このプロトコルは、多発性硬化症の動物モデルにおける陽電子放出断層撮影(PET)イメージングによる インビボ ミエリン変化(脱髄および再髄鞘化)をモニタリングすることを目的としている。
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サマリー
要約
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系における軸索および神経変性および脱髄を伴う神経炎症性疾患であり、MS進行中に運動障害、精神障害、認知障害を引き起こす。陽電子放出断層撮影(PET)は 、生体内 細胞および分子変化を定量化できるイメージング技術である。
インタクトミエリンに親和性を持つ放射線トレーサーは、時間の経過とともにミエリン含有量の変化の インビボ イメージングに使用することができる。ミエリン含有量の増加または減少のいずれかを検出することができ、このイメージング技術が中枢神経系の脱髄および再髄鞘化プロセスを検出できることを意味する。このプロトコルでは、PETイメージングを用いて、焦点脱髄病変(立体性注射によって誘発される)のモデルであるリゾレシチンラットモデルにおけるミエリン変化を検出する方法を示す(すなわち、多発性硬化症のモデル)。 11C-PIB PETイメージングはベースラインで行い、ラット脳の右線条体(4μL)および脳梁(3μL)に1%のリゾレシチンを立体的に注射してから1週間および4週間後に行い、焦点脱髄(1週間後の注射部位)および再髄化プロセス(注射部位4週)の定量化を可能にした。
ミエリンPETイメージングは、脱髄疾患の進行および治療応答を監視するのに有用であり得るミエリン含有量の 生体内 変化を監視するための興味深いツールです。
概要
多発性硬化症(MS)は、炎症、脱髄、および軸索喪失を特徴とする中枢神経系に影響を与える神経炎症性疾患である。この病気の予後は治療の進歩があっても変動し、若者の神経障害の最も一般的な原因の1つである。MSの診断は、磁気共鳴画像法(MRI)2、3による特徴的な病変の臨床症状および可視化の基準に基づいている。
陽電子放出断層撮影(PET)は、MSの進行および治療効果の生体内モニタリングに有用なツールとなり得る。炭素-11(11 C-PIB)で標識されたピッツバーグ化合物Bラジオトレーサー(PIB)は、βアミロイドプラークを定量するために広く使用されています。しかし、過去10年間に、ミエリン含有量を定量化し、動的脱髄と再髄鞘4、5、6を示すことを検討した。
異なるアミロイドPETトレーサー(11C-PIB、18 F-florbetaben、18 F-florbetapir、18 F-flutemetamol)を使用してミエリンを定量化し、疾患の進行および治療応答に関する重要な情報を提供し、神経炎症の干渉なしに脱髄および再髄鞘化プロセスの同定を可能にする。 アミロイドPET画像投射は、活動患者8における早期白質損傷によって説明することができる非活動患者と比較して、活性MS患者におけるトレーサー取り込みの減少を示した。下方アミロイドトレーサー取り込みもフォローアップ研究における認知機能の低下と関連しており、この技術が疾患および臨床転帰の病態生理を研究するための貴重なツールであることを示す9。
リゾレシチン(LPC)ラットモデルは、多発性硬化症の化学的誘導モデルであり、そこで注入された毒素、LPCは、炎症の増加をもたらすマクロファージの高応答を誘導し、その結果、脱髄10、11。脱髄は約4週間で急速に逆転し、げっ歯類の脱髄および再髄鞘化プロセスを評価するための良いモデルになります。このモデルは、PETイメージングを用いて既に評価されており、結果は良好であり、事後分析エッセイ12と相関している。
ここでは、リゾレシチンラットモデルにおいて 11C-PIBを用いたミエリンPETイメージングのプロトコルを提示し、このイメージング技術を示し、ミエリン含有量の 生体内 測定に有用なツールとなる。
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プロトコル
すべての手順は、動物実験管理のための国家評議会のガイドラインに従って行われました (コンセパ, ブラジル) サンパウロ大学医学部動物研究倫理委員会によって承認されました (CEUA-FMUSP, ブラジル - プロトコル番号: 25/15).
