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方法論記事

免疫染色と in situ ハイブリダイゼーションの併用による活性化マウス嗅覚ニューロンの研究

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DOI:

10.3791/62150

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2021年4月11日

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1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 in situ ハイブリダイゼーションと免疫蛍光法を組み合わせて、マウスの化学刺激による活性化後に嗅覚ニューロンで発現する嗅覚および鋤鼻受容体遺伝子を同定します。

要約

動物は、食物の品質評価から利用可能な交配パートナーや脅威の検出に至るまで、関連する環境情報を伝達および認識するために化学的コミュニケーションに依存しています。マウスでは、このタスクは主に嗅覚系とその基礎となるサブシステム(主嗅覚系と副嗅覚系を含む)によって実行されます。どちらも末梢器官に、鼻腔に到達する化学的手がかりに結合できるGタンパク質共役受容体を発現する感覚ニューロンが配置されています。これらの受容体の分子特性はよく理解されていますが、それらの同族特異的リガンドについてはほとんど知られていません。ここで説明する方法は、嗅覚受容体または鋤鼻受容体の in situ ハイブリダイゼーション検出と、ニューロン活性化のマーカーであるリン酸化リボソームタンパク質S6(pS6)の免疫検出を組み合わせたものです。このプロトコルは、嗅覚器官によって検出された精製されたまたは複雑な化学刺激への単一のイベントにさらされた後に活性化されたニューロンを識別するために考案されました。重要なことに、この技術により、生物学的に関連する状況でトリガーされたニューロンの調査が可能になります。理想的には、この方法は、嗅覚系の分子生物学を調査し、嗅覚行動を研究するために使用する必要があります。

概要

ケモシグナル伝達は、動物における最も普及しているコミュニケーション形態です。哺乳類では、化学的手がかりの検出は主に嗅覚を介して媒介され、食物を見つけ、交配可能なパートナーを見つけ、潜在的な捕食者を避けるために最も重要です1,2,3。マウスの嗅覚系はさらに異なるサブシステムに分割され、それぞれが独自の解剖学的、生理学的、分子的特性を持つ4。これらの中で、主嗅覚系(MOS)と副嗅覚系(AOS)は最も広く研究され、より特徴付けられています。

MOSは、主に鼻腔に到達する揮発性化学分子の検出を担当しています。これは、システムの感覚インターフェースである主要な嗅上皮(MOE)に生息する嗅覚ニューロン(OSN)によって達成されます。各OSNは、数千の嗅覚受容体(OR)のうちの1つを、単一遺伝子および単一対立遺伝子の方法で発現します5。さらに、ORは広く調整される傾向があり6、単一の匂い物質が複数のORに結合し、匂いのコンビナトリアルコードを生成することがある7。

次に、AOSは主にフェロモンとカイロモンの検出を担当します。これらのリガンドは、鋤鼻器官(VNO)の鋤鼻感覚神経(VSN)を活性化します。VNOの頂端領域のVSNは、鋤鼻受容体1ファミリー(V1Rs)8の受容体を発現し、基底領域のニューロンは鋤鼻受容体2ファミリー(V2Rs)9を発現します。重要なことに、一部のVSNは、複数の鋤鼻受容体10,11,12を共発現することが示されている。

ORとVRの分子特性に関するすべての利用可能な情報にもかかわらず、それらの同族リガンドに関する知識はまだ非常に限られています。分子刺激や複合刺激の検出に関与する特定の嗅覚ニューロンの同定は、嗅覚、嗅覚誘導行動、生理学的反応を研究する人々にとって重要な課題です。嗅覚受容体を脱オーファニー化するために、カルシウムイメージング7、シングルセルRNAシーケンシング13,14、異種受容体発現15、および即時初期遺伝子(IEG)16に基づく戦略など、いくつかの戦略が試みられてきた。最近では、感覚ニューロンにおける匂い物質の調節効果を評価するために、in vivoカルシウムイメージング17,18および蛍光タンパク質タグ付きシングルセルRNAシーケンシング戦略19を用いて、いくつかの技術が採用されている。これらの技術のほとんどは、人工的なセットアップを必要とするか、解離したニューロンに対して実行されるため、使用される匂いによって引き起こされる行動を同時に評価することは不可能です。

