Method Article

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

DOI:

10.3791/62088

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May 22nd, 2021

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。

Abstract

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哺乳類の脳の適切な発達は、神経幹細胞増殖と異なる神経細胞タイプへの分化の細かいバランスに依存しています。このバランスは、転写、転写後、翻訳など、複数のレベルで微調整された遺伝子発現によって厳しく制御されます。この点で、証拠の成長体は、神経幹細胞の運命決定を調整する際の翻訳調節の重要な役割を強調しています。ポリサム分画は、グローバルおよび個々の遺伝子レベルの両方でmRNA翻訳状態を評価するための強力なツールです。ここでは、開発中のマウス大脳皮質からの細胞の翻訳効率を評価するための社内ポリソームプロファイリングパイプラインを提示する。我々は、sucrose勾配調製、組織ライシス、超遠心分離及び分画ベースのmRNA翻訳状態の分析のためのプロトコルを記述する。

Introduction

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哺乳類の脳の発達の間に、神経幹細胞は増殖し、分化してニューロンとグリア1、2を生成する。このプロセスの摂動は、脳の構造と機能の変化につながることができます, 多くの神経発達障害に見られるように3,4.神経幹細胞の適切な行動は、特定の遺伝子5の調整された発現を必要とする。これらの遺伝子のエピジェネティックおよび転写制御は鋭意的に研究されているが、最近の知見は、他のレベルでの遺伝子調節が、神経幹細胞増殖と分化6、7、8、9、10の協調にも寄与することを示唆している。このように、翻訳制御プログラムに取り組むことは、神経幹細胞の運命決定と脳の発達の根底にあるメカニズムの理解を大きく進める。

リボソームプロファイリング、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)およびポリソームプロフ....

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Protocol

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すべての動物の使用はカルガリー大学の動物ケア委員会によって監督されました。実験に用いたCD1マウスは、市販業者から購入した。

1. ソリューションの準備

注: RNA の劣化を防ぐために、RNase 除染ソリューションを使用して、ワークベンチとすべての機器をスプレーします。RNaseフリーのヒントは実験に使用されます。すべてのソリューションは、RNaseフリーの水で調製されます。

  1. DMSOでシクロヘキシミドストック液(100mg/mL)を調製し、-20°Cで保管してください。
  2. RNaseフリー水に75.3 gのスクロースを加え、体積を100 mL(〜16勾配調製用)に上げて2.2Mスクロースストック溶液を準備します。溶液は長期保存のために-20 °Cで保つことができる。
  3. 10x塩溶液(1 M NaCl;200 mMトリス-HCl、pH 7.5;50 mM MgCl2)を準備する)。
  4. 60%(w/v)スクロースチェイス溶液を調製し、30gのスクロース、5 mLの10倍の塩溶液を含み、RNaseフリー水で最大50mLの体積を上回ります。
  5. 必要に応じて、ブロモフェノールブルーの斑点または1%ブロモフェノールブルーの約5μLをRNaseフリーウォーターに加えて、チェイス溶液に加えます。1.6. 4 °Cでソリ....

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Results

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デモンストレーションとして、75μg RNA(8胚からプール)を含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。254 nmにおけるUV吸光度のピークは、40Sサブユニット、60Sサブユニット、80Sモノソームおよびポリソームを含む画分を同定した(図4A)。大きいリボソームサブユニットのウェスタンブロットによる分画の分析は、Rpl10は60Sサブユニット(画分3)、単数(画分4)およびポリソーム(画分5〜12)におけるその存在を示した(図4B)。対照的に、細胞質タンパク質GapdhとCsde1はリボソームと関連していなかったが、遊離RNAを含む分画(画分1)で濃縮された(図4B)。異なる画分におけるタンパク質の分離と一致して、我々は、gapdhとsox2 mRNAが重いポリソーム(画分7-12の3つ以上のリボソーム)を含む画分において非常に富化していることを発見し、ガプドおよびsox2.......

