このプロトコルは、初期段階の椎間板変性をシミュレートする炎症誘発性、変性ウシ器官培養の新しい実験モデルを提示する。
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方法論記事
初期段階の椎間板疾患をシミュレートする炎症性の退行性臓器培養モデル。
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
症候性椎間板(IVD)変性(IDD)は、主要な社会経済的負担であり、炎症および組織の劣化を特徴とする。原因治療の欠如のために、疾患の進行に関与するメカニズムを研究し、治療目標を見つけ、動物モデルの必要性を減らすために、革新的な実験的臓器培養モデルが緊急に必要とされています。ここでは、IDD中に存在する炎症誘発性および同化微小環境を模倣した新しい3次元臓器培養モデルプロトコルを紹介する。
最初に、ウシのカウダルIVDを、組織培養培地で解剖、洗浄、培養した。動的生理学的または病理学的負荷を、1日2時間のカスタムメイドのバイオリアクターに適用した。IVDは、コントロール群(高グルコース培地、生理的負荷、リン酸緩衝生理食塩水注射)および病理学的群(低グルコース培地、病理学的負荷、腫瘍壊死因子α注射)に4日間割り当てられた。IVDsの採取されたパルポスス細胞および酵素結合免疫吸着剤アッセイから遺伝子発現解析を行った。
我々のデータは、対照群と比較して病理学群に負荷を与えた後、炎症性マーカーの高い発現と椎間板高の低下を明らかにした。このプロトコルは、IVDの炎症や変性をシミュレートするために信頼性が高く、さらにアプリケーションの範囲を広げるために拡大することができます。
概要
腰痛(LBP)は、すべての年齢の個人に影響を与えることができ、障害の主な原因は、世界1、2、3。LBP に関連する総コストは、年間 1,000 億ドルを超える4,5.症候性椎間板(IVD)変性(IDD)は、炎症および組織劣化を特徴とする状態であり、LBP6、7の主要な原因である。具体的には、IDDは、加速病理、神経疾患、および最終的に障害につながる複数の要因によって誘発され、誘発されるIVDの細胞外マトリックス(ECM)の徐々に進化する内訳によって特徴付けられる。さらに、IDDは、炎症性サイトカインの放出に関連しており、脊椎バイオメカニクス、血管新生、および神経の成長は、痛みの感覚を増加させ、慢性LBP(活動性ディスコパシー)6,8を完全に引き起こす。現在までに、治療の選択肢には、隣接する椎骨の椎間剥離およびそれに続く融合、IVD人工関節の移植、または非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、およびIDD....
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プロトコル
実験は、局所アバトワールから得られた牛の尾を用いて行った。現在の研究で使用されている生物学的材料は食物連鎖から採取され、スイスとヨーロッパの法律では倫理的な承認を必要としません。
1. 牛椎間板の解剖
- 表面の汚れや髪を取り除くために水道水で尾全体を十分に洗い流します。
注: 無傷で遠位端、1 つの尾翼あたりの 9 個の IVD (尾骨 1- 9) の目的のサイズに応じて実験に使用できます。15~20mmの所望の直径を考慮し、実験には1個の12個のウシの尾部を使用し、1尾あたり5IVDを使用しました。 - 1%ベタジン溶液を含む箱に尾全体を10分間浸します。尾を滅菌ガーゼで短時間乾燥させ、滅菌ドレープの上に置きます。
注:ディスクの解剖中に、脱水を防ぐためにリンガーの溶液湿潤ガーゼで尾を加湿します。全体の解剖手順が完了するまで、濡れたガーゼで包まれた尾(または残りのセグメント)を保管します。 - メス(20)を使用して軟部組織を尾背脊椎からできるだけ完全に取り除き、IVDの同定を容易にします。骨の除去ペンチで椎骨の棘および横のプロセスを取除く。
注: 希望の直径の IvD を選択します。15-20のmmの直径の範囲のIvDは、現在の研究で使用されました。 - 各椎体の中央を通って骨ペンチで横断的に切断し、個々のモーションセグメントを得ます。リンガーの溶液で濡れたガーゼでペトリ皿にモーションセグ....
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結果
TNF-α注射と組み合わせた低グルコース培地における退行性負荷は、培養4日後のNP細胞における生理学的対照群と比較して、炎症促進マーカーインターロイキン6(IL-6)およびインターロイキン8(IL-8)の遺伝子発現の有意な増加を引き起こした(図2)。これに対し、NP細胞におけるインターロイキン1β(IL-1β)およびTNF-αの炎症促進性遺伝子に対して有意な変化を観察しなかった(データは示していない)。さらに、変性培養条件は、AF細胞におけるIL-6およびIL-8の遺伝子発現を変化させなかった。
図2:核パルポス(NP)組織および環状線維症(AF)組織における遺伝子発現量 これらは、生理学的または病.......
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ディスカッション
我々はここで変性および炎症性IVDDをシミュレートするための詳細なプロトコルを提供した。このプロトコルは、ディスクに破壊的な影響をもたらす炎症経路の詳細な検査に適用することができる。さらに、このプロトコルは、疾患の進行に関与する有望な治療標的を決定するのに役立つ。
我々は最近、ヒト組換えTNF-αがウシおよびヒトNP細胞21の両方に炎症を誘発する可能性 αがあることを示した。本研究では、1IVD当たり100ng TNF-αの用量を使用して炎症を誘発した。この用量は、変性負荷と限定栄養15,20との組み合わせで適用された場合の炎症マーカーの有効な誘導を示した。IVD変性の唯一の開始因子としてTNF−αを用いた最近の研究では、100ng TNF-α/cm3ディスク体積の閾値が、IVD2.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は、AO財団とアオスパイン・インターナショナルによって支援されました。ババク・サラヴィは、ドイツ脊椎財団とドイツ変形性関節症財団からフェローシップ支援を受けました。ゲルト・ラングは、ドイツのフライブルク大学医学部先端臨床医のためのベルタ・オッテンシュタイン・プログラムの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1-ブロモ-3-クロロプロパン(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, | Germany model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| ウシ IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| 非必須アミノ酸溶液 | Gibco by life technologies, カールスバッド, アメリカ | 11140050 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S) | gibco by life technologies, カールスバッド, アメリカ | 11548876 | |
| Rhome Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | カスタムメイドプローブ | プライマーfw(5′–3&プライム;)TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3&プライム;)TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTG GTT プローブ(5′FAM/3&プライム;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | カスタムメイドプローブ | プライマー fw (5′–3&プライム;)CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer Rev (5′–3&プライム;)GAG CTG CCC CGG AGA GTT プローブ (5′FAM/3&プライム;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT C G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | カスタムメイドプローブ | プライマー fw (5′–3&プライム;)TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT プライマーレヴ (5′–3&プライム;)GGT CCA GGT GTT GGA TGC A プローブ(5′FAM/3&プライム;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | ライフサイエンス社 応用バイオシステム | ライフサイエンス Bt03218086_m1 |
参考文献
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al.
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