注:このプロトコルでは、多発性硬化症のリゾレシチンラットモデルを誘導する方法と、ミエリンPET画像を取得して分析する方法を示しています。
1. リゾレシチン溶液調製
- コニックプラスチックチューブ(1.5 mL)を用いて分析スケールでリゾレシチン(卵黄由来のL-α-リゾホスファチジルコリン)を計量する。
- チューブに滅菌生理液を加えて1%溶液を作り(例:1mgのリゾレシチンを計量し、生理液剤100μLで溶解する)、チューブを振ってリゾレシチンを溶解します(左右に揺れ、上から下に回さない)。
- 動物モデル誘導を開始する直前に溶液を準備します(最終的な準備が整った溶液はストックしないでください)。
2. リゾレシチンラットモデル - 立体外科
- 220 - 270 gの間の重量を量る雄のウィスターラットを使用してください。すべての手順で手袋とマスクを使用してください。
- 誘導ボックスを用いて5%のイソフルランを100%O2(1L/min)に混合して麻酔を誘発する。 動きの不在を観察することによって動物が麻酔されているかどうかを確認してください(呼吸のみを観察する必要があります)。
- 動物を加熱パッドの立体装置に置きます。動物の鼻と耳を器具に固定します。
メモ:立体外科手術の方法の詳細は、JoVE科学教育データベースで見つけることができます。 神経科学. げっ歯類立体外科手術。ジョーブ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、2021年。- 全体の手順のための麻酔を監視します (手術や画像の取得を含みます).イオフルラン濃度を調整するには、動物の呼吸数を観察します。速い呼吸数は高い濃度を必要とし、ゆっくりとした呼吸数は麻酔薬濃度が低い必要があります。
- 鎮痛薬(ケトプロフェン - 5 mg/kg)を皮下に注入します(生理食塩水で1mLに薬を希釈すると、動物を水分補給するのに役立ちます)。
- 脱水症状から保護するために、動物の目にアイクリームを入れてください。
- 0.5%のクロルヘキシジン溶液を使用して、切開面積を洗浄します。
- 100 μL の塩酸リドカインを切開領域に皮下2%注入します。
- 頭蓋骨の領域を剃ります。
- この手順には滅菌器具を使用してください。
- メスを使用して、頭蓋骨の上に皮膚に約2cmの切開を行います。
- ブルドッグクランプで頭蓋骨を露出させる。
- 綿棒を使用して、1%のペルオキシダーゼで頭蓋骨領域をきれいにします。
- ブレグマを見つけてマークします(ステレオタキシックラット脳アトラスはブレグマを識別するのに役立ちます)。
- ハミルトン注射器(μL神経注射器)をブレグマに置きます。
- ブレグマとステレオタキシックアトラスを基準に、ハミルトンシリンジを次の座標に配置します:前部後部:-0.30mm、側側側:-3.0mm、頭蓋骨に触れるまで腹側、頭蓋骨に印を付け、紙の座標方向に注意します。
- マークされた座標で頭蓋骨をドリルします。デュラマーターに注意してください(損傷したデュラマーは、出血の多くを引き起こす可能性があります)。
- 7 μL のリゾレシチン溶液 (生理食糸で 1%) を使用して、ハミルトンシリンジを充填します。より大きなボリュームはシリンジに入れることができますが、注入されるのは7μLだけです(ボリュームを正しく測定するために、シリンジから泡を取り出します)。
- ハミルトン注射器を前の座標に置き、薬物注射を開始します(合計7 μLから3つの異なる腹側立体立体性座標)。前述の座標を考慮して、ハミルトンシリンジを腹側座標-5.0 mmまで下げます。
- リソレシチン溶液を2μL非常にゆっくりと注入します(1μL/10分)。3分待ちます。
- 針を次の腹側立体立体座標(-4.2 mm)までとり、2μLのリゾレシチン溶液(1μL/10分)をゆっくりと注入します。3分待ちます。