ここで説明するプロトコルは、特定のORまたはVRを検出するリボプローブと、ニューロン活性化の代理であるリン酸化S6リボソームタンパク質（pS6）の免疫検出を組み合わせることにより、臭気曝露の単一イベント後に活性化される感覚ニューロンの同定を可能にする。この方法は、生物学的に関連性のある状況で、さまざまな化学信号によって活性化される感覚ニューロンの同一性を調査するための信頼性の高い方法です。

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プロトコル

動物の手順は、カンピーナス大学(生物学研究所の施設内動物管理および使用委員会-研究における動物使用の倫理委員会)によって承認された動物プロトコル#1883-1に従って実施されました。これは、連邦動物実験管理評議会(CONCEA)によって確立されたガイドラインに準拠しています。

1. 材料の準備

  1. 1 L の 3% H2O2 (v/v) を 1x PBS で調製します。100 mL 10× PBSと100 mLの30%H2O2 を500 mLの超純水で希釈します。超純水でボリュームを完成させます。使用直前にこの溶液を準備してください。
  2. 5×SSC溶液で濡らした糸くずの出ない実験室用ワイプの破片を含む加湿チャンバーを準備します。
  3. ハイブリダイゼーション洗浄液を調製します:5× SSC(55 °C)、2× SSC(55 °C)、0.2× SSC(55 °C)および 0.1× SSC(55 °C および室温)。20× SSC原液を適量RNaseフリーの超純水に溶解します。各実験を開始する前に、希釈した溶液を新鮮に調製します。
  4. 免疫組織化学ブロッキング溶液を調製します:1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100。100 mLの場合、10 mLの10× PBS、10 mLの10% BSA、および3.33 mLの3% Triton X-100を70 mLの超純水で希釈します。超純水でボリュームを完成させます。各実験を開始する前に、希釈した溶液を新鮮に調製します。
  5. PTw溶液を調製します:1× PBS / 0.1%Tween-20。100 mLの場合、10% Tween-20 1 mLと1×0 mLの10 mLを70 mLの超純水で希釈します。超純水でボリュームを完成させます。各実験を開始する前に、この溶液を新たに調製してください。
  6. RNaseフリーの0.1 Mトリエタノールアミン溶液を調製します。250 mLの場合、撹拌下で3.33 mLの試薬グレードのトリエタノールアミンを200 mLのRNaseフリー超純水で希釈します(この溶液を調製する場合は、RNaseフリーのガラス器具とマグネチックスターラーを使用してください)。HClでpHを8.0に調整し、RNaseフリーの超純水で容量を完成させ、使用するまで光を避けて保管してください。各実験を開始する前に、この溶液を新たに調製してください。
  7. RNaseフリーの0.1% H2O2 (v/v) を 1× PBS 中に調製します。1 Lの場合、100 mLの10× PBSと3.3 mLの30%H2O2 を500 mLのRNaseフリー超純水で希釈します。RNaseフリーの超純水でボリュームを完成させます。使用直前にこの溶液を準備してください。
  8. 以下のRNaseフリー溶液を調製します:0.2 M HCl;1 M Tris-HCl pH 8.0;10 mg/mL 酵母 tRNA;10%のSDS;10×PBS;100×デンハルトの解決策。20× SSC;50%デキストラン硫酸塩;6 M HCl
  9. RNaseフリーの4%パラホルムアルデヒド固定液を調製します。100mLの場合、4gのパラホルムアルデヒドを1×PBSの80mLに溶解します。10 M NaOHでpHを7.4に調整します。1×PBSでボリュームを完成させます。この溶液は、各実験の開始前に新たに調製する必要があります。
    注意： パラホルムアルデヒドは、吸入すると害を及ぼす可能性のある有害物質です。ドラフトの下で溶液を調製し、保護手袋、マスク、安全ゴーグルを着用してください。
  10. RNaseフリー解剖液を調製します:30%スクロース/ 0.45 M EDTA pH 8.0 / 1× PBS。100 mLの場合、30 gのスクロースを60 mLのRNaseフリー0.5 M EDTA pH 8.0に溶解します。10×PBSを10mL加えます。RNaseフリーの0.5 M EDTA pH 8.0で容量を完成させます。
  11. RNaseフリーのガラス製またはプラスチック製のメスシリンダーとビーカーを準備します。
