (ECM)
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mLLife Technologies Europe BV4358293
MicroAmp Optical 8-Cap StripsLife Technologies Europe BV4323032
Microcentrifuge tubesEppendorf0030 120 086
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL)Gilson
MicrotomeLeica
MUC2 一次抗体Santa Cruz Biotechnologysc-15334
MUC2 二次抗体VWRVWRKS/DPVR-HRP
マルチチャンネルピペット (200 & micro;L)ギルソン
N-アセチルシステインSigma-AldrichA9165
NGS WntU-Protein ExpressN001-0.5mg
ニコチンアミドSigma-AldrichN0636
オリゴヌクレオチドALPI1/フォワードカスタムメイドGGAGTTATCCTGCTCCCCAC
オリゴヌクレオチド ALPI1/リバースオーダーメイドCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
オリゴヌクレオチド LGR5/フォワードオーダーメイドACACGTACCCACAGAAGCTC
オリゴヌクレオチド LGR5/リバースオーダーメイドGGAATGCAGGCCACTGAAAC
オリゴヌクレオチド MUC2/フォワードオーダーメイドAGGATCTGAAGTGTGTGTGTG
オリゴヌクレオチド MUC2/リバースオーダーメイドTAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
オリゴヌクレオチドTBP/フォワードカスタムメイドACGCCGAATATAATCCCAAGCG
オリゴヌクレオチドTBP/リバースカスタムメイドAAATCAGTGCCGTGGTTCGTG
光学接着剤カバーライフテクノロジーズ ヨーロッパBV4311971
PD0325901ステムセルテクノロジー72184
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジーズヨーロッパ BV15140122
プレートシェーカーパナソニック
PowerUp SYBR グリーンマスターミックスフィッシャーエメルゴA25776
プリモシンInvivoGenANT-PM-2初代細胞用抗菌製剤
Qubit RNA HS アッセイキットLife Technologies Europe BVQ32852
マルチチャンネルピペット用試薬リザーバーSigma-AldrichCLS4870
REMS オートサンプラー 24プローブまたは96Cプローブ付きWTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain KitThermo scientific87023
RNase-Free DNase SetQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
セロジカルピペットグライナー バイオワン606180 / 607180 / 760180
セロロジカルピペット (ピペットエイド)ドラモンド
シングルエッジカミソリブレードGEM サイエンティフィック
スーパースクリプト RT-PCR 用第1ストランドシステムライフテクノロジーズ ヨーロッパ BV11904018
テカン スパーク 10M プレートリーダーテカン
Trypan Blue Solution, 0.4%Life Technologies Europe BV15250-061
TrypLE Express Enzyme (1x)Life Technologies Europe BV12605-010細胞解離試薬 1
ウォーターバスグラント
Y27632 (ROCK阻害剤)AbMoleM1817
ズ

参考文献

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