- 3番目の腹側座標-3.0 mm(3 μLのリゾレシチン溶液 - 1 μL/ 10分)を注入します。
- 5分待ってから、ハミルトン注射器を脳から取り除く。
- 皮膚を縫合する。
- 動物を立体化装置から取り出し、動物を目覚めさせる。
- 動物を自宅のケージに戻し、動物を単独で飼い、不快感の兆候を確認します。
- 手術後24時間と48時間で、生理食塩水で希釈した皮下鎮痛薬(ケトプロフェン - 5mg/kg)を注入する。
3. PETの取得
- 注射器中の 11C-PIB放射能の7〜20 MBqを取る(1 mLはラットの静脈注射に許容される最大容積である)。
- 誘導ボックスを使用して、5%のイソフルランを100%O2(1 L/min)に混合して動物を麻酔します。
- 11C-PIB(上記の項目4.1で定義された放射能)を陰茎静脈に注入するか、またはラットの尾静脈(両方の投与部位は問題なく、決定は個人的な選択である)。場所が関心領域(脳)に近すぎて画質が損なわれる可能性があるため、レトロ軌道注入を使用しないことをアドバイスするだけです。
注:ベースライン時間の画像取得は、立体的注射前に行われ、手術後1週間および4週間後に他の2つの時点ポイントを行います。 - 動物が目を覚ますために麻酔から動物を取り除きます(完全に目が覚めるまで、動物を暖かいパッドに残します)。
- 家のケージに動物を返します。
- 次のステップまで30分待ちます。
- 誘導ボックスを用いて100%O2(1L/分)に混合した5%のイソフルランでラットを麻酔する。
- PETスキャナソフトウェアを開きます。
- [ スキャン] > [ペット対応]を選択します。
- 完全な主な研究者の詳細、研究ID、シリーズID、動物ID、動物の体重(g)、および追加の注意事項。[ 次へ] をクリックします。
注意: 動物の重みでは、10 進数にドット (.) を使用します。 - スキャン用の ROI 領域を編集します (通常は 3 ~ 8)。これは画像に含まれる領域です(ベッドカバーの数字3と8の間の領域が最終画像に表示されます)。
- 麻酔ラットをPETスキャナーの標準ラットベッドに置き、麻酔をオンにします(100%O2の3%イソフルランが良いスタートであり、必要に応じて麻酔速度を調整する必要があります)。麻酔を調整するには、スキャナソフトウェアのモニタリングデータを調べて、動物が一定の遅いリズムで呼吸していることを確認します。
注:活性炭フィルターに結合された真空ポンプをオンにして、イソフルランガス過剰を回収します(ポンプが利用可能な場合)。 - 動物の目を保護するためにアイクリームを適用します。
- ペットスキャナー内の動物用ベッドを押します。
- 完全なアクティビティの詳細、アクティビティキャリブレーション時間、同位体(C-11)、スキャン時間(20分)を完了します。[ スキャンの開始 ] を選択します。
注意: ペット移動ベッド のメッセージが表示され、動物のベッドが機器に移動し、以前に選択したROI位置で停止します。取得の時間はカウントダウンを開始し、秒あたりのカウント数(CPS)が表示されます。 - スキャナ ソフトウェアで、画面左側の [モニタ ] タブに移動し、[ しきい値 を呼吸パラメータの変更 (BPM) に変更する] をオンにします。
注: ウィンドウがポップアップし、しきい値パラメーター (500) が表示されます。 [OK] をクリックします。 - 0% POWERに移動して、スキャン中に動物を加熱する温度パラメータを変更します。ウィンドウがポップアップ表示されます。パラメータを入力します (80 ~ 100)。[OK] をクリックします。
注:室温の条件に基づいて80〜100%の電力を選択してください(より多くの電力が、暖かくなるでしょう)。 - [スキャン]タブに戻ります。
