方法論記事

ヒト人工多能性幹細胞からのヒト腹側中脳アストロサイトの効率的でスケーラブルな生成

DOI：

10.3791/62095

⸱

2021年10月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、hiPSCから腹側中脳パターンアストロサイトの再現性のある生成方法と、表現型と機能を評価するための特性評価のためのプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病では、進行性の機能障害と腹側中脳のドーパミンニューロンの変性が、人生を変える症状を引き起こします。パーキンソン病では、ニューロンの変性には、アストロサイトが媒介する非細胞自律メカニズムなど、さまざまな原因があります。中枢神経系全体を通じて、アストロサイトは神経環境で代謝恒常性を維持するため、ニューロンの生存と機能に不可欠です。アストロサイトは、中枢神経系の免疫細胞であるミクログリアと相互作用して神経炎症を調節しますが、これはパーキンソン病の最も初期の段階から観察され、その病状の進行に直接影響を与えます。パーキンソン病を含む慢性神経炎症性要素を有する疾患では、アストロサイトは神経毒性表現型を獲得し、神経変性を促進します。その結果、アストロサイトは病気を遅らせたり止めたりするための潜在的な治療標的ですが、そのためにはパーキンソン病におけるアストロサイトの特性と役割をより深く理解する必要があります。したがって、in vitro研究のためのヒト腹側中脳アストロサイトの正確なモデルが緊急に必要とされています。

私たちは、パーキンソン病の研究に使用できるhiPSCから腹側中脳特異的アストロサイト(vmAstros)の高純度培養物を生成するためのプロトコルを開発しました。vmAstrosは、複数のhiPSC系統から日常的に作製でき、特異的なアストロサイトおよび腹側中脳マーカーを発現します。このプロトコールはスケーラブルであるため、薬物スクリーニングなどのハイスループットアプリケーションに適しています。重要なことに、hiPSC由来のvmAstrosは、in vivoの対応物に典型的な免疫調節特性を示し、パーキンソン病の神経炎症シグナル伝達のメカニズム研究を可能にします。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

パーキンソン病は、65歳以上の人々の2%〜3%が罹患しており、最も一般的な神経変性運動障害となっています1。これは、黒質内の腹側中脳ドーパミンニューロンの変性によって引き起こされ、衰弱性運動症状を引き起こすだけでなく、頻繁な認知および精神医学的問題を引き起こします2。パーキンソン病の病理は、タンパク質であるα-シヌクレインの凝集体に代表され、ニューロンに毒性があり、ニューロンの機能不全と死をもたらします1,2,3。ドーパミン作動性ニューロンはパーキンソン病の変性集団であるため、歴史的に研究の焦点でした。しかし、脳内の別の細胞タイプであるアストロサイトもパーキンソン病の異常を示し、パーキンソン病のモデル4,5,6,7の変性に寄与していると考えられていることは明らかです。

アストロサイトは、必要に応じて物理的にも機能的にも形質転換できる不均一な細胞集団です。それらは、ニューロンシグナル伝達の調節、シナプス構造の形成、特定の因子の分泌によるニューロン集団の栄養サポートなど、多数のメカニズムを介してニューロンの機能と健康をサポートします6,8,9,10。しかし、アストロサイトは、神経炎症の発症と伝播に不可欠な、実質的な免疫調節の役割も持っています10,11。神経炎症はパーキンソン病患者の脳で観察され、最近、パーキンソン病の症状12,13,14,15の発症を先取りすることが顕著に示されており、それによりパーキンソン病の研究の中心的な舞台に立っています。

細胞レベルでは、アストロサイトは、神経保護を促進する試みとして、損傷、感染、または病気に反応すると言われている9,6,10,16。反応性は、遺伝子発現、セクレトーム、形態、および細胞残骸および有毒副産物のクリアランスのメカニズムの変化を特徴とするアストロサイトの表現型の変化を説明する9,10,11,17。この反応性シフトは、中枢神経系の免疫細胞であり、傷害や疾患に対する最初の応答者であるミクログリアからの誘導性シグナルに応答して起こる9。アストロサイトとミクログリアはどちらも、自身の機能を緩和することで炎症シグナルに応答し、炎症シグナルを伝達して神経炎症に直接影響を与えることができます9,10。しかし、パーキンソン病の慢性的な性質は、反応性アストロサイトがニューロンに対して毒性となり、それ自体が変性および疾患の病理を促進するという移行をもたらす6,9,10,18,19。重要なことに、アストロサイトの反応性神経毒性表現型への変換をブロックすると、動物モデルでパーキンソン病の進行を防ぐことが最近実証されました11。したがって、神経炎症のパラダイムにおけるアストロサイトの反応性は、パーキンソン病の研究の主要な焦点となっており、同様にCNSの幅広い疾患に関連しています。これらの知見を総合すると、パーキンソン病の病因におけるアストロサイトの重要な関与の全体像が構築され、パーキンソン病に関与するヒトアストロサイト集団の表現型を再現する正確な研究モデルの必要性が強調されています。

