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方法論記事

呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

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DOI:

10.3791/62115

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2021年2月28日

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1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ウイルス感染した鼻上皮細胞と先天性細胞活性化との間の初期の相互作用の調査を詳述する。免疫細胞の個々のサブセットは、ウイルス感染に応答したそれらの活性化に基づいて区別することができる。その後、それらをさらに調査して、早期の抗ウイルス反応に対するそれらの効果を決定することができる。

要約

ウイルス感染中の鼻上皮層と自然免疫細胞との間の初期の相互作用は、依然として未調査の領域である。ウイルス感染における自然免疫シグナル伝達の重要性は、高い先天性T細胞活性化を示す呼吸器感染症の患者がより良い疾患転帰を示すにつれて大幅に増加している。したがって、これらの初期の自然免疫相互作用を解剖することは、それらを支配するプロセスの解明を可能にし、ウイルス感染の早期進行を抑制または予防するための潜在的な治療標的および戦略の開発を促進する可能性がある。このプロトコルは、ウイルス感染気道上皮細胞によって分泌される因子からの自然免疫細胞の早期クロストーク、相互作用、および活性化を研究するために使用できる汎用性の高いモデルを詳述しています。H3N2インフルエンザウイルス(A/Aichi/2/1968)を代表的なウイルスモデルとして用い、共培養末梢血単核球(PBMC)の先天性細胞活性化をフローサイトメトリーを用いて解析し、ウイルス感染に応答して上皮から放出される可溶性因子によって活性化される細胞のサブセットを調べた。この結果は、細胞のサブセットを分化させるためのゲーティング戦略を実証し、PBMCの活性化集団と、対照および感染した上皮とのクロストークとの間の明確な違いを明らかにした。活性化されたサブセットをさらに分析して、それらの機能および細胞に特異的な分子変化を決定することができる。このようなクロストーク調査からの知見は、ウイルス感染の進行を制御および抑制するのに有益である重要な先天性細胞集団の活性化に重要な因子を明らかにする可能性がある。さらに、これらの要因は、異なるウイルス疾患、特に新たに出現したウイルスに普遍的に適用され、そのようなウイルスが素朴なヒト集団で最初に循環するときの影響を和らげることができる。

概要

呼吸器ウイルスは、おそらく深刻な医療と経済的負担を引き起こす最も広範な病原体の1つです。新興流行株(H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19など)の定期的な世界的な流行から、毎年のインフルエンザの季節性株まで、ウイルスは公衆衛生にとって絶え間ない脅威です。ワクチンは、これらの世界的な公衆衛生上の課題に対する対応の主な部分を占めていますが、これらの対策が単に応答性が高いことに注意するのは冷静です1,2。さらに、新しい感染株の出現とそのワクチンの開発の成功との間の遅れは避けられず3、ウイルスの拡散を抑制するために利用可能な措置が非常に限られている期間につながる。

これらの遅れは、社会経済的および社会的に負わされるコストによってさらに強調されています。季節性インフルエンザだけでも、米国では年間約80億ドルの間接費、32億ドルの医療費、363万人の死亡の原因となっています4。これは、ワクチン開発に資金を提供するために必要な研究費を考慮する前のことです。重症急性呼吸器症候群コロノウイルス2(SARS-CoV-2)5,6,7の出現と急速な拡大によって引き起こされる世界的な混乱によって証明されるように、流行の流行は社会にさらに深刻な影響を及ぼし、毎年のグローバリゼーションの速度の増加によって悪化しています。

最近の研究では、活性化された先天性T細胞の集団が多い感染患者は、より良い疾患転帰を有する傾向があることが示されている8,9,10。さらに、先天的T細胞集団は、粘膜関連不変T(MAIT)細胞、Vδ1γδT細胞、Vδ2γδT細胞、およびナチュラルキラーT(NKT)細胞の複数のサブグループに分類される。先天性T細胞のこれらのサブグループはまた、それらの集団内で不均一性を示し、自然免疫応答に関与する細胞集団間の相互作用の複雑さを増大させる11。したがって、これらの先天的T細胞を活性化するメカニズムおよび先天的T細胞の特定のサブグループの知識は、特にワクチン開発の期間中に、ヒト宿主に対するこれらのウイルスの感染効果を抑制するための異なる研究手段を提供する可能性がある。

