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方法論記事

エコHIV脳感染症のラットモデル

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DOI:

10.3791/62137

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2021年1月21日

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

この記事について

サマリー

ここでは、キメラHIV(EcoHIV)を用いた活性HIV感染の新しいラットモデルを確立するプロトコルを提示し、脳内のHIV-1ウイルス貯留層の理解を深め、HIV関連神経認知障害および関連する併存疾患(すなわち薬物乱用)を研究するシステムを提供するために重要である。

要約

EcoHIV感染マウスモデルは、HIV関連の神経学的合併症を調査する上で重要な有用性を有することがよく研究されている。薬物乱用および神経認知障害の研究のためのEcoHIV感染ラットモデルの確立は、神経HIVおよびHIV-1関連神経認知障害(HAND)の研究において有益であろう。本研究では、キメラHIV(EcoHIV)を用いた活動性HIV感染のラットモデルの作成に成功したことを実証する。まず、EcoHIVのレンチウイルス構築物を、培養293 FT細胞に48時間包装した。次いで、条件付き培地を濃縮し、力を入れた。次に、F344/Nラット脳組織へのEcoHIV-EGFPの両側立体態注射を行った。感染の1週間後、EGFP蛍光シグナルが感染した脳組織で検出され、EcoHIVがラットに活性HIV感染を誘導することに成功したことを示している。また、ミクログリア細胞マーカーに対する免疫染色を、Iba1、実施した。結果は、ミクログリアがEcoHIVを収容する主要な細胞型であることを示した。さらに、EcoHIVラットは、感染後8週間に、HANDの潜在的な神経行動メカニズムおよびシナプス機能障害である時間処理に変化を示した。全体として、本研究は、HIV-1感染のEcoHIVモデルをラットに拡張し、脳内のHIV-1ウイルス貯留層ならびにHANDおよび薬物乱用などの関連する併存疾患を研究するための貴重な生物学的システムを提供する。

概要

生物学的システムは、HIV-1関連神経認知障害(HAND)とその基礎となる神経機構2に関する我々の理解を高めている。特定の研究に最も適した生物学的システムを決定することは、しばしば関心の問題に依存する2.宿主動物モデルの範囲の限界は、HIV-1疾患の発症の研究に挑戦する。HIV-1ウイルス複製および病因を調べるため、Potash et3は、HIV表面エンベロープ糖タンパク質のコード領域を置換する活性HIV-1感染のマウスモデルを作成し、gp120を、エコトロピックMLVgp80に置き換え、マウス4におけるウイルス複製に成功した。キメラHIV(EcoHIV)マウスにおける尾静脈注射後、HIV-1血清陽性個体(例えば、感染したリンパ球およびマクロファージ)に似た多くの特徴が認められ、抗ウイルス免疫応答、および炎症3、5、6を標的とした。

マウスとラットはどちらもムリダエのメンバーですが、基本的な種の違いは、特定の実験問題に対するそれらの適合性に影響を与える可能性があります7.したがって、ラットへのEcoHIV感染モデルの拡張(一般的に薬物乱用および神経認知障害の研究で使用される)は、ニューロHIVの研究において有利であろう。例えば、その大きなサイズは、薬物自己投与手順のためのより実用的な8のための頸状カテーテル移植を行う。ラットにおける薬物自己投与技術は、HIV-19における動機づけに利用されている。さらに、多くの神経認知/行動タスクは、最初はラット10のために設計されました。ここでは、ラットにおけるEcoHIVの立体的注射の利用を報告し、EcoHIV感染モデルを拡張し、ニューロHIVおよびHANDに関連する新しい質問に対処する重要な機会を与える。

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プロトコル

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました(連邦保証番号:D16-00028)。6人の成人男性F344/Nラットは、12/12光の下で制御された環境に収容されたペアでした:食物および水へのアドリビタムアクセスを伴う暗いサイクル。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドで国立衛生研究所によって確立されたガイドラインを使用して世話をされました。