胚の脳では、ニューロンが最初に現れ、アストログリア系統、すなわちアストロサイトとオリゴデンドロサイトが発達の後半に現れます6。in vivoおよびin vitroの研究では、ニューロンから星状膠細胞への神経前駆細胞の効力を制御すると思われる多くのシグナル伝達経路が強調されています。特に、JAK/STAT、EGF、およびBMPシグナル伝達は、アストログリアの増殖、分化、成熟に役割を果たしています20,21。これらの経路は、hiPSC 6,22,23を含む多能性細胞からの星状細胞の生成に関するin vitroプロトコルの焦点となっています。ヒトiPS細胞からアストロサイトを作製した成功例は数多くあります6,24,25。しかし、中枢神経系のin vivoアストロサイトは、それらのアストロサイトがそれらの特殊なニューロン隣接物17,24,25,26に関連する特定の要件に従って、その機能に直接関連する特定の局所的アイデンティティを持っていることは明らかである。例えば、特に腹側中脳に関連して、この領域のアストロサイトは、ドーパミンの受容体を含む特定のタンパク質のセットを発現し、中脳ドーパミンニューロンの局所集団とのコミュニケーションを可能にすることが実証されている26。さらに、腹側中脳アストロサイトはユニークなシグナル伝達特性を示しています26。したがって、パーキンソン病における腹側中脳アストロサイトの役割を研究するには、そのユニークな特性セットを反映したin vitroモデルが必要です。

これに対処するために、hiPSCから腹側中脳アストロサイト(vmAstros)を生成するプロトコルを開発しました。得られたvmAstroは、特定のタンパク質の発現や免疫調節機能など、in vivoの腹側中脳対応物の特徴を示します。今回発表された結果は、Tilo Kunath27博士から得られたNAS2およびAST23 hiPSC系統の分化によるものです。NAS2 は健康な対照被験者から生成されたのに対し、AST23 は、パーキンソン病患者が α-Synuclein (SNCA) をコードする遺伝子座にトリプリケーションを運んでいることに由来します。これらのhiPSC株は、以前に特徴付けられ、さまざまな神経細胞タイプの作製を含む多くの発表された研究論文で使用されてきました27、28、29、30、31。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ヒトヒトiPSCラインの融解・維持・凍結保存

  1. hiPSC培養プレートをコーティングするには、ビトロネクチンをPBS中で10 cm2 細胞培養プレートの表面積あたり1 mLで5 μg/mL(1:100)に希釈します。室温で1時間放置します。
  2. ビトロネクチンを除去し、直ちに培養プレートへのhiPSC/培地の添加に進みます。
    注:プレートからビトロネクチンを除去するときは、培養表面が乾燥しないようにすることが重要です。
  3. ヒトiPS細胞を解凍するには、液体窒素からヒトiPS細胞を含むクライオバイアルを取り出し、内容物が完全に解凍されるまで37°Cの水浴に入れます。
  4. 1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含む9 mLの温めた細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)を調製します。クライオバイアルの内容物に1 mLを滴下します。残りの8 mL培地を15 mLの遠心チューブに入れ、これに希釈したクライオバイアルの内容物を加えます。
    注意: 中身を大きくしないでください。
  5. 150 x g で3分間遠心分離します。細胞ペレットを乱さずに液体を吸引し、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含む適切な容量の細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)に再懸濁します。例えば、6ウェルプレートのウェルあたり2mLです。
  6. 再懸濁したヒトiPS細胞をビトロネクチンコーティングディッシュに加え、37°C/5%CO2 インキュベーターに入れます。
    注:hiPSCは、解凍後30分から2時間でビトロネクチン被覆プラスチック器具に付着し始めるはずです。
  7. 細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)でhiPSCを維持します。培地交換により、細胞を毎日供給します。給餌する前に、必ず30分間温めてください。
    注:E8 Flexを使用する場合、hiPSCは24時間ごとにメディアを交換する必要がなく、必要に応じて給餌増分を48時間まで延長できます。E8 FlexまたはE8培地は、同等に高品質のhiPSC培養物を提供します。HiPSCは、解凍後、分化ステップを開始する前に、最低14日間培養する必要があります。培養期間が14日未満の場合、最初の分化期間中のヒトiPS細胞の生存に悪影響を及ぼすようです。約80%のコンフルエント度でiPSCを通過させる(図1A:3-4日間の経過間隔)。
  8. 開始の1時間前に、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)をhiPSC培養物に加えます。
  9. ヒトiPS細胞をPBS(カルシウムまたはマグネシウムを含まない)で一度洗浄し、0.5 mM EDTA(カルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSのストックから希釈したもの)を加えます。
  10. 室温で5分間インキュベートするか、またはhiPSCが互いに分離し始め、より丸みを帯びた外観になり、各iPS細胞の境界が明視野顕微鏡下でより明るく見えるまでインキュベートします。
  11. ピペットで200 μL EDTAをhiPSCの焦点領域に加えます。それらが容易に剥離し、細胞層に明確なスペースができれば、収穫する準備ができています。簡単にはがかない場合は、EDTAに入れたままにして、1分後に繰り返します。
  12. 続行する準備ができたら、EDTAを静かに取り出し、ピペットを使用して、細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)でhiPSCを2回穏やかに洗浄します。
    注:ヒトiPS細胞が剥がれずにこれを実現するには、プレートを傾け、培養プレートの側面に培地をドロップダウン状に加えます。
  13. ヒトiPS細胞を回収するには、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含む1 mLの細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)を使用します。培地をhiPSC層に直接放出すると、細胞が剥離するはずです。必要に応じて、別の1 mL培地で繰り返します。
  14. 顕微鏡で hiPSC を観察します。理想的には、hiPSCは 図1Bに示すように、比較的均一なクラスターに現れるべきです。hiPSCクラスターがはるかに大きい場合、またはサイズが非常に変動する場合は、ピペットを使用して大きなhiPSCクラスターを分割します(図1B)。
    注:hiPSCを過度に縮小しないでください。このサプリメントは全細胞の生存率を増加させますが、過剰なトリチュレーションはhiPSC培養の生存に悪影響を及ぼします。ピペットによる1〜4回のパスをお勧めします。
  15. 血清ピペットを使用して、 ステップ1.1で調製したように、hiPSC懸濁液をビトロネクチンコーティングプレートに移します。hiPSC培養物を37°C/5%CO2 インキュベーターに戻します。
    注:hiPSCを約80%の密度で凍結保存します。
  16. 開始の1時間前に、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)をhiPSC培養物に加えます。
  17. ステップ1.4で説明したように、0.5 mM EDTAを使用して培養プレートからhiPS細胞を剥離し、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含む細胞培養培地(E8またはE8 Flexなど)で細胞を収集します。150 x gで3分間遠心分離します。
  18. ペレット化したヒトiPSCを細胞凍結培地に再懸濁します( 材料表を参照)。10 cm2 の培養面積あたり700 μL、これは6ウェルプレートのウェルあたり1個の凍結細胞に相当します。
  19. クライオバイアルを適切な細胞凍結容器に移します(詳細については 、材料の表を参照)。
  20. 冷凍容器を-80°Cの冷凍庫に24時間移します。24時間後、クライオバイアルを液体窒素(-196°C)に移して長期保存することができます。

