方法論記事

「CLARITY」で腸をイメージング

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DOI：

10.3791/62143

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2021年6月11日

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

この記事について

サマリー

マウス腸の受動的CLARITY(PACT)染色のプロトコルについて説明し、組織切片なしでニューロン、グリア、腸内分泌細胞(EEC)などの上皮下組織の視覚化を可能にします。このプロトコルには、ホルムアルデヒド固定組織のヒドロゲル包埋と、その後の陰イオン性洗剤を使用した脱脂化が含まれ、組織を「透明化」します。

要約

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)は、最近、アクリルアミドを包埋して組織を脱脂し(切片化なし)、免疫染色のための3D組織構造を保持するための貴重な技術として進化しました。この技術は、ホメオスタシスや疾患状態において異なる細胞タイプが相互作用する動的な腸環境をイメージングする上で非常に関連性があります。ここでは、マウスの腸に最適化されたこの方法について説明し、上皮、腸内分泌、ニューロン、グリア、ニューロンの突起などの細胞タイプを、微生物の感知または栄養化学療法の感知をそれぞれ媒介する上皮細胞または腸内分泌細胞に追跡するのに役立ちます。腸組織(1〜1.5 cm)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1日目に4°Cで一晩固定します。2日目にPFAを廃棄し、組織をPBSで3回洗浄します。組織は、PBS(30% ProtoGelから希釈)中の4%ヒドロゲル(アクリルアミド)溶液で4°Cで一晩インキュベートすることにより、その完全性を維持するためにヒドロゲルを包埋します。 3日目に、組織-ヒドロゲル溶液を37 °Cで1時間インキュベートして、ヒドロゲル重合を可能にします。次に、組織をPBSで3回優しく洗浄して、余分なハイドロゲルを取り除きます。その後の脱脂化(クリアリング)のステップでは、ドデシル硫酸ナトリウム(PBS中の8% SDS)に37°Cで2日間(4日目と5日目)室温(RT)のシェーカーで組織をインキュベートします。6日目に、クリアされた組織をPBSで十分に洗浄してSDSを取り除きます。組織は、一次抗体(0.3% Triton X-100を含むPBS中の0.5%正常ロバ血清で希釈)で4°Cで一晩インキュベートし、その後、適切な二次Alexa Fluor抗体で室温で1.5時間インキュベートし、DAPI(1:10000)で核染色することで免疫染色できます。組織をきれいなスライドガラスに移し、共焦点イメージングのためにVectaShieldを使用してマウントします。

概要

CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel)は、最近、アクリルアミド(ヒドロゲル)の包埋と組織脱脂質化を含む貴重な技術として進化し、免疫染色(切片化なし)のための3D組織構造を保持しています1,2。ハイドロゲルに包埋された組織は光学的に透明で高分子透過性があり、界面活性剤による脂質の除去後もタンパク質と核酸が保存されます。CLARITYは、Science3誌の2013年に10の注目すべきブレークスルーの1つとして認められました。 当初は、脂質が光散乱やイメージング品質に影響を与える脂質が豊富な脳組織をイメージングするために開発されましたが、現在では腸、肝臓、腎臓、心臓などの他の組織のイメージングに広く使用されています。この技術は、細胞タイプの不規則な分布により細胞間相互作用の評価が偏りを持つ可能性のある切片化の必要性を排除することにより、組織を染色およびイメージングする能力を提供します。また、この手法では、共焦点Zスタックを行い、組織の3次元画像を再現する機会を得ることができ、組織切片からよりも現実的に、さまざまな細胞タイプ間の密度、マイクロアーキテクチャ、細胞間相互作用を決定するのに役立ちます。さらに、この技術は、骨のような緻密な組織の免疫染色やin situハイブリダイゼーション研究を可能にするように変更されています。ハイドロゲルに埋め込まれた3D組織は、上皮細胞、腸内分泌細胞、グリア細胞、神経細胞間の相互作用を解明するための魅力的なプラットフォームを提供し、パーキンソン病、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害などの疾患の病態生理学の理解に重要であると最近引用されています4。

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プロトコル

記載されているすべての動物実験は、動物の使用と世話に関するエモリー大学委員会によって承認されました。8-12週齢のC57BL/6マウス(雄と雌の両方を使用できる)は、安楽死前に食物と水への自由なアクセスを許可されました。

1. 腸の除去(1日目)

  1. 二酸化炭素窒息法により、1.6 mLの炭酸ガスの流速でマウスを安楽死させ、呼吸停止が2分間観察されるまで観察します。
  2. マウスを仰臥位にして、手足を固定した解剖ボードに置きます。腹部を70%エタノールで滅菌します。鉗子を使用して、はさみで皮膚を切り開きます。
  3. 肝臓をそっと持ち上げて、胃を特定します。次に、鉗子で胃を保持し、胃のすぐ上の食道を切り取ります。鉗子で胃を保持し、腸間膜をそっと切り取り、腹腔から直腸まで腸を切り離します。直腸で剥離した腸を切り取ります。
  4. 剥離した腸をペトリ皿の氷冷PBS溶液に移します。次に、回腸セグメント間の腸間膜をそっと切り取り、腸をまっすぐにして、胃から始めて結腸までのすべての腸間膜を切り取ります。
  5. CLARITY染色のために目的の腸領域を1〜1.5 cmカットして、氷のように冷たいPBSを含む新しいペトリ皿に染色します。
  6. 20 G針の鈍い端に取り付けられた5 mLシリンジを使用して、氷冷PBSで糞便内容物を洗い流します。.
    注:腸のどの領域も、同じ手法を使用してCLARITY染色に使用できます。腸セグメントは、腸間膜に沿って切り開くか、または後続のステップにそのまま使用できます。