- 設定ツール(歯車アイコン)に移動し 、射出時間、残存アクティビティ、残りのアクティビティキャリブレーション時間を完了します。[ 保存 ] を選択します。
メモ:ウィンドウがポップアップ表示されます"プロトコルのメタデータを変更してもよしますか?"> はい - [モニター ] タブに戻ります (動物の呼吸パラメータを確認し、必要に応じてイソフルラン濃度を増減します - 通常、100%O2で3%で十分です)。
- PETの取得が完了すると 、Pet Ready メッセージが [スキャン ]タブに表示され、動物のベッドを移動するには 、アローアウトアイコン (構成ツールの左)をチェックします。
- 麻酔から動物を取り除き、暖かいパッドで目覚めさせてください。
- イメージを再構築するには、[再構築] タブに移動します。
- 画面左下のプラスアイコンをチェックし、再構築するスタディファイルを選択します。[ 次へ] をクリックします。
- エネルギー解像度ツールに移動します。ウィンドウがポップアップします。エネルギーピーク(keV)を機器パラメータに設定します(毎月の品質管理に基づきます)。[閉じる ]を選択します。
注:エネルギーピークは、毎月の機器のキャリブレーションを実行すると、毎月変化する可能性があります。 - 他のすべてのパラメータをデフォルトとして保持します(等角線ボクセルサイズ:400 mm;反復回数:30;エネルギー分解能: 30% ;最後のイテレーションのみを保存します。[バイナリ データを保持する] チェック ボックスをオフにします。
- [追加]をオンにします。
注:ウィンドウがポップアップ表示されます "再構築は、キューに追加され、他の人が終了したら開始されます". [OK] をクリックします。[再構築] タブの再構築リストにファイルが表示され、ステータスは待機中または % (進行状況) または完了として表示されます。
4. 画像解析
注: 専用の画像解析ソフトウェアを使用して画像解析を実行します。現在のプロトコルでは、デモでは特定のソフトウェア プログラムを使用していますが、使用できない場合は、他のオプションを使用できます。
- PMOD を開き、それを融合します。
- 画面の上部にある [マッチング] タブに移動します。
- 画面の右中央にある [入力をロード] メニューを開き、[ファイルの自動検出]を選択し、[PETファイル(DICOM、インターファイルまたはNifTI)]を選択し、選択したファイルに追加し、操作をクリックし、[標準方向に再設定]をクリックして、[ ロード して閉じる]をクリックします。
- 動物 種 が画面の下部にある正しいかどうか確認します (RAT)。
- 画面右下の [トリミング ]ボックスをオンにします。
- 脳全体を取るためにPET画像の黄色のボックスサイズを調整します。
- 画面右側の [リジッド ]ボタンをクリックします。確認ウィンドウで [ はい] をクリックします。
- 画面の右中央にある脳ツールをクリックして、リファレンスアトラスを開きます。Pxラット(W.シファー) - T2を選択します。
- 右上のタブから [結果の一致 ]を選択します([処理ステージ]タブを選択)。
- [ データの更新 ](右上メニューの4番目のタブ)をクリックします。
- 回転ツール(PET画像の中央に白いアイコン)を使用して、参照テンプレートにPET画像を揃えます。3つの解剖面のアライメントをチェックしてください。
- 共同登録ファイル(画面の右側メニュー)を保存します。
- 出力形式 (DICOMor NifTI)、ディレクトリおよびファイル接頭辞を選択します。[ 保存 ]をクリックします。
メモ:共同登録出力がNifTiとして保存されると、ヘッダーイメージ情報は失われます。 - 画面下部の [VOIs] メニューをクリックします。
- 画面下部の テンプレート > アトラス (VOI ウィンドウの下) に移動します。