2. vmAstro 差別化プロトコル

注:vmAstros差別化プロトコルの概略を 図1Aに示します。プロトコールとその調製に必要な試薬の詳細なリストを 表1に示します。

  1. vmNPCの誘導
    注:このプロトコルは、hiPSCの70%-80%コンフルエント、つまり約4-5×104細胞/cm2の6ウェルプレート(10 cm2)の1×ウェルから最小値で開始するように最適化されています30。開始細胞の数と密度は、生存効率と分化効率に大きな影響を与えるため、各hiPSC系統に対して最適化する必要があります。
    1. hiPSCから細胞培養培地を取り出し、DMEM/F12 + glutamaxで3回洗浄します。培地を 2 mL の vmNPC 誘導培地 (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189) と交換します。培地と試薬の調製の詳細については、 表1 を参照してください)。
    2. 24 時間後にメディアを半分交換し、48 時間後にメディアを完全に交換して、隔日でフィードします。
      注:3〜4日後、vmNPCカルチャーは継代が必要になります。標準的な継代比は1:3または1:4が推奨されますが、これは使用するhiPSCラインごとに最適化する必要があります。
    3. 継代の1時間前に、1x細胞サプリメント(例:Revitacell)をvmNPCsに加え、1x基底膜マトリックス(例:Geltrex)コーティング組織培養プラスチックを調製します(セクション2.2基底膜マトリックスおよびコーティングrissue培養プラスチック)。
    4. vmNPCからメディアを取り出し、D-PBSで2回洗浄します。10 cm2 の培養面積(6ウェルプレートのウェルあたり1 mL)につき、予め温めた細胞剥離液(Accutaseなど)を1 mL加えます。
    5. 37°Cに1分間置いた後、位相差顕微鏡を使用してvmNPCを調べます。
      注:vmNPCは切り上げを開始し、そのプロセスは再格納され、セル層にギャップが現れます。これには、細胞密度に応じて1〜3分かかる場合があります。
    6. vmNPCがこの外観を呈した場合は、100 μLの細胞剥離溶液(Accutaseなど)をvmNPCの層に加えます。
      注: vmNPC を取り外す準備ができている場合は、セル層に穴が開いています。これが起こらない場合、vmNPCは細胞剥離溶液でさらにインキュベーションする必要があります。
    7. vmNPCが容易に剥離する場合は、細胞剥離溶液を静かに除去し、vmNPCをN2B27培地で2回洗浄します。N2B27培地をウェルまたは培養容器の側面に静かに加え、ゆっくりと渦巻いて洗浄し、vmNPCが剥がれないようにします。
      注: この手順は、vmNPC がセル表面に再結合しないように、迅速に完了する必要があります。洗浄ステップでvmNPCが分離し始めた場合は、150 x g で遠心分離して3分間回収してください。
    8. 最後に、ピペットを使用して、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含むvmNPC誘導培地を細胞層に直接激しく排出することにより、vmNPCを除去します。これにより、vmNPCが除去され、新しいマトリックスコーティングされた培養容器に直接移すことができます。
      注:再懸濁されたvmNPCがすでに含まれているメディアを再利用して、さらに細胞を削除すると、細胞が過剰にトリチュレーションされ、生存率が低下します。
    9. 37°C/5%CO2 インキュベーターに交換します。vmNPCは、20〜30分後にマトリックスコーティングされた表面に付着し始めるはずです。24時間後に培地の半分を新鮮なvmNPC誘導培地(細胞サプリメントなし)と交換し、以前と同様に給餌スケジュールを続けます。
    10. 10日間、給餌と継代の体制を続けます。
  2. 基底膜マトリックスの調製と組織培養プラスチックのコーティング
    注:vmNPCのメンテナンスには、1x基底膜マトリックス(Geltrexなど)がプラスチック製品のコーティングに使用されます。vmAPCsまたはvmAstrosのメンテナンスには、0.25倍の基底膜マトリックスを使用することができます。
    1. -80°Cの冷凍庫から基底膜マトリックスストックを取り出し、4°Cの冷蔵庫に一晩置いて解凍します。
    2. 氷冷したDMEM/F12 +グルタマックスで1:10に希釈し、アリコートし、-80°Cで10倍ストックとして保存します。
    3. プラスチック製品をコーティングする場合は、この10倍のストックを氷冷したDMEM/F12 + glutamaxで1倍(vmNPCの場合)または0.25倍(vmAPCまたはvmAstroの場合)に希釈します。
    4. 直ちに、10 cm2あたり1 mL、たとえば、6ウェルプレートのウェルあたり1 mLを組織培養プラスチックに添加します。
    5. 37°Cで1時間置きます。基底膜マトリックス溶液は、コーティングされたプラスチック製品が乾燥しないように、培地/細胞を追加する準備ができるまでプラスチック製品から除去しないでください。マトリックスコーティングされたプレートは、細胞を追加する前に洗浄する必要はありません。
  3. vmNPCの拡張
    1. プロトコルの 10 日目に、誘導培地を vmNPC 増殖培地 (N2B27 + GDNF + BDNF + アスコルビン酸) と交換します。培地と試薬の調製の詳細については、 表1 を参照してください)。
      注:vmNPCは、増殖を誘発するためにマイトジェンを添加する必要はありません。BDNF、GDNF、およびアスコルビン酸は、vmNPCの生存と維持をサポートします30。
    2. 24 時間後にメディアを半分交換し、48 時間後にメディアを完全に交換して、隔日でフィードします。
      注:3〜4日後、vmNPCカルチャーは継代が必要になります。継代には、1:3または1:4の標準的な継代比が推奨されます(これは、使用するhiPSCラインごとに最適化する必要があります)。vmNPCの生存率、増殖率、および生成が最適な比率を決定します。
    3. 継代の1時間前に、1x細胞サプリメント(例:Revitacell)をvmNPCsに加え、事前に1xマトリックスコーティングプレート/フラスコを準備します(セクション2.2基底膜マトリックスとコーティングrissue培養プラスチックの準備)。細胞剥離液(Accutaseなど)を37°Cに予温します。 1x細胞サプリメントを含む新鮮なvmNPC増殖培地(Revitacellなど)をプレウォームします。