インフルエンザに感染した上皮細胞は、先天性のT細胞を急速に活性化する因子を産生する12、13、14。この知見に基づいて、この非接触気液界面(ALI)共培養モデルは、感染初期の鼻上皮層とPBMCとの間の初期の化学的相互作用(感染上皮層によって放出される可溶性因子によって媒介される)を模倣することを目的としている。鼻上皮層(膜挿入物上で培養)とPBMC(下のチャンバー内)との間の物理的分離および上皮の完全性は、ウイルスによるPBMCの直接感染を防ぎ、PBMCに対する上皮由来可溶性因子の影響の詳細な研究を可能にする。したがって、同定された因子は、インフルエンザ感染から保護し得る適切な先天性T細胞集団を誘導する際のそれらの治療可能性についてさらに調査することができる。したがって、この論文は、上皮由来可溶性因子からの先天的T細胞活性化の研究のための共培養を確立する方法を詳述した。

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プロトコル

メモ: このプロトコルで使用されるメディアのレシピについては、 表 1 を参照してください。
注:12ウェルトランスウェルで増殖したhNECSは、インフルエンザウイルスに感染すると可溶性因子が基底チャンバーに容易に到達するために、より最適な厚さに成長することが分かっている。したがって、共培養には12ウェルサイズのトランスウェルの使用が推奨されます。

1. 3T3フィーダ層の確立

  1. 冷凍在庫からの設立
    1. 凍結ストックからNIH/3T3線維芽細胞の凍結卵を解凍する。クライオビアルの内容物を2mLの完全ダルベッコ最小必須培地(DMEM)に加え、細胞を再懸濁する。
    2. 300 × g および室温/圧力(rtp)で5分間遠心分離し、上清を除去する。完全なDMEMで細胞を再懸濁する。
    3. トリパンブルー染色を用いて細胞を計数する。再懸濁した細胞懸濁液10 μLに10 μLのトリパンブルーを加える。十分に混合し、懸濁液10μLを血球計数器に加えて細胞を計数する。
    4. 適切な培養皿(例えば、T75フラスコ)中の1×104 細胞/cm2 の密度の種子細胞。得られた培養フラスコを5%CO2雰囲気中37°Cで3日間インキュベートする 。
  2. マイトマイシンC治療
    1. 3日目に、コンフルエント度が60%〜80%であることを確認し、培地を除去し、細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。
      メモ: 3T3 フィーダ層が完全なコンフルエンシーに達しないことが重要です。さもなければ、マイトマイシンC治療は有効ではない。
    2. マイトマイシンC補充完全DMEMをフラスコに加え、5%CO2 雰囲気中で37°Cで3.5時間インキュベートした。マイトマイシンC含有培地を取り出し、細胞2xを1x PBSで洗浄した。
  3. 3T3細胞を6ウェルプレートに播種する
    1. 3mLの1xトリプシン-EDTAをフラスコに3〜5分間加え、細胞を切断する。切断された細胞を新鮮な15mLチューブに集める。15 mLチューブを300 × g、rtpで5分間遠心分離する。上清を捨てる。完全なDMEMで細胞を再懸濁する。
    2. トリパンブルー染色を用いて細胞を計数する。細胞を6ウェルプレートに7.5 × 105-2.5 × 106 細胞/ウェルで播種する。プレートを5%CO2 雰囲気中37°Cで一晩インキュベートする。
      注: 3T3 フィーダー層は、細胞が正常であれば準備ができていると見なされます。この時点で、ヒト鼻上皮幹/前駆細胞(hNESPC)をフィーダー層上に播種して増殖させる。
    3. フラスコにComplete DMEMを加え、3T3細胞を37°C、5%CO2 で一晩インキュベートし、マイトマイシンC処理から回復させる。