1. 293 FT細胞でのウイルス包装

  1. 293 FT細胞(5×105/mL)をゼラチンで75cm2フラスコをDMEMプラス10%FBS11で培養する。37°Cで細胞を成長させ、トランスフェクションで50%コンフルエントにする。
  2. 22.5 μLのトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミン3000)を750μLの培地(例えばOpti-MEM)に1.5 mLのマイクロ遠心分離管および渦に3 s用に希釈する。
  3. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで750μLの培地で20μgのEcoHIVプラスミドDNAを希釈し、よく混ぜます。
  4. 希釈したトランスフェクション試薬のチューブに希釈したDNAを加え、穏やかに混ぜます。室温で15分間インキュベートします。
  5. 75cm2 フラスコに10mLの温め込みDMEM培地を加えます。37°Cで2日間細胞をインキュベートする。
  6. 収穫し、パッケージレンチウイルスを含む2つのフラスコから条件付き培地の24 mLを組み合わせます。
  7. 遠心分離機は、条件培地の全24mLを500xgで4°Cで10分間10分間行う。 明確化した上清を滅菌50mLチューブに移します。
  8. レンティx濃縮器8mLと24mLの清澄上清(1:3比)を組み合わせます。優しい反転で混ぜます。4°Cで2日間インキュベートする。
  9. 遠心分離機混合物を1,500xgで4°Cで45分間混合した。 上清を慎重に取り除いてください。
  10. 100 mM PBS の 100 μL でペレットをゆっくり再中断します。
  11. P24 ELISAキットを用いるチターウイルス濃度。

2. エコHIV-EGFPウイルスステレオタキシック手術

  1. 3%セボフルランを使用してラットを麻酔します。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経が存在しない場合は、ステップ2.2に進みます。
  2. 脳領域から毛髪を剃り、70%エタノールとクロルヘキシジンベースのスクラブで皮膚を2回殺菌します。立体装置の中で、ラットを起こしやすい位置に固定します。
  3. 頭皮の中線に沿って皮膚を通して切開(5〜6cm)を作ります。
  4. 2つの掘削位置を0.8 mm横に、1.2 mmのロストラルをブレグマにマークします。各頭蓋骨の位置に穴(直径0.4mm)をドリルします。
  5. 10 μL 注射注射シリンジで、Titered EcoHIV レンチウイルス溶液 (1.04 × 106 TU/mL) を充填します。ステレオタキシック装置に注射器を固定します。
  6. 穴の穴の表面に近い針を下に移動します。測定し、深さ2.5ミリメートルを移動します。
  7. 0.2 μL/min の速度で 1 μL のウイルス溶液を注入します。注射領域の中に針を5分間置いておきます。針がラットの頭蓋骨の外になるまでゆっくりと上に移動します。
  8. 4-0シルク糸で皮膚を縫合します。
  9. 切開を70%エタノールで1回殺菌します。皮下にブトルフェノールを注入する(ドロレックス、0.1mg/kg体重)。
  10. ラットが目を覚ますまで加熱パッド付きの回収室に移します。

3. 脳の切り分けの可視化

注:EcoHIVウイルス注入後1~8週間お待ちください。

  1. 5%セボフルランでラットを麻酔します。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経が存在しない場合は、ステップ3.2に進みます。
  2. ヒュームフードの中の上の位置にネズミを固定します。
  3. 胸部中線に沿って皮膚を切開します。横隔膜を切り、胸腔を開きます。
  4. 20G×25mmの針を左心室に挿入します。
  5. すぐにはさみで右心房を開きます。
  6. 5mL/minの速度でプレチル100mMPBSの50mLをパーフューズします。
  7. 5 mL/min の割合で 100 mL の冷たいパラホルムアルデヒドをパーフューズします。
  8. ラットを切断し、頭皮を開き、脳を取り除きます。
  9. 4%パラホルムアルデヒドで一晩後置。
  10. 脳が底まで浮くまで脳を30mLチューブで100mM PBSで30%スクロースの40 mLに移します(約3日間)。
  11. スナップは、メチルブタノールで脳を2分間凍結します - 80°C。
  12. -20 °Cクライオスタット内の金属プラットフォーム上の脳組織を固定します。
  13. クライオスタットを使用して、厚さ50μmのコロナセクションをカットします。
  14. 細かいブラシでガラススライドに脳のスライスを転送します。
  15. 0.3 mLのアンチフェード媒体でセクションを取り付け、22 mm 50 mmカバーリップでカバーします。
  16. ガラスのスライドを室温で乾燥するまで暗闇の中に保管してください。
  17. 脳領域の境界とニューロンの形態学的特徴に基づいてZスタックを使用して、共焦点顕微鏡で標的ニューロンを画像化します。
    注意:使用される共焦点顕微鏡の設定は、60 X(A / 1.4、油)の倍率、および488nmの波長を使用して0.15 μm(ピンホールサイズ30 μm;バック投影ピンホール半径167nm)のZ平面間隔でした。