    4. vmNPCからメディアを取り出し、D-PBSで2回洗浄します。培養面積10 cm2 あたり1 mLの細胞剥離液(アキュターゼなど)を添加します(6ウェルプレートのウェルあたり1 mL)。37°Cに1分間置いた後、位相差顕微鏡を用いてvmNPCを観察する。
      注:vmNPCは切り上げを開始し、そのプロセスは再格納され、セル層にギャップが現れます。これには、細胞密度にもよりますが、1〜3分かかる場合があります。
    5. vmNPCが丸みを帯びた外観になったら、100 μLの細胞剥離溶液(Accutaseなど)をvmNPCの層に加えます。
      注: vmNPC を取り外す準備ができている場合は、セル層に穴が開いています。これが起こらない場合、vmNPCは細胞剥離溶液でさらにインキュベーションする必要があります。
    6. vmNPCが容易に剥離する場合は、細胞剥離溶液を静かに除去し、vmNPCをN2B27培地で2回洗浄します。N2B27培地をウェルまたは培養容器の側面に静かに加え、ゆっくりと渦巻いて洗浄し、vmNPCが剥がれないようにします。
      注:洗浄ステップでvmNPCが大量に分離し始めた場合は、150 x g で3分間遠心分離して収集してください。この手順は、vmNPC がセル表面に再アタッチしないように、迅速に完了する必要があります。
    7. ピペットを使用してvmNPCを取り出し、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含むvmNPC増殖培地を細胞層に直接激しく排出します。これによりvmNPCが除去され、事前に調製されたマトリックスコーティングされたプレート/フラスコに直接移すことができます(セクション2.2「基底膜マトリックスの準備と組織培養プラスチックのコーティング」を参照)。
      注:再懸濁されたvmNPCがすでに含まれているメディアを再利用して、さらに細胞を削除すると、細胞が過剰にトリチュレーションされ、生存率が低下します。
    8. 37°C/5%CO2 インキュベーターに交換します。vmNPCは、20〜30分後にマトリックスコーティングされた表面に付着し始めるはずです。24時間後、培養培地の半分を新鮮なvmNPC増殖培地(細胞サプリメントなし)に交換し、以前の給餌スケジュールを続行します。
    9. この摂食と継代の体制を10日間続けます。vmNPCは50日目まで拡張できます。
  4. vmAPCの差別化と拡大
    注:vmNPCは、最初のhiPSCステージから30〜50日の間であればどこでも、vmAPCs/vmAstrosの生成に正常に使用できます(図1A)。
    1. コンフルエントな vmNPC 培養物を使用し、vmNPC を高度な DMEM/F12 で 3 回洗浄して、vmNPC 拡張培地のコンポーネントの痕跡を除去します。メディアを vmAPC 拡張メディア (ASTRO メディア + EGF + LIF.培地と試薬の調製の詳細については、 表1 を参照してください)。
    2. 72時間の経過後、vmNPC培養は高い比率(1:7.5)になります。例えば、vmNPCが6ウェルプレートの1つのウェルに保持されていたと仮定すると、vmNPCは、1xマトリックスコーティングされた75 cm2フラスコ(セクション2.2「基底膜マトリックスの調製と組織培養プラスチックのコーティング」で説明されているようにコーティング)に継代する必要があります。セクション2.3「vmNPCsの拡大」でvmNPCsについて説明したように、細胞剥離液を使用した継代。
    3. 適切な容量のvmAPC拡張培地(75 cm2 フラスコあたり7.5〜15 mL培地)にvmNPCを再懸濁します。3日ごとに、または細胞が必要とするときに、完全な培地交換を行います。
      注:この時点から、vmNPCはvmAPCと呼ばれ、セルクラスターではなくシングルセルとして継代する必要があります。vmAPCは、3〜7日ごと、またはコンフルエントになったときに、コンフルエントになりすぎないように通過する必要があります。この時点から、0.25xマトリックスの低濃度を使用してプラスチック製品をコーティングする必要があります(セクション2.2:基底膜マトリックスの調製と組織培養プラスチックのコーティングで説明)。
    4. vmAPCを90日目(hiPSC期から)に達するまで拡大し、拡大のさまざまな時点でvmAPCを凍結保存します。
  5. vmAPCからの成熟したvmAstroの生成
    注:この段階では、vmAPCは175 cm2 組織培養フラスコで増殖できます。これは、成熟したvmAstrosを大量に生成するために拡張できます。
    1. vmAPCが80%のコンフルエントに達したら、ASTRO培地で3回洗浄し、vmAstros成熟培地(ASTRO培地+ BMP4 + LIF)と交換します。培地と試薬の調製の詳細については、 表1 を参照してください)。
    2. 3日ごとに、または細胞が必要とするように、10日間、完全な培地交換を行います。
      注:a)この時点で、特性評価は、免疫細胞化学(図2G-I)および遺伝子発現分析(準備中の原稿)によって確認されたように、vmAstrosが成熟していることを示しています。b) 成熟直後に使用するvmAstroは、新たに調製したマトリックスコーティング面に再メッキする必要があります。vmAPCまたはvmAstrosのいずれかを同じ培養面に14日以上保持すると、細胞のサイズが縮小し始め、さらには剥離するなど、最適でない培養につながる可能性があります。c) 神経炎症性調節を調べるアプリケーションの場合、BMP と LIF は神経炎症刺激の 72 時間前に除去されます。これは、BMP/LIFシグナル伝達と誘発性神経炎症シグナル伝達との間の潜在的な相互作用を回避するためです。
    3. vmAstrosは、免疫細胞化学用のカバースリップなど、実験アッセイのために再メッキしたり、将来のアプリケーションのために凍結保存したりできるようになりました(セクション3、4)。
      注:プロトコルのこの段階では、増殖は非常に低い速度でしか発生しないはずなので、継代は必要ないはずです。この段階で高密度にめっきされたvmAPCは、より高いレベルの増殖を維持します。この場合、 図1Fに示すように、セルを継代して分割し、密度を達成します。

