ヒト間葉系幹細胞の脊髄腔内注射とラット脳への移動の追跡

サマリー

間葉系幹細胞(MSC)を脳に送達するために、いくつかの投与経路を用いることができる。本研究では、MSCは脊髄腔内注射を介して神経軸と脳全体に送達されました。MSCをラットの脊髄腔に注射し、幹細胞の遊走を追跡して定量しました。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、さまざまな疾患の治療のために研究されてきました。脳と脊髄の両方に欠損がある神経変性疾患では、MSCは脳と脊髄の両方に移動する必要があるため、投与経路が非常に重要です。この論文では、ラットモデルで脳と脊髄を標的とすることができるMSCを脊柱管に投与する方法(脊髄腔内注射)について説明します。ラットの脊柱管には、腰椎2-3のレベルで100万個のMSCを注入しました。投与後、ラットは注射後0、6、および12時間で安楽死させました。光学イメージングと定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用して、注入されたMSCを追跡しました。本研究の結果は、脊髄腔を介して投与されたMSCが、その後12時間後に脳と脊髄の両方で検出できることを実証しました。脊髄腔内注射は、全身麻酔が不要で副作用が少ないというメリットがあります。しかし、MSCの脳への移動率が低いという欠点は克服する必要があります。

概要

間葉系幹細胞
疾患下では、MSCはパラ^{クリン作用1}を介して疾患特異的な治療物質を分泌し、免疫応答の調節、損傷組織の回復、有害物質^の除去2が報告されています。したがって、MSC療法は、アルツハイマー病やサルコペニアなどの多因子疾患の治療において、単一標的療法よりも効果的であると考えられています3,4,5,6。さらに、医薬品とは対照的に、MSCはホーミング効果を有し、体内の炎症性サイトカインまたはケモカインを認識することにより、損傷した組織の領域に移動する^7,8。残念ながら、細胞の一部のみが損傷領域に到達し、MSCの生存率は遊走中に低下します^9,10,11,12。したがって、MSCの治療効果を最大化するためには、生存細胞を標的部位に送達する必要があります。したがって、MSCを投与する際には、対象疾患の性質に基づいて適切な投与経路を選択することが重要です。

インジェクションルート
治療薬が患者に投与される経路は数多くあります。最も一般的な方法は、体循環への静脈内注射、経口投与、および皮下または筋肉内注射です。神経変性疾患において、治療薬を脳に送達する際の主な障害は血液脳関門(BBB)です。BBBは、血管と脳実質との間の緊密な接合部によって、外部の病原体から脳を保護する^13,14。しかし、BBBは逆説的に、治療薬が脳実質に侵入するのを防ぎます。したがって、BBBの通過は、脳疾患治療の開発における主要なハードルである^15,16。脳内注射は、外科手術を通じて標的物質を直接脳に注入することにより、この欠点を克服するために行われる17,18,19。ただし、外科的介入の副作用、特に手術中に針がニューロン細胞に損傷を与えるため、考慮する必要があります。

脊髄腔内投与。
髄腔内投与(脊柱管またはくも膜下腔への薬物の投与)は、脳脊髄液(CSF)を介して脳または神経軸に薬物を送達し、脳内注射の実行可能な代替手段です。髄腔内注射は、注射部位に応じて細分化できます:側脳室、大槽、および脊柱腔。3つの経路すべてにより、薬物または細胞がCSF全体に分散して脳と脊髄に広がります。脳への薬物送達は、脳内脳室注射および大槽内注射の場合、薬剤が脳の近くに注射されるため、より効率的である可能性があります。しかし、脊髄腔内注射は、全身麻酔や脳室内リザーバーを挿入するための手術を必要としない、一般的に安全である²⁰という利点があり、必要に応じて繰り返し行うことができる。

この研究の目的は、脳と脊髄の両方に MSC を送達する手段としての脊髄腔内投与を検証することでした。まず、ラットモデルで脊髄腔を樹立しました。次に、MSCを親油性トレーサーであるDiD(DiIC18(5); 1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドジカルボシアニン、4-クロロベンゼンスルホン酸塩)で標識し、幹細胞の脊髄および脳への移動効率を評価しました。細胞分散を評価するために、ex vivo光学イメージングを実施しました。この簡便なプロトコールは、外科的介入なしに行うことができ、幹細胞だけでなく、医薬品、抗体、造影剤、および脊髄または脳に送達されることを意図した他の物質を投与する目的にも使用され得る。

プロトコル

注:本試験は、Samsung Medical CenterのSamsung Biomedical Research Institute(SBRI)のInstitutional Animal Care and Use Committee(承認番号:20170125001、日付:2017年1月25日)によって承認されました。SBRIは、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care Internationalの認定施設として、Institute of Laboratory Animal Resourcesが定めたガイドラインに従って活動しています。