ヒト鼻上皮細胞(hNEC)培養の樹立

注:臨床サンプルは、上気道感染症の症状のない患者から入手する必要があります。

  1. 鼻組織を単一細胞懸濁液に処理する
    1. 100 μL/mLの抗生物質 - 抗真菌剤混合物を含む1x DulbeccoのPBS(dPBS)(Mg2+ およびCa2+を含まないPBS)で鼻組織を洗浄する。組織を小さな断片に切断し、10mg/mLの中性プロテアーゼで試料を振とうしながら4°Cで一晩処理する。
    2. 200× gで5分間遠心分離し、遠心分離後に上清を除去した。ペレットを1xトリプシン-EDTAの1〜2mL中でインキュベートし(37°C、15分間)、チューブ内の体積の10%に等しい容量のウシ胎児血清を加えてクエンチした。
    3. 消化された組織をピペッティングによって機械的に単一細胞凝集体に解離させ、次いで得られた懸濁液を70μmの細胞ストレーナーに通す。完全なDMEMで細胞を再懸濁する。
      注:この工程の後、細胞懸濁液は、ヒト鼻上皮幹/前駆細胞(hNESPC)と呼ばれる最終分化細胞および幹細胞の混合物である。次のステップの目的は、異なる細胞集団の混合物からhNESPC集団を選択し、富化させることである。
  2. hNESPCを選択するための3T3フィーダー層上に単一細胞懸濁液を播種する
    1. ステップ2.1.3から細胞懸濁液を遠心分離(300× g、5分、rtp)し、上清を除去した。細胞を3〜5mLの培地3に再懸濁する。
      注:培地3は、hNESPCの選択的増殖を促進するために製剤化される。
    2. トリパンブルー染色を介して細胞を計数する。6 ウェルプレート内の培地を除去した後に調製した3T3フィーダー層を含む6ウェルプレート上に1ウェル当たり2mLの培地3中の種子1 x 106細胞。得られた共培養物を5%CO2 雰囲気中37°Cでインキュベートする。
      注:播種後、hNESPCの取り付けに影響を与えるため、プレートを攪拌しないように注意してください。
    3. 古い培地を完全に除去し、それを新鮮な培地3と交換することによって、2〜4日ごとに培地3(2mL)を交換する。
      注:栄養素を補充し、過度に酸性の状態がhNESPCの成長に悪影響を及ぼすのを防ぐために、培地が変更されます。各培地変化の間隔は、培地がどの程度酸性(黄色)になるかによって異なります。培地が急速に酸性に変わる場合は、間隔を短くする必要があります。
    4. 7〜10日後、hNESPCが膜インサートに転写するのに適したコンフルエント度にあることを観察する。3つの異なる時点(2日、5日、および 10 日)におけるhNESPCの代表的な形態については、図1を参照されたい。
  3. hNESPCをメンブレンインサートに転写する
    注:マイトマイシンC処理により、3T3フィーダ層はhNESPC拡張期間にわたってゆっくりと劣化します。これにより、ウェルの表面への接着が弱まり、ピペットで洗い流すことで脱落が可能になり、健康なhNESPCのみが残ります。
    1. 培地を除去し、各ウェルに500 μLの1x dPBSを加えた。細胞をマイクロピペットで3xフラッシュして3T3細胞を脱落させ、1x dPBSを廃棄する。スピンドル状の3T3フィーダ層が外れている間、丸いhNESPCが残っていることを顕微鏡で観察する。
    2. ウェルあたり500 μLの細胞解離試薬を加え、5%CO2 雰囲気中で37°Cで5〜10分間、またはhNESPCがウェル表面から剥離するまでインキュベートする。
    3. hNESPC懸濁液を回収し、遠心分離機(300× g、5分、rtp)し、上清を除去した。
    4. ペレットを培地3に再懸濁する。トリパンブルー染色を介して細胞を計数する。シード3×膜インサート(24 ウェルプレート)あたり150μLの培地3中104細胞、またはメンブレンインサートあたり300μLの培地3(12ウェルプレート)中に1×105 細胞(図2)を投与した。細胞を5%CO2 雰囲気中37°Cでインキュベートする。
    5. 頂端および基底チャンバーの培地(培地3)を2日ごとに交換する。メンブレンインサートの支持アーム間のピペットチップをナビゲートして基底チャンバーにアクセスし、古い培地を除去してから、同じ方法で新しい培地を再導入します。頂端チャンバーは容易にアクセス可能ですが、成長するhNESPC層を妨げないように注意してください。
      注:細胞が膜に付着するのに時間が必要なため、播種後少なくとも2日間、頂端チャンバー内の培地を邪魔しないでください。
  4. hNESPCからhNECへの分化
    1. hNESPCが100%コンフルエントに達したら(メンブレンインサートへの播種から約3〜7日後)、ALI培養を開始する。基礎培地を分化培地に変更し、培地を頂端チャンバーから取り出した。図3およびステップ 2.3.5 に示すように、2〜3日ごとに培地を交換する場合は、根尖チャンバーに添加せずに基底チャンバーに培地を添加するだけである。
      注:ALIにおいてhNESPCsからhNECsへの分化を促進するために培地を分化培地に変更する。hNESPCsは、ALIにおいてhNECsとなるまで完全に成熟するまでに約3〜4週間かかり、その時点で細胞は各層に異なる細胞集団を有する多層に成長したであろう。繊毛はまた、400倍の倍率で観察されるべきである(繊毛は、顕微鏡視野が振動しているように見えるようにする、それらの鼓動運動によって識別することができる)。この時点で、細胞は共培養実験に使用する準備ができています。完全微分されたhNEC層の断面については、 図4 を参照してください。
    2. 成熟hNECsを得た後、共培養実験の前に1週間、1xdPBSで頂端チャンバー3x内の細胞を1xdPBSで洗浄する。洗浄工程を基礎培地変化と相乗的に行い、以下のように洗浄を行う。
      1. 50 μL (24 ウェル)/150 μL (12 ウェル) の 1x dPBS をメンブレンインサートの頂端チャンバーに加え、細胞を 37 °C で 10 分間インキュベートします。10分間のインキュベーション後にdPBSを除去し、分化の過程で蓄積した粘液および死細胞を除去した。
        注:実験の性質に応じて、重曹水を使用して粘液層を完全に洗い流すことができます。しかし、共培養実験におけるウイルス感染の場合、粘液層は保持され、余分な粘液のみがdPBS洗浄で除去される。この保持は、入ってくるウイルス感染と相互作用するであろう鼻上皮上に存在する生理学的粘液層を模倣するためである。