3. vmNPC、vmAPCs、vmAstrosの凍結保存

注:vmNPCs/vmAPCs/vmAstrosを完全にコンフルエントに凍結保存します。

  1. 開始の1時間前に、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を培養物に加えます。凍結保存容器( 材料の表を参照)を室温でイソプロパノールで満たします。
  2. 前述のように細胞剥離溶液を使用して培養プレートから細胞を剥離し、1x細胞サプリメント(Revitacellなど)を含む適切な培地(N2B27またはASTRO培地)で細胞を回収します。150 x g で3分間遠心分離します。
  3. ペレット化されたvmNPC/vmAPCs/vmAstrosを、以下の手順に従って細胞凍結培地( 材料表を参照)ボリュームに再懸濁します(ステップ3.3.1.-3.3.3.)。
    1. vmNPCの場合:10 cm2 の培養面積あたり700 μLを1つのクライオバイアルに使用します。
    2. vmAPCの場合:培養面積60 cm2 あたり700 μLを1つのクライオバイアル(T175培養フラスコの約1/3)に使用します。
    3. vmAstrosの場合:2mLの培地に再懸濁し、vmAstroの数を数えます。細胞凍結培地( 材料表を参照)で再遠心分離し、将来のアプリケーションに適した数で凍結バイアルごとに再懸濁します。凍結融解による細胞損失が約15%であると仮定すると、新たに融解したvmAstrosをカウントし、凍結融解プロセスでの細胞死を補うために15%の余分な細胞数を播種します。したがって、これは cm2 あたり 74,750 vmAstros に相当します。解凍したvmAstrosは、アッセイ前にASTRO培地で72時間維持されます。
  4. クライオバイアルを細胞凍結容器に移し( 詳細については、材料の表を参照)、凍結容器を-80°Cの冷凍庫に24時間移します。24時間後、クライオバイアルを液体窒素(-196°C)に移して長期保存することができます。