  12. RNaseフリーのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液を調製します:50%脱イオンホルムアミド(v / v)/600 mM NaCl / 200 μg / mL酵母tRNA / 0.25%SDS(w / v)/10 mM Tris-HCl pH 8.0 / 1×デンハルト溶液/ 1 mM EDTA pH 8.0 / 10%デキストラン硫酸塩(w / v)。メスシリンダーに10 mL入る場合は、脱イオンホルムアミド5 mL、5 M NaCl 1.2 mL、10 mg/mL 酵母tRNA200 μL、10% SDS100 μL、100 μL pH 8.0 100 μL、50×デンハルト溶液200 μL、500 mM EDTA pH 8.0 20 μL、50%デキストラン硫酸塩2 mL(M.W. 500,000)を添加します。RNaseフリーの超純水でボリュームを完成させます。各実験を開始する前に、この溶液を新たに調製してください。
    注:デキストラン硫酸塩は非常に粘性があります。ピペッティングエラーを考慮するために、ハイブリダイゼーション/プレハイブリダイゼーション溶液の総量の20%を追加で調製することをお勧めします。酵母tRNAは、必要に応じて、プレハイブリダイゼーション溶液から省略してもよい。
  13. 熱可塑性実験室用フィルムカバースリップを準備します。長方形の熱可塑性実験室用フィルム片を、顕微鏡スライドの長さと幅より1〜2mm短くカットします。
  14. TNバッファー:100 mM Tris-HCl/150 mM NaClを調製します。100 mLの場合、10 mLの1 M Tris-HCl pH 7.5および3 mLの5 M NaClを70 mLの超純水で希釈します。超純水でボリュームを完成させます。各実験を開始する前に、この溶液を新たに調製してください。
  15. TNBブロッキングバッファーを調製します:TNバッファー中の0.5%ブロッキング試薬A(w / v)。200 mLの場合、ブロッキング試薬A1 gをTNバッファー200 mLに溶解します(ブロッキング試薬Aの市販の供給源については 、材料表 を参照)。
  16. TNTバッファーを調製します:0.05%Tween-20 TNバッファー中。1 Lの場合、5 mLの10% Tween-20を950 mLのTNバッファーで希釈します。泡立ちを避けるために、TNバッファーでゆっくりとボリュームを完成させます。各実験を開始する前に、この溶液を新たに調製してください。
  17. チラミド-Alexa 488の作業溶液を準備します:1×増幅バッファーA / 0.0015%H2O2 / 1:100チラミド-Alexa488。100 μL の場合、1 μL の 0.15% H2O2 と 1 μL のチラミド-Alexa 488 を 98 μL の増幅バッファー A で希釈します (チラミド-Alexa 488 および増幅バッファー A の市販の供給源については 、材料表 を参照)。使用直前にこの溶液を準備してください。
  18. チラミド-Alexa 555の作業溶液を準備します:1×増幅バッファーA / 0.0015%H2O2 / 1:100チラミド-Alexa 555。100 μL の場合、0.15% H2O2 の 1 μL と 1 μL のチラミド-Alexa 555 を 98 μL の増幅バッファー A に希釈します (チラミド-Alexa 555 および増幅バッファー A の市販の供給源については 、材料の表 を参照)。使用直前にこの溶液を準備してください。
  19. チラミド-ビオチン作業溶液を調製します:1×増幅バッファーB / 0.0015%H2O2 / 1:50チラミド-ビオチン。100 μL の場合、0.15% H2O2 の 1 μL と 2 μL のチラミド-ビオチンを 97 μL の増幅バッファー B で希釈します (チラミド-ビオチンおよび増幅バッファー B の市販の供給源については、材料の表を参照)。使用直前にこの溶液を準備してください。
  20. ガラス製品を200°Cで少なくとも4時間焼きます。使い捨てではないプラスチック製品(スライドラック、Coplinジャー、シリンジを含む)を3%H2O2 で15〜30分間処理し、その後、RNaseフリーの水で徹底的に洗浄します。解剖ツール、鉗子、クライオスタット試料ホルダーなどのステンレス製金属器具を3% H2O2 で15分間処理し、その後、RNaseフリー水で十分に洗浄します。ベンチの表面、加熱されたプレート、およびドライブロックをRNase洗浄液で洗浄します。

2. Riboprobeの合成

注:in vitro転写によるin situハイブリダイゼーションのために1kbのジゴキシゲニン標識cRNAプローブを合成する以下の手順は、以前に公開されたプロトコル20,21,22,23に基づいています。