3. 経上皮電気抵抗(TEER)測定

注:上皮完全性の確認は、無傷で健康な上皮層が得られることを保証するために重要である。無傷の上皮層は、ボルトメーターを用いて4つのランダムウェルに対して実施されるTEER測定によって決定される。

  1. 電極を70%エタノールですすぎ、使用前に紫外線で15分間滅菌して滅菌してください。滅菌後、1x dPBSですすいでください。
  2. 100 μL (24 ウェルの場合) または 300 μL (12 ウェルの場合) の 1x dPBS をメンブレンインサートの頂端チャンバーに加えます。プレートを37°Cで10分間インキュベートする。次に、dPBS を削除します。
  3. 測定する各ウェルについて、1mL(24ウェル用)または3mL(12ウェル用)の予備加温(37°C用)分化培地を用いて未使用ウェルを調製する。調製したウェルにメンブレンインサートを置き、200 μL(24ウェル用)または600 μL(12ウェル用)の予温分化培地を頂端チャンバーに加える。37°C(添加するウイルスの種類のインキュベーション温度に従うが、例えばインフルエンザの場合は35°C)で15分間平衡化する。
    メモ:TEERの計算と同じ方法でブランク(空のメンブレンインサート)を準備します。
  4. 予め加温した分化培地の15mLチューブを同じ温度で15分間平衡化する。電極を15mLチューブに入れ、電圧計のスイッチを入れます。
    メモ:この時点では、電極が同じ媒体内にあるため、読み取り値は0抵抗でなければなりません。他の読み取り値が得られた場合は、読み取り値が 0 になるまで 15 mL チューブ内の電極を平衡化します。
  5. ブランクから始めて、一方の電極が頂端チャンバ媒体に沈み、他方の電極が基底チャンバ培地に沈むように、各ウェルに電極を配置する。少なくとも 5 分間、一定の読み取り値が得られた場合にのみ、読み取り値を記録します。
  6. 各測定の後、次の測定の前に電極をPBSで洗浄する。試験した各ウェルについて、膜の異なる位置にある3つのサンプルについて測定を行う。各サンプルの正味TEERを計算するには、ブランクメンブレンインサートによって与えられるバックグラウンド抵抗を各測定値から減算します。
  7. 次の式を使用して、坑井の合計 TEER 読み取り値を計算します。
    上皮完全性(Ωcm2)=正味TEER(オーム)×膜の面積(cm2)
    注:ウイルス感染実験のためのhNECのTEER値は>1000Ωcm213,15,16でなければなりません。 

4. 末梢血単球およびNK細胞の単離

注:血液サンプルは健康なボランティアから入手し、隔離の同じ日に使用してください。

  1. 各ドナーから30〜40mLの全血を10mLの採血管に採取する。
  2. 密度勾配遠心分離を用いてPBMCを単離し、以下のステップの後にバフィーコートからPBMCを得る( 材料表も参照のこと)。
    1. 等量のバランス塩溶液(PBS)で希釈する前に、真空引きで採血管から約10mLの血液を十分に混合する。
    2. 15 mL の密度勾配培地を 50 mL チューブのベースに加えます。
      注:希釈血液に対する密度勾配培地の比率は2:3-3.5でなければなりません。
    3. ピペットガン(ディスペンス設定を可能な限り低く設定)で密度勾配媒体上の希釈血液の層35mLをチューブを45°傾け、希釈血液をチューブの内壁に滴下させて密度勾配培地の層が乱れないようにする。
    4. 遠心分離機溶解液を500× g、18〜20°Cで30分間遠心分離する(ブレーキ:オフ)。下層を乱すことなく、上部のプラズマ層を慎重に取り外して廃棄してください。
    5. 赤血球層、勾配密度媒体層、またはバフィーコートを混合せずにバフィーコートを新しいチューブに移す。バフィーコートを新しい50 mLチューブに集めたら、1x PBSで容量を50 mLに補充します。
    6. 溶解液を800× g、18-20°C、8分間遠心分離(ブレーキ:オフ)し、ピペットガンで上清を除去した。細胞ペレットを50mLの1x PBSで再懸濁し、120× g、18〜20°C、10分間遠心分離して血小板を除去した。
    7. 上清をピペッティングにより、細胞ペレットを乱すことなく廃棄する。
      注:細胞ペレットが緩んでいる可能性があるため、上清を注いで捨てることはお勧めできません。
    8. 細胞ペレットを完全なRPMI(ロズウェルパーク記念研究所)培地で再懸濁する。再懸濁した細胞懸濁液10 μLにメチレンブルーとともに3%酢酸10 μLを加えて細胞数を行う。十分に混合し、混合物を血球計数器に10μL加えて細胞を計数する。
  3. PBMCを完全なRPMI培地で2×106/mL(24ウェルの場合)または4×106/mL(12ウェルの場合)の密度に希釈する。