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結果

このコンディション培地は、293FT細胞に感染したEcoHIV-EGFPのレンチウイルスから採取した。次に、濃縮し、力を合わせた後、F344/Nラットの脳(皮質領域)に立体的に注入した。注射後7日間、ラットを屠殺し、ブレグマ5.64mmからブレグマ-4.68mmまでのコロナ脳スライスから画像を撮影した。 図1Aでは、脳全体、特に皮質および海馬歯状の歯素回に有意なEcoHIV-EGFPシグナルがある。さらに、Iba1とEcoHIV-EGFPプローブによるデュアルラベリングは、ミクログリアが脳内のEcoHIV発現を有する主要な細胞型であるという強力な証拠を提供した(図1B)。特に、EcoHIV-EGFPの分布パターンは、ラット脳におけるミクログリアの相対的な局所濃度(すなわち、海馬の皮質およびデンテート回)と一致する。

その後の研究では、ラットにおけるEcoHIV感染の有用性を検証し、手のひらの主要な側面をモデル化した。上記のプロトコルを用いて、F344/NラットはE...

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ディスカッション

このプロトコルでは、ラットにEcoHIV誘導HIV感染モデルを確立した。具体的には、注射後7日のラット脳における活性HIV感染を誘導することに成功した皮質へのEcoHIVの二国間立体態注入について述べた。Futhermore, 我々はラットのEcoHIV感染が手の重要な側面を研究するための良好な生物学的システムであり得ることを実証する。8週間後- EcoHIV感染, ラットは、重要な神経認知障害を示しました, NAcのMSNにおける時間処理およびシナプス機能不全の変化を含む.ニューロHIVとHAND2の研究のための動物モデルの重要性を考えると、新しい生物学的システムの開発は、分野内の新しい質問に対処するために有利である可能性があります。ポタッシュら3 は、マウスで活性HIV-1感染を誘導するためにEcoHIVの使用を最初に報告した。具体的には、マウスを尾静脈注射3を介してEcoHIVウイルスの0.1mLの溶液を接種した。感染から6週間後、脾臓細胞およびリンパ球でHIV-1ウイルスDNAが検出され...

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開示事項

著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

この研究は、NIH助成金HD043680、MH106392、DA013137、およびNS100624によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
293FT細胞サーモフィッシャーサイエンティフィックR70007
抗生物質-抗真菌剤溶液Cellgro30004CI100X
Corning BioCoatゼラチン 75cm²ベントキャップ付き長方形傾斜ネック細胞培養フラスコLife Technologies354488
L-グルタミン、4.5 g / Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム付きコーニングDMEMLife Technologies10013CV
カバーガラスVWR637-137
デュモン#5鉗子ワールド精密機器14095
デュモン #7 鉗子ワールド プレシジョン インスツルメンツ14097
エッペンドルフ スナップキャップ マイクロ遠心分離機 バイオプール セーフロックチューブライフテクノロジー22600028
エチコン ビクリル プラス 抗菌、4-0 ポリグラクチン 910 縫合糸、27インチ。FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Hamilton syringeHamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection ReagentLife TechnologiesL3000015
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
レンチウイルス関連p24 ELISAキットCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X コンセントレーター宝PT4421-2
Opti-MEM I 還元血清中寿命技術11058021
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127-500G
パラホルムアルデヒドΣP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
定位固定装置Kopf Instrumentsモデル 900
SuperFrost Plus スライドフィッシャーサイエンティフィ12-550-154%
Vannas はさみワールド精密機器500086
ドリルズ ック

参考文献

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