Method Article

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ソミトジェネシスは脊椎動物の胚発生の特徴である。長年にわたり、研究者は、エクスビボおよびインビトロアプローチを包含する幅広い技術を使用して、さまざまな生物におけるこのプロセスを研究してきました。しかし、ほとんどの研究は依然として2次元(2D)イメージングデータの解析に依存しているため、複雑な3D空間での非常に動的な相互作用を伴う軸の延長やソミトジェネシスなどの発生プロセスの適切な評価が制限されています。ここでは、マウスのライブイメージング取得、データセット処理、視覚化、および3Dおよび4Dでの解析を可能にし、これらの発生プロセスに関与する細胞(例えば、神経中胚葉前駆細胞)を研究することを可能にする技術について説明する。また、マウス胚における光投影断層撮影法およびホールマウント免疫蛍光顕微鏡(サンプル調製から画像取得まで)のためのステップバイステップのプロトコルを提供し、3D画像データを処理および視覚化するために開発したパイプラインを示します。これらの技術のいくつかの使用を拡張し、軸方向の拡張とソマイト形成(3D再構成など)の現在の理解を向上させるために使用できる、利用可能なさまざまなソフトウェア(フィジー/ ImageJ、Drishti、Amira、Imarisなど)の特定の機能を強調します。全体として、ここで説明する技術は、発生生物学における3Dデータの視覚化と分析の重要性を強調しており、他の研究者が脊椎動物の軸延長とセグメンテーションの文脈で3Dおよび4D画像データにうまく対処するのに役立ちます。最後に、この研究は脊椎動物の胚発生を教えることを容易にするための新しいツールも採用しています。

Introduction

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脊椎動物の体軸形成は、胚発生中に起こる非常に複雑で動的なプロセスです。胃形成の終わりに[マウスでは、胚発生日(E)8.0頃]に、神経中胚葉前駆細胞(NMP)として知られるエピブラスト前駆細胞のグループが、頭から尾への配列における軸延長の重要な駆動因子となり、頸部、体幹および尾部形成中に神経管および近軸中胚葉系組織を生成する1、2、3、4.興味深いことに、これらのNMPが尾側エピブラストで占める位置は、中胚葉または神経外胚葉に分化する決定において重要な役割を果たしているようです5。現在、NMPの正確な分子指紋は得られていませんが、これらの細胞は一般にT(Brachyury)とSox2 5,6を共発現すると考えられています。NMPの運命決定を調節する正確なメカニズム(すなわち、それらが神経経路をとるか中胚葉経路をとるか)は、正確に定義され始めたばかりである。原始的な筋状領域におけるTbx6発現は、NMP運命決定の初期マーカーであり、この遺伝子は中胚葉6<....

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Protocol

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動物を対象とした実験は、住宅、畜産、福祉に関するポルトガル(Portaria 1005/92)および欧州(指令2010/63/EU)の法律に従っていました。このプロジェクトは、「Instituto Gulbenkian de Ciência」の倫理委員会とポルトガルの国家機関「Direcção Geral de Alimentação e Veterinária」(ライセンス参照:014308)によってレビューされ、承認されました。

1. 3Dおよび4Dイメージング用のサンプル調製

注:ここでは、ライブイメージング用のマウスE8.25~E10.5胚(1.1)、全マウント免疫蛍光顕微鏡用のE7.5~E11.5胚(1.2)、および光投影断層撮影用の胎児(1.3)の解剖および調製方法について詳しく説明します。

  1. ライブイメージングのためのサンプル調製
    1. マウス胚解剖およびライブイメージングのための調製(例えば、LuVeLu レポーター23)。
      1. E8.25とE10.5の間のマウス胚を予め加温したM2培地(37°C)で解剖する。清潔な鉗子を使用して卵黄嚢を静かに取り除き、新鮮なM2培地で胚を1回洗い流して、解剖中に生じた血液や破片を取り除きます。
        注:胚を何らかの方法で損傷させないようにすることが重要です、さもなければそれはライブ....

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Results

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ライブおよび免疫蛍光イメージングの両方についてこの論文に示された代表的な結果は、20×1.0NAの水対物レンズ、960nmに同調された励起レーザー、およびGaAsP光検出器(Dias et al. (2020)43に記載されているように)を備えた2光子システムを使用して得られた。光学投影断層撮影は、カスタムビルドのOPenTスキャナ(Gualda et al. (2013)28に記載されているように)を使用して行われた。

ライブイメージング(4D解析)
軸伸長中のマウス胚におけるLuVeLuレポーター活性の代表的な分析を、「ライブイメージングのためのサンプル調製」のための記載されたプロトコールに従って得た(ステップ1.1;「3Dイメージングのためのサンプル調製」セクション、「ライブイメージングデータセットの前処理」(ステップ3;「画像データセットの前処理」セクション)および「Imarisを使用した3D可視化と解析」(ステップ4.4;「3Dレンダリン.......