5. hNECウイルス感染とhNECへの移行:PBMC共培養

注:H3N2(A/Aichi/2/1968)は、このプロトコルの感染の代表的な株として使用されています。0.1の感染多重度(MOI)は、このプロトコルにおける代表的なMOIとして使用される。

  1. 0日目(hNECsの感染)
    注:同じドナーから増殖したhNECsから1つのウェルを使用して、実験で使用したすべてのウェルの代表的な細胞数を得る。
    1. 代表的なウェルでは、150 μLの1xトリプシン-EDTAをメンブレンインサートの頂端チャンバーに、350 μLの1xトリプシン-EDTAを基底チャンバーに加え、37°Cで10分間、または細胞が膜から剥離するまでインキュベートする。
    2. 上下にピペッティングして膜上の細胞を洗い流し、懸濁液を1.5mL遠沈管に集めた。200 μLの完全DMEMを加えてトリプシン活性をクエンチする。トリパンブルー染色を介して細胞をカウントし、ウェル当たりの細胞数を求めた。
    3. ウェルあたりの細胞数に基づいてウイルスの必要なMOIを計算し、それに応じて氷上の完全なRPMIでウイルスストックを希釈します。
      注: MOI 0.1 の 1.26 × 106 hNECs / ウェルあたり = 1.26 ×105 H3N2 ウイルス粒子 (30 μL (24 ウェルの場合)/100 μL (12 ウェルの場合)
    4. 感染実験用の残りのウェルについては、50 μL(24ウェル用)/150 μL(12ウェル用)の1x dPBSを膜インサートの頂端チャンバーに加え、37°Cで10分間インキュベートし、1x dPBSを除去した。
    5. 膜インサート中の基礎培地を、ウェルに完全RPMIを添加した新しいプレートにインサートを移すことによって、完全なRPMI培地(350 μL(24ウェルの場合)/700 μL(12ウェルの場合))に交換する。
      注: hNESPC が hNEC に完全に分化した場合、それらは最大 72 時間にわたって異なる媒体に対して耐性/許容性があり、媒体が RPMI12 に切り替えられたときに形態や組織に変化はありません。RPMIは、PBMC集団の成長と維持を支援するために使用されます。
    6. 調製した30 μL(24ウェル用)/100 μL(12ウェル用)のウイルス接種物をメンブレンインサートの頂端チャンバーに加え、5%CO2 雰囲気中で35°Cで1時間インキュベートし、ウイルス接種物を頂端チャンバーから除去する。
    7. メンブレンインサートの基礎培地を新鮮な完全なRPMI培地に変更し、5%CO2雰囲気中で35°Cで24 時間インキュベートする。
  2. 1日目(hNECs+PBMCs共培養の確立)
    1. 0日目から、感染または感染していないhNECの各ウェルの基底チャンバーにPBMC懸濁液を直接添加することによって、必要な数のPBMCを150 μL(24ウェル用)/300 μL(12ウェル用)の完全RPMI培地に播種する(24ウェルプレートの場合は1.5×106、12ウェルプレートの場合は3×106)。37°Cで24/48時間インキュベートする。
      注:共培養の確立後の基底チャンバー内の最終容量は、500 μL(24ウェルの場合)/ 1000 μL(12ウェルの場合)です。
  3. 2-3日目(ウイルス感染後48/72時間のPBMCの収穫)
    1. 頂端上清の収集(ウイルス感染後48/72時間)
      1. 50 μL (24 ウェル用)/150 μL (12 ウェル用) の 1x dPBS を各頂端チャンバーに加え、37 °C で 10 分間インキュベートします。1x dPBS を 1.5 mL チューブに集めます。プラークアッセイ用上清のアリコート 25 μL (24 ウェル用)/50 μL (12 ウェル用) を新しい 1.5 mL チューブに入れ、ストックとアリコートの両方を -80 °C で直ちに凍結します。
    2. hNECsからの細胞RNAの収集(ウイルス感染後48/72時間)
      1. メンブレンインサートをクリーンウェルに移し、300 μL(24ウェル用)/600 μL(12ウェル用)のRNA溶解バッファーを頂端チャンバーに加え、rtpで5分間インキュベートします。上清を1.5 mL遠沈管に集め、分子分析のためにRNA抽出するまで-80°Cで保存する。
    3. PBMC(ウイルス感染後48/72時間)
      1. 滅菌ピペットチップの広いベースで、ウェルの表面を優しくこすり、ウェル表面に付着している可能性のある活性化PBMCを除去します。PBMCsを含む基礎培地を2mL遠沈管に集める。
      2. ウェルを300 μLの1x dPBSで2xフラッシュし、同じ2 mLチューブに洗浄液を回収します。2 mLチューブを遠心分離し(500 × g、5分、rtp)、細胞ペレットを乱すことなく新鮮な2 mLチューブで上清を回収した。サイトカインおよびケモカイン分析のために上清を-80°Cで保存する;細胞ペレットを200μLの1x dPBSに再懸濁する。