2. 腸管組織の固定(1日目)

  1. PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に組織を固定します。
  2. 目的の腸管部分の1〜1.5 cmを、4% PFAで満たされた15 mLの円錐形チューブに4°Cで一晩移し、固定します。

3. ハイドロゲルの埋め込み(2日目)

  1. 鉗子付きの4%PFA溶液から腸管をPBS溶液が入った新しい15mLコニカルチューブに移し、3回(各5分間、150〜200rpmのシェーカーで)洗浄して、残留PFAを除去します。
  2. 4%ヒドロゲルの調製
    1. 30%ゲル溶液(ProtoGel)を使用して、ヒドロゲルを調製します。4%ヒドロゲル溶液を調製するには、30%ストック溶液をPBSで希釈して希釈します。12 mLの4%ヒドロゲルを調製するには、1.6 mLの30%ゲル溶液を取り、10.4 mLのPBSを加えます。
  3. ステップ3.1の固定組織を移します。PBS中の4%ヒドロゲル溶液を15 mLのコニカルチューブに入れ、4°Cで一晩インキュベートします。
    注:一晩インキュベートした後、PBSを使用して組織をPFAなしで洗浄することを強くお勧めします。PFAに長期間保存された組織は、その後のステップや染色で良好な結果を得られません。PBS洗浄後の固定組織は、4°Cで1週間保存できます。

4. ハイドロゲル重合・脱脂(クリアリング)ステップ(3日目)

  1. 組織をヒドロゲル溶液に入れた円錐形のチューブを4°Cから取り出します。 37°Cのウォーターバスに移し、1時間インキュベートします。このステップにより、ヒドロゲル重合が可能になります。
  2. 1時間後、ウォーターバスのハイドロゲル包埋組織が入った円錐管を取り出し、アクリルアミド溶液を注ぎます。次に、室温で1回のPBS洗浄でティッシュをやさしくすすぎ、余分なヒドロゲルを取り除きます。
  3. 脱脂ステップ
    1. PBS中のドデシル硫酸ナトリウム(8%SDS)で組織をインキュベートすることにより、脱脂物化します。ステップ 4.2 のハイドロゲル包埋組織を 50 mL コニカルチューブ内の 8% SDS 溶液に移します。組織がSDS溶液に完全に浸されていること、およびチューブがキャップされていることを確認してください。
    2. SDS中の組織を含むキャップ付き50 mLチューブを室温で37°Cのシェーカー(200 rpm)に2日間(4日目および5日目)移し、脱脂します。
      注:2日間のインキュベーション中に37°Cで発生する可能性のある蒸発を補うために、SDS溶液が50mLコニカルチューブに少なくとも20〜25mLまで充填されていることを確認してください。
  4. 4日目と5日目に、SDSで組織を室温で37°Cシェーカー(200rpm)でインキュベートします。

5. 汚れたティッシュから洗剤を洗い流す(6日目)

  1. SDS溶液から組織を取り出します。ティッシュは「透明」または透明に見えます。
  2. 組織をPBS溶液を入れた新しい50mLコミカルチューブに移し、PBSを数回交換しながら室温のシェーカー(150〜200rpm)で1日かけて洗浄し、SDSの痕跡がすべて除去されるようにします。PBS溶液を少なくとも10回交換すると、組織がSDSから解放されることが保証され、経験則として、最終的なPBS洗浄にSDSからの泡/泡の痕跡がないかどうかを確認することをお勧めします。 SDSはその後の染色ステップを妨げる可能性があるため、これは重要なステップです。
    注:一日の終わりには、PBSで数回洗浄した後に透明化された組織は、免疫染色の準備ができているか、または4°Cで最大3週間保存される可能性があります。
  3. 透明化した腸組織をPBS溶液で1か月以上保存すると、組織の完全性と染色の質に影響します。最良の結果を得るには、クリアした腸組織をすぐに、またはクリアしてから1〜2週間以内に使用してください。