1. ヒトウォートンゼリー由来MSCの調製

1. ヒトウォートンゼリー由来間葉系幹細胞(WJ-MSC)の培養
   1. ヒトWJ-MSCsのバイアルを37°Cの水浴で素早く解凍します。WJ-MSCを50 mLのコニカルチューブに移し、細胞の容量(v / v)の少なくとも10倍で増殖培地を添加します。ピペで上下に動かして細胞を懸濁します。
   2. 300 × g で5分間遠心分離します。上清を慎重に捨て、細胞を再懸濁します。
      注:セルペレットを捨てないように注意してください。
   3. T175フラスコにWJ-MSCを5,000-6,000細胞/cm²の密度で播種します。WJ-MSCを37°Cの_CO2 インキュベーターでインキュベートします。WJ-MSCが80〜90%の密度に達するまで、72時間ごとに増殖培地を交換します。
      注:通常、MSCが80〜90%の合流性に達するには3〜4日かかります。
2. ヒトWJ-MSCの継代培養
   1. 増殖培地を廃棄し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。PBSを取り外し、0.25%トリプシン-二ナトリウムエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を5 mL加えます( 材料の表を参照)。WJ-MSCが培養フラスコから分離するまで、CO₂ インキュベーターで細胞を37°Cで3分間インキュベートします。
   2. 10%ウシ胎児血清を含む5mLの増殖培地を添加し、0.25%トリプシン-EDTAを中和します。細胞混合物を採取し、50mLのコニカルチューブに移します。細胞培養フラスコを10 mLの増殖培地で洗浄し、滅菌血清ピペットを使用して50 mLチューブに細胞を回収します。
   3. 細胞混合物を300 × g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を10 mLの増殖培地に再懸濁し、WJ-MSCの数をカウントします。
      注意:セルペレットを捨てないように注意してください。
   4. WJ-MSCsは、実験によって異なりますが、4,000-6,000細胞/cm²の密度で播種します。
3. DiD色素によるWJ-MSCの標識と脊髄腔内注射用WJ-MSCの調製
   注:DiD染料ラベリング手順は、製造元の指示に従って実行されました。
   1. WJ-MSCが80%の合流点に達したら、上記の手順で切り離します。WJ-MSCを1 × 10⁶/mLの密度でフェノールレッドを含まない最小必須培地(MEM)α血清なしで懸濁します。
   2. 細胞懸濁液1 mLあたり5 μLのDiD標識溶液を添加します。ピペッティングでやさしく混ぜます。
   3. 37°Cで15分間インキュベートします。細胞懸濁液を300 × g で5分間遠心分離します。
   4. 上清を取り除き、WJ-MSCをフェノールレッドを含まないMEM αに1×10⁶ / 0.2mLの密度で再懸濁します。.

2. WJ-MSCの脊髄腔内注入

1. 脊髄腔内注射の準備
   1. 生後6週齢のSprague-Dawleyラットに5%イソフルランを麻酔します。次に、外科的処置全体を通して2%イソフルランで麻酔を維持します。
      注:実験を開始する前に、麻酔条件を最適化してください。
   2. 小動物用の電気シェーバーを使用して手術部位を剃ります。
      注意: 電気シェーバーは、手動のカミソリとシェービングジェルと交換できます。
   3. ポビドンヨードを使用して手術部位を消毒します。サージカルブレードで皮膚に3cmの切開を行います。残りの皮膚と筋肉組織を手術用刃とハサミで切除します。腰椎2-3(L2-3)の棘突起を明らかにします。
2. DiD標識WJ-MSCの脊髄腔内への注入
   1. ラットを腹臥位に置きます。ラットの背骨を適切に曲げて、隣接する棘突起間の距離を広げ、適切な位置を維持するのに役立つ十分な量の紙ティッシュまたは他の材料を使用します。
   2. 1mLのシリンジに0.2mLのDiD標識WJ-MSCsを入れ、L2とL3の棘突起の間に23Gのシリンジと針の組み合わせを垂直に置き、椎体に触れるまで針を挿入します。
   3. 針が椎体に触れたら、針の先端を脊柱管に入れながら約0.5cm引っ込めます。シリンジを傾け、針の先端を吻側を向くように置きます。WJ-MSCを脊髄腔内に1分間注入します。
      注:注入速度は事前に最適化する必要があります。
   4. 注射後、脊柱管からシリンジを完全に取り外します。切開部を縫合し、ポビドンヨードを使用して手術部位を消毒します。
3. 処置後の治療
   1. ラットを安定させて拘束し、動きを防ぎ、麻酔をかけたまま45°の角度で15分間逆さまに置きます。15分後、麻酔を中止し、ラットが目覚めるのを待ちます。