6. フローサイトメトリー

注: プロトコルのこのセクションは、ステップ 5.3.3.2 の PBMC 細胞懸濁液を使用して前のセクションから直接継続されます。このセクションの次の手順では、光の露出を最小限に抑えます。表面染色マーカーのサンプルパネルを 表2に記載する。

  1. 表面染色
    1. 再懸濁したPBMC細胞ペレットを96-Vボトムウェルプレートに移す。溶解液を800× g で3分間遠心分離し、上清を除去した。
    2. すべてのPBMC(「未染色」を除く)を100μLの生存率染色剤と共にrtpで15分間インキュベートする。最大 200 μL を 150 μL の磁気活性化細胞ソーティング (MACS) バッファーで補充します。溶解液を800× g で3分間遠心分離し、上清を捨てた。
    3. 適切な希釈比および反応あたり50μLの最終容量を有する目的の表面染色抗体のパネルを調製する(最終容量を得るためにMACS緩衝液で補充する)。調製した抗体ミックスをマルチチャンネルピペットを用いて細胞に50 μL添加して表面染色を行う。暗所で4°Cで15分間インキュベートする。
    4. 150 μL の MACS バッファーを加えて洗浄します。溶解液を800× g で3分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞内染色が必要ない場合は、ステップ6.3の15分間のインキュベーションに直接進んでください。
  2. 細胞内染色(必要な場合)
    1. 100 μLの固定および透過処理溶液を各ウェルに加える。暗所で4°Cで20分間インキュベートする。ウェルに 100 μL の 1x MACS バッファーを補充します。
    2. 遠心分離機(800× g、3分間、25°C)で、上清を除去した。200 μLの1x透過処理洗浄バッファーを加えて洗浄を繰り返します。遠心分離機(500× g、3分間、25°C)で、上清を除去した。
    3. 目的の抗体パネル用の希釈液を調製し、1x 透過処理洗浄バッファーを使用して最終容量 50 μL を達成します。暗闇の中で氷上で30分間インキュベートする。200 μLの1x透過処理洗浄バッファーを加える。
    4. 細胞を遠心分離機(800× g、3分間、4°C)し、上清を除去した。細胞を100 μLの蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸濁する。
  3. 溶解溶液200 μLを各ウェルにピペットで入れる。rtpで15分間インキュベートする。溶解液を800× g で3分間遠心分離し、上清を捨てる。
  4. 細胞ペレットを200μLのMACSバッファーに再懸濁する。先に概説した設定に従ってフローサイトメトリーを行い13、または暗所で4°Cで保存する。

7.サイトカインおよびケモカインレベルの決定

  1. 25 μLの基底チャンバー上清を、製造業者のプロトコール18に従って免疫学多重アッセイを用いて処理する。
  2. 標準曲線のカーブフィッティングアルゴリズム(5つのパラメータ)を利用したマルチプレックスマネージャソフトウェアを使用して、各分析物の濃度を計算します。

8. ウイルス汚染の評価

  1. 抽出キットを使用して、4セットの溶液でウイルスRNAを抽出します:ストックH3N2溶液、感染のためのMOI 0.1希釈、MOI 0.1の10倍段階希釈、およびサンプルから基礎培地(ウイルス感染後48時間および72時間の両方)12。
  2. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の標的として非構造遺伝子(NS1)およびマトリックス(M1)を選択する(代表的な実験で用いたプライマーについては 材料表 を参照)。
  3. 逆転写-PCR(RT-PCR)(42°C、60分)を実行してウイルスRNAをcDNAに変換してから定量PCR(QPCR)を行い、ウイルス存在の代理としてNS1およびM1レベルを測定し、そのレベルをMOI 0.1アリコートの10倍連続希釈に対して行ったRT-qPCRから得られた標準曲線に相関させる。反応混合物の組成については表3を参照し、以下の条件を使用する:95°Cで10分間プレインキュベートし、続いて40サイクルの 3 段階増幅:95°Cで10秒間、60°Cで10秒間、72°Cで30秒間;融解曲線:10秒間に95°C、60秒間で65°C、1秒間に97°C。