6. 神経細胞、グリア細胞、腸内分泌細胞の免疫蛍光染色

  1. 透明化した組織を1.5 mLまたは2 mLのチューブに移し、0.3% Triton X-100を含むPBS中の0.5%正常ロバ血清で希釈した各一次抗体を500 μLの容量で4°Cで一晩インキュベートします。 使用した抗体(Ab):Tuj1またはβ-3-tubulin(Pan neuronal marker, 1:1000)、Glial Fibrillary Acid Protein(GFAP, 1:500)、Chromogranin A(1:250)。
  2. 一晩インキュベートした後、組織を3回のPBS洗浄(1〜1.5 mLのPBSを使用して各5分間)にさらし、結合していない一次抗体を除去します。
  3. 組織を新しいチューブに移し、その後、適切な二次Alexa Fluor Ab(AF)500 μLと室温で暗所で1.5時間インキュベートします。使用される二次Abは、Tuj1(1:1000)用のAF488、GFAP用のAF-555(1:500)、およびクロモグラニンA用のAF555(1:250)です。
  4. インキュベーション後、ステップ6.2のように組織をPBSで3回洗浄します。
  5. 核を染色するために、組織をDAPI(1:10000希釈または0.2μLの2mL PBS)で室温で5分間インキュベートします。
  6. 最後に、染色した組織を清潔なスライドガラスに移し、組織の上にカバースリップを追加し、共焦点イメージング用に100μLのVectaShieldを使用してマウントします。
  7. スライドを暗所のスライドホルダーに室温で30分間置いて乾燥させた後、-20°Cでイメージングまたは保存することができます。 マウスの腸壁はかなり薄く、腸間膜に沿って開くと、カバースリップで直接スライドガラスに取り付けることができます。脾臓、腎臓、チャンバー(空洞)スライド、スペーサーなどの大きな組織を扱う場合は、使用することができます。のような大きな組織の場合、キャビティスライドを取り付けに使用できます。
    注:最初のステップで腸管が切り開かれなかった場合(ステップ1の注を参照)、取り付けを含むステップを容易にするマイクロハサミで腸管を切り開くことをお勧めします。

7. 共焦点イメージング

注:透明化、染色、およびマウントされた組織は、すぐに画像化することも、-20°Cのスライドボックスに保存することもできます。

  1. 共焦点顕微鏡(オリンパスFV1000など)を使用した画像。
  2. 腸組織の厚さ50 μmにわたってzスタックを取り、腸内腔から漿膜層までの領域を視覚化します。
  3. ソフトウェア5の助けを借りて、zスタック画像を画像ファイル、.aviムービーファイルとして保存するか、3D画像に変換します。

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結果

CLARITYでクリアされたマウス腸組織からの画像を 図1に示します。プロトコールを成功裏に完了すると、高品質で鮮明な画像が得られ、すべての細胞の詳細を鮮明に視覚化できます。核のDAPI染色は、組織の完全性を表現できるため、CLARITYプロトコルとその後の免疫染色の品質を評価するための非常に優れた指標です。さらに、細胞形状は、特に異なる細胞形態を持つニューロン細胞、グリア細胞、腸内分泌細胞の場合に、プロトコルがどのように成功したかについての手がかりを提供します。染色が乏しい/異常な歪んだ細胞は、組織の準備が損なわれていることを示しています。

汎ニューロンマーカーTuj1(β-3-tubulin、赤)で染色し、グリアマーカーGlial Fibrillary Acid Protein(GFAP、緑)で共染色したマウス回腸を 図1Aに示します。図 1Bは、イメージングソフトウェアを用いてzスタックから生成され...

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ディスカッション

CLARITY法は、マウスの腸を染色して、上皮細胞、ニューロン、グリア細胞などのさまざまな細胞タイプ、特に腸壁を横切って内腔5 に広がるニューロン突起のネットワークと、グリア細胞およびEEC細胞への神経支配を3Dで視覚化するのに非常に役立ちます。ここで紹介した方法は、Yang et al. 20141.

プロトコールの重要なステップには、腸組織の一晩の固定後の固定剤の即時洗浄、その後のハイドロゲルの埋め込み、および脂質の脱脂が含まれます。脱脂後のPBS洗浄は、脱脂ステップで使用される残留界面活性剤を除去するために重要です。

CLARITY染色は、切片化せずに組織構造、タンパク質、核酸を保持した組織イメージングを可能にし、灌流組織でも優れた品質の画像を提供し、組織のマイクロアーキテクチャとニューロングリア、EEC-グリアなどの細胞相互作用の3D評価を可能にするという...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

著者らは、米国消化器病学会(AGA)のAGA-Rome Functional GI motility Disorders Pilot Research Award(BCへ)、米国国立衛生研究所助成金AI64462(ASN)、およびエモリー大学統合細胞イメージング顕微鏡コアからの支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% パラホルムアルデヒド (PFA)  PBSThermoFischer ScientificJ19943組織固定に使用
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩 (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10,000 希釈
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 希釈
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-214281/500 希釈
抗 GFAP (グリア線維酸タンパク質)Abcamab72601/500 希釈
抗ベータ III チューブリン (または Tuj1)Abcamab182071/1000 希釈
クロモグラニン AAbcamab151601/250 希釈
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890有毒、危険、取り扱いには注意が必要-使用のためのPBSで4%の溶液を作る
ドデシル硫酸ナトリウムThermoFischer Scientific283648% PBS
Vectashield 取り付け媒体Vector LaboratoriesH-1000

参考文献

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
  12. Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

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