4. vmAstro表現型の特徴付け

  1. 免疫細胞化学
    1. 100-200 13 mmガラスカバースリップをガラスペトリ皿に入れ、濾紙の層に置き、乾燥オートクレーブで滅菌します。
    2. 滅菌鉗子を使用して、カバーガラスを4ウェルプレートまたは24ウェルプレートのウェルに移します。1xマトリックス溶液(例:Geltrex)を50 μLの液滴としてカバーガラスに添加し、37°Cで1時間インキュベートします。
    3. vmAstrosを通過または解凍し、ASTROメディアに再懸濁してカウントを行います。50 μLの液滴中にカバースリップあたり25-100,000個の細胞でvmAstrosをプレート化します。
    4. カバースリップからマトリックスを取り出し、すぐにメディアの液滴にvmAstrosを追加します。37°Cで30分間置いた後、さらに250μLのASTRO培地をウェルに充填します。
      注:アストロサイトと中脳マーカーの発現を単にチェックするために免疫細胞化学を行う場合、vmAstrosはプレーティングの24時間後に固定できます。
    5. D-PBSで36%ホルムアルデヒド溶液を1:9に希釈することにより、4%ホルムアルデヒド溶液を調製します。
    6. vmAstros 1xをD-PBSで洗浄します。すぐに4%ホルムアルデヒドをウェルに加え、室温で10分間放置します。
    7. ホルムアルデヒドを取り除き、D-PBSと交換します。4°Cで保存するか、免疫細胞化学に進みます。
    8. ウェルのカバースリップをD-PBSで3回洗浄します。10%ヤギ血清、1%BSA、0.1%PBTx(D-PBS + 1:1000 Triton-X)に1時間浸透させ、室温でブロックします。
    9. 一次抗体(Table of Materials)を1%ヤギ血清、0.1% BSA含有0.1% PBTx(D-PBS + 1:1000 Triton-X)に添加し、ロッカー上で4°Cで一晩インキュベートします。
    10. 翌日、一次抗体を取り出し、カバースリップをD-PBSで3回洗浄します。
    11. 1%ヤギ血清、0.1% BSA含有0.1%PBTxに適切な二次抗体(Table of Materials)を添加し、室温で1〜2時間インキュベートし、ロッカー上の光から保護します。カバースリップをD-PBSで3回洗います。
    12. DAPI溶液(0.1 μg/mL DAPI、D-PBS)を加え、室温で10分間インキュベートします。カバースリップをD-PBSで3回洗います。
    13. カバーガラスをマウントするには、5 μLのMowiol/DABCO封入剤[12% Mowiol(w/v)、12%グリセロール(w/v)を0.2 M Tris(pH 8.5)に一晩攪拌して溶解し、25 mg/mL 1,4-ジアザビチル[2.2.2]オクタン(DABCO)]をガラス顕微鏡スライドに加えます。鉗子を使用して、カバースリップをウェルから慎重に取り外します。カバースリップの端をティッシュに軽くたたいて余分な液体を取り除き、vmAstrosを下にしてMowiol/DABCO液滴の上に置きます。
    14. 各カバースリップについて繰り返し、顕微鏡検査の前に8時間乾燥させます。
  2. サイトカイン治療に応答したvmAstrosのIL-6分泌のELISA測定
    注:BMP4およびLIFで10日間熟成した後、vmAstrosを継代し、カウントし、0.25xマトリックスコーティング組織培養プラスチックウェアに播種する必要があります(詳細は セクション 2.2基底膜マトリックスの調製と組織培養プラスチックのコーティング)、密度は 65,000 vmAstros/cm です2 ASTROメディアで。BMP4とLIFは、これらの因子からの活発なシグナル伝達がサイトカイン治療の有効性を妨げる可能性があるため、サイトカイン治療の72時間前にvmAstrosから削除する必要があります。あるいは、凍結保存されたvmAstrosを解凍してアッセイに使用することもできます。
    1. アッセイ当日は、vmAstros 3xを非酸化還元培地(DMEM/F-12 + グルタマックス + N2)で穏やかに洗浄します。
    2. 比較のために、未処理のコントロールとサイトカイン処理されたウェルを使用してください。選択したサイトカインを最適な濃度で添加します。図2J-Lのデータは、IL-1αを3 ng/mL9で非酸化還元培地中で10 cm2細胞培養面積あたり1 mLで使用して生成しました。
    3. vmAstrosを37°C/5%CO2インキュベーターで24時間交換します。24時間後、培地を滅菌マイクロフュージチューブに集めます。
    4. ELISAをすぐに実施しない場合は、マイクロチューブを液体窒素に浸して培地サンプルを急速凍結し、将来の分析のために-80°Cで保存します。