- ドロップダウンメニューから Px ラット(W.シファー)を選択します。
注: 特定の VOI のみを分析する必要がある場合は、関心のある脳領域のみを選択できます。脳アトラスのすべての脳領域が必要な場合は、アクションは必要ありません。 - 画面下部の [ アウトライン ] をクリックします。
注: VOI ウィンドウに脳領域の VOI が表示されます。 - 手動で病変部位と逆脳半球領域(11C-PIB低取り込み領域と対側脳半球)にVOIを描きます。
- 11C-PIB低取り込みでPET画像の領域をクリックします。
- [ 新しい VOI]-[OK] を選択します。
注: スプレッドシートが表示されます - 画面中央の SPHERE アイコン(VOIウィンドウの左側)に移動します。
メモ: スプレッドシートが表示されます。 - VOI 名: 病変を選択し、[適用] を選択します。
注: 共同登録されたイメージに球が表示されます。 - 病変領域に球を合わせ、すべての解剖平面のVOIを調整します。
- スプレッドシートの下部にある[ 閉じる ]をクリックします。
- [VOI]リストから、病変VOIを選択します。
- VOI ミラーリング操作のアイコン (VOIウィンドウの右上) に移動し、[クローンと左右のミラーリング] を選択します。
- VOI リスト ウィンドウの上部にある [選択した VOI 統計の計算 ] に移動します。[ 計算する統計を選択 ] アイコンに移動して、出力データ (VOI 統計情報アイコンの右側) を選択します。通常、ミエリンコンテンツの統計 VOI、平均、SD、最小、最大のグループの統計)。
メモ: スプレッドシートが表示されます。デフォルトの設定データ単位は kBq/cc です。スプレッドシート(VOI統計)の左上で、データユニットをSUV(標準化された取り込み値)として確認できます。前に説明したように、スキャナソフトウェアでラジオトレーサ管理と画像取得の詳細を正しく完了した場合、SUVデータはPMODソフトウェアによって自動的に計算され、そうでなければ詳細を編集することができます。 - [ システム ロケールの番号形式を使用してコピー] に移動します。
注:すべての統計情報が出力としてコピーするように選択されているかどうかを確認します(画面の右上にある[確認]アイコン)。コピーされるデータは、選択したデータユニットによって異なります。 - 出力データをメモ帳またはスプレッドシートに貼り付けます。
メモ:数字の間のドット記号とカンマ記号のソフトウェア設定に注意してください。言語の構成によって異なる場合があります。 - スタディ名と詳細を含むファイルを保存します。
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結果
図1は、経時にミエリン変化を伴う 11のC-PIB PET画像を例示する。ベースラインスキャンでは、ミエリン含有量に違いは見られない(すなわち、脱髄は存在しない)。1週間のタイムポイント画像では、白い矢印で示されるように(右半球の)焦点脱髄病変を見ることができます。画像は3つの解剖学的面(冠状、軸、および矢状)で提示され、それらのすべての脱髄病変を識別することが可能である。1週間の画像は、注射部位での十分に区切られた病変の図であり、正しいモデル誘導および画像検出を表す。4週間の画像では、病変が見えなくなり、再髄鞘化が起こり、ミエリン含有量が正常(またはそれに近い)に戻っていることを示す。
代表的なグラフは、3つの異なる時点での4匹の動物の画像の定量を示す。第1のグラフは、リソレシチン注入が行われたより焦点的なミエリン変化を示す逆側側比に対する病変(手動VOI)の定量化の結果を示す。2番目のグラフは同じ定量化を示していますが、線条体(逆側比に対する線条体を注入した線条体)では、その差は統計的に有意ではな...