3. 脊髄腔内注射の評価

1. ラットの安楽死と、注射後0、6、および12時間での脳と脊髄の分離
   1. 実験動物に5%イソフルランで麻酔をかけます。PBS灌流中は2%イソフルランで麻酔を維持します。
   2. 手術用ハサミを使用して横隔膜の下に切開を行います。鉗子で切開部を開き、胸郭を吻側に切開して心臓を露出させます。
   3. 右心房に小さな穴を開け、左心室に蝶針を挿入します。肝臓から血液がなくなるまで、100 mLの冷たいPBSを左心室に4〜5分間灌流します。.
   4. 灌流後、縦方向の平面に沿って外科用ブレードを使用して、頭から尾への背面に長い切開を行います。手術用ハサミ、鉗子、骨カッターを使用して、残りの脳と脊椎全体を分離します。残りの肋骨、つながった骨、肉を取り除きます。
2. ex vivo DiD蛍光光学イメージング
   1. 単離した組織を光学イメージングデバイスのチャンバーに入れます。
   2. パラメータを次のように設定します:エミッション、700 nm;励起、605 nm;露光時間は2秒で、光子/秒/センチメートルの2乗/ステラジアン(p / s / cm² / sr)として。光学画像をキャプチャします。
      注:すべての画像は、同じ照明設定(ランプ電圧、フィルター、F /ストップ、視野、ビニング)で取得する必要があります。
   3. 描画ツールを使用して、脊髄に同等のサイズの 3 つの四角形の関心領域 (ROI) を描画し、脳に 1 つの円の ROI を描画します。ROIの蛍光強度を測定します。
3. 脊髄および脳組織からのゲノムDNA(gDNA)の抽出
   1. 外科用鉗子、はさみ、ロンジャーを使用して頭蓋骨と脊椎を慎重に取り除きます。
   2. 頭蓋骨と脊椎から脳と脊髄を採取します。脊髄を3つ(頸椎、胸部、腰椎)に切ります。
      注:採取した組織は、すぐに分析しない場合は-80°Cで保存する必要があります。
   3. 事前に冷やした乳鉢、乳棒、液体窒素を使用して組織を粉砕します。市販の製品を使用してgDNAを抽出し、製造元の指示に従ってください。
4. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)
   1. 分光光度計を使用して、各サンプル中のgDNAの量を定量します。
   2. サンプルあたり10 ngのgDNAとヒトArthrobacter luteus(ALU)プライ^マー12,21を使用してqPCRを実行します。
   3. ΔΔC_T 法²²を使用して、サンプル中のWJ-MSCの正確な数を計算します。

結果

MSCの脊髄腔内注射の有効性を評価するために、本研究ではDiD標識MSCが使用されました。MSCを脊髄腔内に注入する前に、光学イメージングと蛍光顕微鏡を用いてin vitroで標識の有効性を評価しました(図1)。プロトコルセクション3.1に記載されている手順を使用してDiD標識試薬でMSCを染色した後、DiD標識MSCを播種した培養プレートの光学画像を撮影しました(図1A)。DiD で標識された MSC (+DiD) は赤で示されます。DiD色素で標識されていないナイーブMSC(-DiD)は、陽性のシグナルを示さなかった。この結果は、蛍光顕微鏡を用いて確認されました(図1B)。MSCはまた、その形状を視覚化するために4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色されました。ナイーブMSC(-DiD)は、DAPIまたは核染色による染色を示す青色を示しましたが、DiD染色に関連する赤色は示しませんでした。対照的に、DiD標識MSC(+DiD)は青色...

ディスカッション

MSCによる治療の最適な投与経路は、対象疾患、患者の状態、および送達する薬剤の種類に応じて選択する必要があります。MSC療法を含む細胞療法では、細胞がBBBを通過できないため、幹細胞を脳に直接注入するか、CSFを介して髄腔内に注入することを考慮する必要があります¹⁹。脊髄腔内注射は比較的非侵襲的であり、脳室内注射とは異なり、脳にニューロンの損傷を引き起こさず、副作用のリスクが低いことと関連しています²⁰。腰椎穿刺によるCSFへのアクセスは、臨床現場で非常に簡単に実行できる手順です。したがって、幹細胞、薬物、造影剤、または他の物質を脊髄腔内注射^23、24、25を介して患者に投与することは難しくない。対照的に、外科的介入を必要とする脳室内注射は、より複雑です。しかし、実験動物の場合、脳に直接薬剤...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	細胞培養
ウシ胎児血清	biowest	S1520	培地サプリメント
ゲンタマイシン	Gibco-invitrogen	15710-072	培地サプリメント
Gentra Puregene Tissue Kit	QIAGEN	158689	gDNA 単離
MEM、グルタミン、フェノールレッド	なしGibco	51200038	WJ-MSC fomulation for injection
Miminum Essential Medium alpha	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC 培養液
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368577	定量的リアルタイムPCR試薬
QuantStudio 6 Flex リアルタイムPCRシステム	サーモフィッシャー	4485694	定量的リアルタイムPCR
トリパンブルー	Gibco	15250061	Injection
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution	invitrogen	V22887	幹細胞標識ソリューション
Xenogen IVIS Spectrum system	Perkin Elmer	124262	光学イメージングデバイス