9. プラークアッセイ

  1. 0日目:MDCK(マディンダービー犬腎臓)を24ウェルプレートに播種する
    1. コンフルエントMDCK細胞のT75フラスコから培地を除去する。1x PBSで2xを洗って、血清の痕跡をすべて取り除きます。10mLのトリプシンを添加し、細胞が剥離するまで5%CO2雰囲気中で37°Cで20 〜30分間インキュベートすることによってMDCK細胞をトリプシン処理する。
      注:フラスコをタップすると、塊になる可能性があるため、タップしないでください。
    2. 細胞懸濁液を、2 mLの完全イーグル最小必須培地(EMEM)を含む15 mLチューブにピペットで留めます。遠心分離機(300× g、5分、rtp)し、上清を除去した。
    3. 細胞を6mLの完全EMEMに再懸濁する。トリパンブルー染色により細胞を計数する。
    4. MDCK細胞懸濁液を1×105 細胞/mLの濃度に希釈し、希釈懸濁液の1mLを滅菌24ウェルプレートの各ウェルにシードする。5%CO2雰囲気中37°Cで24 時間インキュベートし、各ウェルにMDCK細胞のコンフルエント単分子膜を得た。
  2. 1日目:MDCK細胞の感染
    1. 感染媒体を準備する。24ウェルプレート中のMDCK単層から培地を除去し、1x dPBSで2xを洗浄した。2回目の洗浄では、ウイルスの段階希釈液を準備しながらPBSをウェルに残します。
    2. ウイルスサンプルを氷上で解凍し、24ウェルプレートで段階的に希釈して、10-1から10-6までの段階希釈を達成します。
      注: 例として、24 ウェルプレートの各ウェルに 270 μL の感染培地を充填します。
    3. 30 μL のウイルスサンプルを行の最初のウェルに加えます。新しいピペットチップでよく混ぜ合わせ、列の次のウェルに移してサンプルを10倍に希釈します。10-6 希釈が達成されるまで続行する。すべてのウイルスサンプルに対して手順9.2.1~9.2.3を実行します。
    4. MDCKプレートからPBSを取り出し、調製したウイルス希釈液100 μLで重複感染させる。対照ウェルの場合、100 μLの感染培地(ウイルスサンプルなし)を加える。5%CO2 雰囲気中35°Cで1時間インキュベートし、プレートを振とうして15分ごとに乾燥斑点を除去した。
    5. ウイルス接種剤を除去し、各ウェルに1mLの液体オーバーレイを加える。5%CO2雰囲気中35°Cで72 時間インキュベートする。
  3. 4日目(感染後72時間):プラークの可視化
    1. 液体オーバーレイを取り出し、細胞を1x PBS中の4%ホルムアルデヒドで1時間固定する。ホルムアルデヒド溶液を除去し、1x PBSまたは蒸留水で1回洗浄する。
    2. 1%クリスタルバイオレット溶液を15分間添加して固定細胞を染色する。クリスタルバイオレット色素を除去し、流水で細胞を洗浄する。プレートをrtpで乾かします。
    3. 乾燥したら、プラークを数え、以下の式に従ってウイルス力価を計算する:
      プラーク数×希釈係数 = プラークの数 - 100 μL 中の形成単位

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結果

従来のT細胞はウイルス感染に対する適応免疫応答の主なレパートリーを形成してウイルスクリアランスを促進するが、先天的T細胞集団はより広いスペクトルにわたって働き、後の段階で効果的なクリアランスのためにウイルス負荷を抑制する。したがって、このプロトコルは、同じドナーからの上皮および免疫細胞サンプルを必要とせずに、インフルエンザ感染後の先天的T細胞、その活性化、およびそれらの機能集団を研究するための堅牢な条件を具体的に作り出します。このプロトコルは、他のウイルスにも適用することができるが、頂端放出を有するウイルスに限定され得る、すなわち、PBMCコンパートメントと接触するために基底層に入るべきではない。

図1の代表的な結果に基づいて、このプロトコルは、3T3フィーダー層中の初代細胞懸濁液から増殖したhNESPC集団を得るのに役立ち得る。図 1

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ディスカッション

ウイルスに対する自然免疫応答は、抗ウイルス管理における研究の過小評価されている分野です。気道上皮細胞と自然免疫細胞は、ウイルス量がチェックにとどまらない場合、過活動適応応答の決定因子として機能するだけでなく、感染中のウイルス複製を抑制するために協調して働く12,13,17。しかしながら、適切な抗ウイルス応答を付与するための自然免疫細胞の活性化を調査するための上皮-自然免疫クロストークの研究に関連するヒトモデルの開発は依然として課題である。したがって、このALI共培養モデルは、鼻上皮層と免疫細胞との間の相互作用のホスト全体を評価するために使用できる汎用性の高い技術を表す。このモデルは、インビトロ分化型hNEC、フローサイトメトリーによるPBMC活性化分析、およびウイルス感染を組み合わせたもので、このプロトコルの成功を確実にするために、重要なステップの多くが明確に区切られています。さらに、上気道および下気道の両方からのインビトロ分化細胞を...