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ディスカッション
多発性硬化症を研究するためにリゾレシチンモデルを使用することの最大の利点は、脱髄(約1週間)および再髄鞘(約4週間)が14を発生するための速いタイムラインである。このモデルはマウス15でも誘導できるが、ラットでの誘導はマウスに比べてラットの脳の大きなサイズに起因する in vivo PETイメージングに対してより有利である。
誘導モデルの最初のステップは、非常に慎重になることです。このモデルは、2014 年にde Paula Fariaらら10によってミエリンPETイメージングのために検証され、脳内のリソレシチン注入の速度が良好に誘導されたモデルにとって重要であることを示した。注射は、組織の損傷を回避する方法として、10分ごとに1μL、非常にゆっくりと行わなければなりません。リゾレシチン溶液はまた、手術手順を開始する直前に、好ましくは、立体注射と同じ日に調製する必要があります。研究グループで初めてモデルを使用する場合は、P...
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謝辞
βキューブ機器(モグラキューブNV、ベルギー)は、サンパウロ研究財団、FAPESP - ブラジル(#2018/15167-1)によってサポートされました。LESには、FAPESP - ブラジル(#2019/15654-2)の博士課程の学生奨学金があります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 分析天びん | マルテ | AUWZZOD | 最大:220 g-分:1 mg |
| 麻酔気化器 | Nanitech | 15800 | |
| ベータキューブ | Molecubes | ||
| ブルドッグクランプ | Stoelting | 5212043P | |
| クロレキシジン | リオキミカ | 0.5%/100 mL | |
| 綿棒 | ジョンソン e ジョンソン | ||
| 用量キャリブレーター | Capintech | ||
| ドリル | Kinzo 電動工具 | 352901 | モデル Q0M-DC3C |
| エッペンドルフチューブ | エッペンドルフ | 30125150 | 1.5 mL |
| アイ潤滑剤 | ADVFARMA | 30049099 | ワセリン15 g(医薬品純度) |
| 細かい鉗子 | Stoelting | 52102-38P | |
| 手袋 | Descarpack | 212101 | 6.5サイズ |
| 加熱パッド | Softhear | ||
| 注入シリンジ | ハミルトン | 80314 | 10µ、32ga、モデル701 |
| インスリンシリンジ | BD | 328328 | 針付き1mLインスリンシリンジ |
| ソフルラン | クリストália | 410525 | 100 mL、濃度1 mL / 1 mL |
| トプロフェンまたは他の鎮痛剤 | サノフィ | 100 mg / 2 mL | |
| リドカイン | 2%/ 20mL | ||
| L-&α;-卵黄からのリゾホスファチジルコリン | Sigma-aldrich | L-4129 | 25 mg - ≥99%、タイプI、粉末 |
| ニードルホルダー | ストールティング | 5212290P | |
| 酸素 | ホワイトマーティン | 7782-44-7 | 圧縮ガス |
| PMODソフトウェア | PMOD技術 | バージョン4.1 | モジュール ヒューズ |
| ラット麻酔マスク | KOPF | モデル906 | |
| 生理食塩水 | Farmace | 0543325/ 14-8 | 0.9% 塩化ナトリウム注射用、10mL |
| スケーペルブレード | ストールティング | 52173-10 | |
| スケーペルハンドル | ストールティング | 52171P | |
| シザー | ルティング | 52136-50P | |
| セミアナリシス天びん | キミス | BK-3000 | 最大:3,100 g; 最小:0.2 g |
| シェーバー | メガプロフィッショナル | AT200 モデル | |
| 定位装置 | : KOPF | ノーデル900 | |
| ニードルサポート付きユニバーサル | ホルダーKOPF | モデル1772-F1 | ミルトンサポート5および10 µL |
参考文献
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. The citation was updated.
The citation was updated from:
de Paula Faria, D., Cristiano Real, C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
to:
de Paula Faria, D., Real, C.C., Estessi de Souza, L., Teles Garcez, A., Navarro Marques, F. L., Buchpiguel, C. A. Positron Emission Tomography Imaging for In Vivo Measuring of Myelin Content in the Lysolecithin Rat Model of Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (168), e62094, doi:10.3791/62094 (2021).