  1. 適切なオリゴヌクレオチドプライマーペアを使用して、目的の遺伝子(嗅覚受容体遺伝子など)から1 kbのDNAフラグメントを増幅します。検出する成熟mRNAに存在する領域を増幅するプライマーペアを選択します(例えば、遺伝子のコード配列)。さまざまな嗅覚受容体用のプライマーの選択は、材料の表に記載されています。他の鋤鼻嗅覚受容体を検出するプローブの詳細については、以前の出版物16,21を確認してください。
  2. 0.8%アガロースゲル上でPCR産物を泳動し、目的の1 kbバンドを除去します。
  3. メーカーのプロトコルに従って、適切なミニカラムベースのゲル精製キットを使用してDNAフラグメントを精製します。
  4. 精製されたDNA断片を定量し、メーカーのプロトコルに従って適切なPCRクローニングベクターにクローニングします。クローニングされたアンプリコンに隣接するT7およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含むクローニングベクターを使用することをお勧めします。
  5. メーカーのプロトコルに従って、化学形質転換またはエレクトロポレーションにより、組換えプラスミドを有能な組換えフリー細菌に変換します。
  6. 分離された形質転換細菌コロニーをリッチ培地に播種し、メーカーのプロトコルに従ってDNAミニ調製によりプラスミドを単離します。
  7. 適切な制限酵素および/またはサンガーシーケンシングを用いて制限酵素解析を行い、メーカーのプロトコールに従って挿入されたDNA断片の同一性と配向を確認します。
  8. 制限酵素を用いて、10 μgのプラスミドを線分化するための制限酵素処理を行います。 in vitro 転写後にアンチセンスリボプローブを作製するには、遺伝子のコード配列の下流に位置するRNAポリメラーゼプロモーターとは反対側のインサートの末端でプラスミドDNAを消化する制限酵素を使用します。 in vitro 転写後にセンスリボプローブを作製するには、遺伝子のコード配列の上流に位置するRNAポリメラーゼプロモーターとは反対側のインサートの先端でプラスミドDNAを消化する制限酵素を使用します。
  9. プラスミド直鎖化反応産物のアリコートを0.8%アガロースゲル上で分析し、消化の完全性を確認します。完全な直進化が確認されたら、メーカーのプロトコルに従って、カラムベースのPCRクリーンアップキットを使用して反応の残りの部分を精製します。
  10. 1-2 μgの直鎖状プラスミドをテンプレートとして、適切な酵素(T7またはSP6 RNAポリメラーゼなど)、および適切なジゴキシゲニン(DIG)標識キットを使用して 、in vitro 転写によりジゴキシゲニン標識cRNAプローブを合成します。
  11. DNase Iで37°Cで30分間消化することにより、反応からDNAテンプレートを除去します。
  12. ミニカラムベースのRNA精製キットまたはゲルろ過ベースの精製キットを使用して、cRNAプローブを精製します。得られたプローブを50 μLのRNaseフリー水で溶出します。
  13. 得られたリボプローブを、できれば蛍光法を用いて定量します。通常、期待される収率は100 ng/μL以上です。
  14. 自動電気泳動システムまたはRNaseを含まない0.8%アガロースゲルでリボプローブを泳動し、プローブの品質と劣化を確認します。
  15. 合成したプローブは、必要になるまで-80°Cで保存してください。

3. マウスの嗅覚刺激への曝露

  1. 曝露の少なくとも24時間前に、各動物を清潔なケージに個別に収容します。曝露の少なくとも2時間前にフードグリッドを取り外してください。本試験で用いた動物は、すべて生後8-12週齢の雄C57BL/6マウス(平均体重20g)でした。
  2. 適切な嗅覚刺激を準備します。MOE(主嗅上皮)またはVNO(鋤鼻器官)の嗅覚ニューロンを活性化するために、さまざまな刺激を使用することができます。嗅覚刺激の包括的なリストについては、他の出版物3、16、22、23、24を参照してください。薬液、尿、組換えタンパク質溶液などの液体刺激は、医療用ガーゼやコットンボールに沈着させることができます。
  3. 嗅覚刺激をケージに挿入し、動物を1時間放置します。
  4. マウス被験者を安楽死させ、RNaseフリーの解剖ツールを使用してMOEまたはVNOを迅速に解剖します。