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開示事項

すべての著者は、利益相反がないと宣言します。

謝辞

NUS耳鼻咽喉科と微生物学・免疫学部門の研究スタッフの皆様には、hNECの培養・ウイルス培養関連業務にご協力いただき、誠にありがとうございます。また、国立大学病院耳鼻咽喉科の外科医と外科チームには、研究に必要な細胞および血液サンプルの提供に協力していただき、感謝申し上げます。
この研究は、シンガポール国立医学研究評議会によって資金提供されました。NMRC/CIRG/1458/2016 (De Yun Wang宛) および MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan宛).カイ・セン・タンは、欧州アレルギー・臨床免疫学(EAACI)リサーチフェローシップ2019からフェローシップ支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% トリプシン-EDTAGibco15400-054
0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、pH 8.0、RNase フリーサーモフィッシャーAM9260G0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock チューブEppendorf00301200861.5mL 遠心チューブ
10 mL K3EDTA Vacutainer チューブBD36664310mL 採血チューブ
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12ウェルプレートコーニング 3513
12ウェルトランズウェルインサートコーニング 3460メンブレンインサート
1x FACS Lysing SolutionBD349202
2.0 mL SafeLock チューブEppendorf00301200942 mL 遠心分離チューブ
24ウェルプレートコーニング 3524
24ウェルトランズウェルインサートコーニング 3470
3% 酢酸とメチレンブルーSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-トリヨード-l-チロニンSigmaT-074
37% ホルムアルデヒド溶液 w H2OSigma533998
5810R 遠心分離機Eppendorf5811000320
5 mL ポリプロピレンの安定剤としての 15% メタノールチューブ(フローチューブ)BD352058
70 & マイクロ;m セルストレーナーコーニング 
A-4-62 ローターEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolymerNALiquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc171STND01マルチプレックスマネージャーソフトウェア
バタフライニードル21 GBD367287
コレラ毒素シグマC8052
クリスタルバイオレット メルクC6158
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase IISigmaD4693中性プロテアーゼ
DMEM/高グルコースGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)ATCC30-2003
EVOM voltohmmeter deviceWPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS Lysing SolutionBD3492021x Lysing Solution
Falcon tube 15 mLCellStar18827115 mL チューブ
Falcon チューブ 50 mLCellStar22726150 mLチューブ
ファスト スタート エッセンシャル DNA プローブ マスターロシュ6402682001qPCR マスター ミックス
フィコール パケ プレミアムリサーチ インスツルメント17544203密度グラジエント メディア
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 フォワード プライマー シーケンスシグマ5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 リバース プライマー シーケンスΣ 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 フォワード プライマー シーケンスΣ5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 リバース プライマー シーケンスΣ5'-CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
熱不活化ウシ胎児血清Gibco10500-064
hNESPCsヒトドナーNA
ヒト上皮成長因子Gibco-InvitrogenPHG0314
ヒドロコルチゾンSTEMCELL Techonologies7925中隔偏位手術
中の鼻生検から採取インスリンシグマI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *UV励起用 サーモフィッシャーL23105生存率染色
MILLIPLEX MAP ヒトサイトカイン/ケモカイン マグネティックビーズパネルII - プレミックス 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23免疫学マルチプレックスアッセイ
マイトマイシンCSigmaM4287
M-MLV 5x バッファーPromegaM1705RT-PCR 5x バッファー
M-MLV 逆転写酵素PromegaM1706逆転写酵素
N-2 サプリメントGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perm/Wash バッファーBD554723透過化洗浄バッファー
PneumaCult-ALI 10x SupplementSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI 基礎培地STEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)STEMCELL Techonologies5001
ランダムプライマーPromegaC1181ランダムプライマー
組換えルナシン RNase 阻害剤PromegaN2511RNase Inhibitor
RNA Lysis BufferQiagenPart of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)ATCC30-2001
STX2 電極WPI、サラソタ、フロリダ州、米国STX2電極
T25 フラスココーニング430639
T75 フラスココーニング430641U
TPCKトリプシンシグマT1426
パンブルーハイクロンSV30084.01
ウイルスRNA抽出キットQiagen52904RNA抽出キット
V字型96ウェルプレートコーニング3894
431751トリウイルス

参考文献

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