      注:以下のプロトコルは、材料表に詳述されているIL-6 ELISAキットでの使用に特に最適化されています。新しいELISAキットに凍結乾燥粉末として入荷した抗体と標準物質は、初回使用前に再構成し、将来の使用に備えて分注する必要があります。キットに付属のデータシートには、再構成に必要な試薬と容量が詳しく記載されています。捕捉抗体はPBS(キャリアタンパク質なし)で再構成する必要があります。
    5. ELISAを96ウェルプレート形式で実行し、使用したウェルに応じて試薬の量を計算します。ELISA当日は、ストックをPBSで1:120に希釈して捕捉抗体を調製します。1ウェルあたり50 μLの捕捉抗体をロードしてプレートをコーティングします。プレートを粘着ストリップで覆い、室温で一晩インキュベートします。
    6. 翌日、プレートをD-PBS-Tween(D-PBSと0.05%Tween-20)で3回洗浄します、ウェルあたり100μL。しみを乾かします。
    7. ウェルあたり150 μL D-PBS/1% BSAをロードしてプレートをブロックします。室温で少なくとも1時間インキュベートします。説明されているようにプレートを洗浄します。
    8. 氷上でサンプルを解凍します(これには1〜2時間かかる場合があります)。10 μLのサンプルと40 μL D-PBS/1% BSAをロードして、サンプルを1:5に希釈します。ロードする前に、すべてのサンプルをボルテックスします。
      注:IL-6 ELISAを実行するときはサンプルを希釈する必要があり、希釈を最適化する必要があります。
    9. トップスタンダード(1,000 ρg/mL)をD-PBS/1% BSAでストック1:180に希釈して調製します。トップスタンダードの段階希釈を行うことにより、7つのスタンダードを調製します。各希釈間の渦。
    10. 50 μLの標準試料/サンプルをウェルに加えます。D-PBS/1% BSAをブランクとして使用します。オービタルシェーカーで室温で2時間インキュベートし、希釈したサンプルを適切に混合します。説明されているようにプレートを洗浄します。
    11. D-PBS/1% BSAでストックを1:60に希釈して検出抗体を調製します。ウェルあたり50 μLの検出抗体をロードします。プレートを覆い、RTで2時間インキュベートします。説明されているようにプレートを洗浄します。
    12. ストックをD-PBS/1%BSAで1:40に希釈することにより、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Strep-HRP)に結合したストレプトアビジンを調製します。1ウェルあたり50 μL Strep-HRPをロードし、暗所で室温で20分間インキュベートします。説明されているようにプレートを洗浄します。
    13. カラー反応を開始するには、ウェルあたり50 μL TMB基質溶液をロードします。室温で暗所で20分間(または標準試料とサンプルが青色になるまで)インキュベートします。
      注:TMBは4°Cで保存されますが、室温で使用する必要があります。
    14. ウェルあたり25 μLの停止溶液(1 M H2SO4)を加えて反応を停止し、青色から黄色への色の変化に注意してください。
    15. マイクロプレートリーダーを使用して、450nmの吸光度でプレートを読み取ります。波長補正を540nmの吸光度に設定して、精度を最大化します。作成した標準曲線からサンプル中のタンパク質濃度を計算します。

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結果

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差別化の方法論と進行
ここでは、vmAstrosの生成に採用された方法と、その後の表現型特性評価に使用されたプロトコルの両方について詳しく説明します。vmAstrosの生成方法は、いくつかの異なる分化段階で構成されており、顕微鏡で監視し、明確な形態学的特性を特定することができます(図1A-F)。フィーダーフリーの iPSC 培養物 (図 1B) は、特定の因子に曝露して、神経系統 (LDN193189, SB431542)、特に腹側中脳 (CHIR99021, SHH-C24ii) への分化を誘導します。これにより、形態学的にhiPS細胞とは異なるvmNPCの培養物が生成されます-vmNPCはhiPS細胞よりも丸みを帯びておらず、vmNPCは神経前駆細胞に典型的な細長い多角形または三角形の形状をしています(図1B、C)。...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このhiPSCからのvmAstros作製方法は、非常に効率的で、vmAstrosの純粋な培養物を作製し、異なるhiPSC系統からのvmAstros作製に対して再現性があります。このプロトコルは、発生中の中脳を正しくパターン化し、星状細胞を生成するために胚に必要な発生イベントの再現を中心に開発され、3つの定義された段階で構成されています:1)vmNPCを生成するための神経腹側中脳誘導、2)vmAPCの生成と拡大、そして最後に3)vmAstrosの成熟。