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Discussion

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軸方向の伸長とセグメンテーションは、脊椎動物の胚発生中に起こる最も複雑で動的なプロセスの2つです。単一細胞追跡を伴う3Dおよび4Dイメージングの使用は、しばらくの間、ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚の両方においてこれらのプロセスを研究するために適用されており、そのためにアクセス可能性および培養条件が複雑なイメージングを容易にする19、44、45、46、47、48、49.対照的に、マウス胚の中期および後期の器官形成段階は、例えばインタバイタルイメージング50においていくつかの進歩がなされているが、そのような詳細においてはあまり研究さ.......

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Disclosures

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著者らは利益相反がないと宣言しています。

Acknowledgements

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LuVeLuレポーター株のオリビエ・プルキエとアレクサンダー・オーレフラ、RapiClearテストサンプルのSunJin研究所、BigStitcherを使用した支援のHugo Pereira、ライブイメージング装置のセットアップを支援してくれたNuno Granjeiro、IGC動物施設、およびこの作業の過程で有益なコメントとサポートを提供してくれたMalloラボの過去および現在のメンバーに感謝します。

我々は、ポルトガル2020年パートナーシップ協定に基づき、欧州地域開発基金(FEDER)及びFundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT, Portugal)を通じて、リスボン地域運用プログラム(Lisboa 2020)が共同出資する、ポルトガルの資金提供 ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122及びref# PTDC/BII-BTI/32375/2017の支援を受けているIGCの先進イメージングファシリティの技術支援に感謝する。この原稿に記載されている研究は、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-030254(FCT、ポルトガル)およびSCML-MC-60-2014(サンタカーサダミゼリコルディア、ポルトガル)に助成金を支給し、M.M、研究インフラCongento、プロジェクトLISBOA-01-0145-FEDER-022170、およびPhDフェローシップP....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アガロース低ゲル化温度シグマA9414胚の取り付けに使用(例:OPT用)
Amiraソフトウェアサーモフィッシャー-商業用ソフトウェアツール
Anti-Brachyury(ヤギポリクローナル)RおよびDシステムAF2085 RRID:AB_2200235免疫蛍光
Anti-Sox2(ウサギモノクローナル)Abcamab92494 RRID:AB_10585428免疫蛍光
抗Tbx6 (ヤギポリクローナル)R & D システムAF4744 RRID:AB_2200834免疫蛍光
抗ラミニン111 (ウサギポリクローナル)シグマL9393 RRID:AB_477163免疫蛍光
抗ヤギ 488 (ロバポリクローナル)分子プローブA11055 RRID:AB_2534102免疫蛍光
抗ウサギ 568 (ロバポリクローナル)サーモフィッシャー  ScientificA10042 RRID:AB_2534017免疫蛍光ベン
ジルアルコール (99+%)(任意)-胚 (BABB の成分) の除去に使用 (BABB の成分)
息香酸ベンジル (99+%)(任意の)-胚の除去に使用 (BABB の成分)
ウシ血清アルブミンBiowestP6154免疫蛍光
カバーガラス 20x20 mm #0(任意)-100um厚
カバーグラス20x20mm#1(any)-170um厚
カバーグラス20x60mm#1.5(any)-「スライド」
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩)Life TechnologiesD3571免疫蛍光法用
Drishtiソフトウェア(オープンソース)-フリーソフトウェア
ツール EDTASigmaED2SS脱塩用
Fiji/ImageJソフトウェア(オープンソース)-フリーソフトウェアツール
GlycineNZYtechMB01401免疫蛍光法
ホイヘンスソフトウェア サイエンティフィック ボリューム イメージング-商用ソフトウェア
ツール HyClone 定義 胎児ウシ血清GE Healthcare#HYCLSH30070.03ライブ イメージング用
過酸化水素溶液 30 %ミリポア1085971000クリア
イマリス ソフトウェアビットプレーン / オックスフォード インスツルメンツ-商用ソフトウェアツール
iSpacersSunJin Lab(さまざま)調製物のスペーサーとして使用
L-グルタミンGibco#25030–024ライブイメージング媒体用
低グルコースDMEMGibco11054020ライブイメージング媒体用
M2 培地SigmaM7167胚の解剖用
メタノールVWRVWRC20847.307脱水および再水和ステップ用
サリチル酸メチルSigmaM6752胚の透明化に使用
パラホルムアルデヒドSigmaP6148胚を固定するための溶液に使用
ペニシリン-ストレプトマイシンSigma#P0781ライブイメージング培地
PBS(リン酸緩衝生理食塩水)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52胚をクリアするために使用
Secure-SeaハイブリダイゼーションチャンバーSigmaC5474スペーサーとして使用準備
simLabソフトウェアSimLabソフト-商業ソフトウェアツール
スライド、くぼみ凹面ガラス - 75x25 mm(任意)-厚い胚をマウントします。
Triton X-100SigmaT8787免疫蛍光法
安用

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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