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Discussion

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ポリサムプロファイリングは、単一遺伝子およびゲノムワイドレベル14 の両方で翻訳状態を評価する一般的かつ強力な技術である。本レポートでは、開発中のマウス皮質を分析するための、ホームアセンブルプラットフォームとそのアプリケーションを用いたポリソームプロファイリングのプロトコルを紹介する。この費用対効果の高いプラットフォームは、堅牢で再現性の高いショ糖勾配と高感度のポリソームプロファイリングを組み立て、生成することが容易です。

再現可能なポリソームプロファイリング結果17を得るためには、一貫した良質のショ糖勾配の調製が重要であることに注意する価値があります。勾配の準備中に10〜50%のスクロース溶液の体積が変化すると、下流解析でポリソームピークのシフトと結果の不一致が生じる可能性があります。さらに、針の挿入および除去の間に勾配を乱す、勾配準備の矛盾に寄与する可能性がある。他のアプローチや商用デバイスと比較して、当社の自家製グラデーション作りシステムは、準備中の勾配の乱れを軽減するために電動ス.......

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Disclosures

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著者らは競合する利益を宣言しない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、NSERCディスカバリーグラント(RGPIN/04246-2018からG.Y.)によって資金提供されました。G.Y.はカナダ研究委員長です。S.K.は、ミタックス・グローバリンク大学院フェローシップとACHRI大学院生奨学金によって資金提供されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL RNA フリーマイクロチューブAxygenMCT-150-C
10 cm ディッシュGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G ニードルBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL シリンジBD302832
鈍い端針VWR20068-781
ブレッドボードThorlabsMB2530/M
ブロモフェノールブルーΣ115-39-9
CD1 マウスチャールズリバー研究所
湾曲先端鉗子Sigma#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
データ収集ソフトウェアTracerDAQ測定コンピューティング
デジタルコンバータ測定コンピューティングUSB-1208LS
ダイレクトゾルRNAミニプレップキットZymoR2070
ジチオスレイトール (DTT)バイオベーシック12-03-3483
DMSOバイオショップ67-68-5
デュモン No.5 鉗子シグマ#F6521
フラクションコレクターBio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
リニアステージアクチュエータRattmmotorCBX1605-100A
ルシフェラーゼ制御RNA PromegaL4561
Maxima ファーストストランド cDNA 合成キットThemo FisherM1681
ミニチュア V クランプThorlabsVH1/M
ミニシリーズブレッドボードThorlabsMSB7515/M
ミニシリーズ光学ポストThorlabsMS2R/M
ミニシリーズペデスタルポストホルダーベースThorlabsMBA1
NaClバイオベーシック7647-14-5
ニューロベースメディアGibco21103-049
Ø12.7 mm アルミニウム ポストThorlabsTRA150/M
パラフィルムBemisPM992
PerfeCTa SYBR グリーン fastmixQuanta BioCA101414-274
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
直角クランプThorlabsRA90/M
直角Ø1/2 "からØ6 mm ポストクランプThorlabsRA90TR/M
RNase AWAYMolecular BioProducts7002
RNase フリーチップFrogga BioFT10, FT200, FT1000
RNase フリーウォーターWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
スリム直角ブラケットThorlabsAB90B/M
小さいVクランプThorlabsVC1/M
ナトリウムのデオキシコール酸塩のシグマ302-95-4
のステッピング モーター ドライバーSongHeTB6600
スクロースBioshop57501
SW 41 Tiの回転子ベックマン・コールター331362
シリンジ ポンプハーバードの装置70-4500
シリンジポンプハーバード装置70-4500
Triton-X-100バイオベーシック9002-93-1
Trizolサーモフィッシャー サイエンティフィック15596018
チューブピアサーブランデルBR-184
超遠心分離機ベックマン・コールターL8-70M
超遠心チューブベックマン・コールター331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNOプロジェクトスーパースターターキットElegooEL-KIT-003
UVモニターBio-RadEM-1 Econo
Vertical bracketThorlabsVB01A/M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

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