以前に発表された研究では、腹側中脳マーカーの最適な発現を確保するために、vmNPCの生成に使用される各hiPSCラインのCHIR99021およびSHH(C24ii)の濃度を最適化することの重要性を強調しました30,31;200 ng/mL SHH(C24ii)および0.8 μM CHIR99021では、複数のhiPSC系統で一貫して再現性のある結果が得...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、パーキンソン病英国プロジェクト助成金(G-1402)と学生資格によって資金提供されました。著者らは、この研究におけるWolfson Bioimaging Facilityの支援と支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)該当なし該当なし / a トリス塩基とHCl
0.5M EDTA、PH 8ThermoFisherされています 15575-0201:1000 D-PBS から 0.5 mM 最終  
1,4-ジアザビチル[2.2.2]オクタン価 (DABCO)SigmaD27802- 25 mg/mL 含有 Mowiol 封入液
13 mm カバーガラスVWR631-0149
2-メルカプトエタノール (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010NEAA は 1x NEAA ですが、最終濃度に 2x (0.2 mM)
アスコルビン酸SigmaA5960 を添加します。200 mMストック、1:1000〜200 & マイクロ;M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
細胞凍結培地SigmaC2874Cryostor CS10
細胞凍結容器Nalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860.8 mM stock, 1:1000 dilution to 0.8 µMファイナル
クライオバイアル シグマCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL、1:10,000 to 100 ng/mL 最終(PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS(D-PBS without Mg or Ca)ThermoFisher14190144pH 7.2
>E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
ホルムアルデヒド(36%溶液)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 または 1:400 in ice-cold DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM ストック (N2B27 で 1:200、ASTRO メディアで 1:100 から 20 & micro;Mファイナル) 
グリセロールSigmaG5516
ヒトBDNF ペプロテック450-0220 & マイクロ;g/mL ストック、1:1000 から 20 ng/mL 最終
BMP4Peprotech120-0520 µg/mL ストック、1:1000 から 20 ng/mL 最終
ヒト EGFPeprotechAF-100-1520 & micro;g/mL ストック、1:1000 から 20 ng/mL 最終
ヒト GDNFPeprotech450-1020 µg/mL ストック、1:1000 から 20 ng/mL の最終
ヒトインスリン溶液Sigma I927810 mg/mL ストック、1:2000 から 5 µg/mL 最終
ヒト LIFPeprotech300-0520 µg/mL ストック、1:1000 から 20 ng/mL 最終
IL-6 ELISA キットBiotechneDY206
イソプロパノールシグマ I9516-4LMr Frosty 凍結貯蔵容器の充填用
LDN193189SigmaSML0559100 µM ストック、1:10,000 希釈から 10 nM 最終
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 サプリメントThermoFisher17502048100x ストック
NEAAThermoFisher1114003510 mM ストック、1:100 から 0.1 mM 最終 
神経基礎培地ThermoFisher21103049
Normal Goat serumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x ストック、1:100 から 1x 最終
SB431542Tocris161410 mM ストック、1:1000 希釈から 10 & マイクロ;Mファイナル
SHH-C24IIバイオテクネ1845-SH-025200&マイクロ;g/mLストック、1:1000〜200 ng/mL最終
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 in D-PBS
Antibodies for Immunocytochemistry 会社カタログ番号宿主種
S100bSigmaSAB4200671; 1:200
FOXA2SCBTNB600501; 1:50
LMX1AProSci7087; 1:300
LMX1AMilliporeAB10533; 1:2000
Antibody against LMX1BProteintech18278-1-APRabbit; 1:300
Antibody against GLASTProteintech20785-1-APRabbit; 1:300
Antibody against GFAPDakoZ0334Rabbit; 1:400
Antibody against CD49fProteintech27189-1-APRabbit;1:100
MSI1Abcamab52865; 1:400
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit ThermoFisherA32731ヤギ; 1:500
Alexa Fluor 488 ヤギ アンチマウスThermoFisherA32723ヤギ; 1:500
Alexa Fluor 568 ヤギ アンチウサギThermoFisherA11036ヤギ; 1:500
Alexa Fluor 488 ヤギ アンチマウスThermoFisherA11031ヤギ; 1:500
から構成ヒト Mouseに対する抗体 Mouseに対する抗体 Rabbit に対する抗体 Rabbit に対する抗体 Rabbit に対する抗体

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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