4. 組織解剖と凍結

  1. 解剖液を使用して、実体顕微鏡でMOEまたはVNOを解剖します。
    1. VNOの場合は、厚い中隔骨を取り除き、臓器を囲む柔らかい軟骨殻を残します。
  2. クライオ切片用の試料を準備します。
    1. 標本を吸い取り紙で乾かし、包埋培地を含む組織学的プラスチック型内に置きます。
    2. VNOの場合は、各臓器を垂直に配置し、1mLの注射器を使用してプラスチック型の底に引っ張ります(図1A)。
    3. MOEの場合は、篩状プレートを下にしてプラスチック金型の底に置きます。
    4. 試験片の周りの余分な気泡は、切片作成の妨げになる可能性があるため、取り除きます。
    5. 試料をドライアイスで凍結します。
    6. 試料ブロックは-80°Cで保管してください。
      注:凍結した試料は、切片化する前に数ヶ月間保存することができます。
  3. クライオセクショニングを行います。
    1. クライオスタットをオンにし、使用の少なくとも4時間前に温度を-4°Cに設定してください。
    2. 凍結したブロックを組織学的プラスチック型から取り外し、かみそりの刃でトリミングします。
    3. 試験片の周囲に5 mmの間隔を空けると、切片の取り扱いが容易になります(図1B)。
    4. 埋め込み媒体を使用して、ブロックをクライオスタットの試料ホルダーに取り付けます。
    5. 16 μmの切片を正に帯電した顕微鏡スライドに集めます。
    6. スライドは-80°Cで保管してください。
      注:スライドは、 in situ ハイブリダイゼーションの前に数ヶ月間-80°Cで保存できます。

5. 段階的な in situ ハイブリダイゼーションプロトコール

  1. ヘアドライヤーを使用してスライドを10分間乾かします。ウォームジェットを使用してスライドを解凍し、埋め込み媒体が不透明になるまで室温ジェットに切り替えます。
  2. RNaseフリーの4%パラホルムアルデヒド固定液をスライドあたり500 μL添加し、23-26°Cで15分間インキュベートして組織切片を固定します。
  3. スライドをRNaseフリーの1×PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
  4. RNaseフリーの0.2 M HClをスライドあたり500 μL添加し、23-26°Cで10分間インキュベートします。
  5. スライドをRNaseフリーの1×PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
  6. RNaseフリーの0.1% H2O2/1× PBSのスライドあたり500 μLを添加し、23-26 °Cで30分間インキュベートします。 この手順は、過酸化水素の光による劣化を防ぐために、暗闇で行ってください。
  7. スライドをRNaseフリーの1× PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
  8. ヒュームフード内の250 mLのRNaseフリートリエタノールアミン0.1 M pH 8.0とマグネチックスターバーが入ったジャーにスライドを移し替えてアセチル化を行います。625 μLの無水酢酸を絶えず攪拌しながら添加します。攪拌速度を下げ、さらに625 μLをスライドに一滴ずつ加え、攪拌をオフにして10分間インキュベートします。
  9. スライドをRNaseフリーの1× PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
  10. スライドをRNaseフリーの1× PBSで1回、60°Cで5分間洗浄します。
  11. 1× PBSからスライドを一度に1つずつ除去し、糸くずの出ない実験用ティッシュペーパーを使用して各スライドをブロッティングして乾燥させることにより、プレハイブリダイゼーションを行います。400 μLのプレハイブリダイゼーション溶液を各スライドにピペットで移し、60°Cで予め加温した加湿チャンバー内にウォーターバスまたは加熱オーブンで入れます。60°Cで1時間インキュベートします。
  12. 十分なハイブリダイゼーション溶液を60°Cに加熱し、マイクロチューブ内でスライドあたり200μLを分量し、85°Cまで10分間加熱します。
  13. ハイブリダイゼーション溶液チューブに適切なcRNAプローブを添加し(各プローブ1 μg/mL)、85°Cで5分間変性させます。
  14. ハイブリダイゼーションの場合は、加湿チャンバーから一度に1枚のスライドを取り出し、拭き取って乾かし、60°Cの加熱プレートに置きます。200 μLのリボプローブ含有ハイブリダイゼーション溶液を加え、スライドをガラスカバースリップで覆います。加湿チャンバー内で60°Cで12〜16時間インキュベートします。
    注:プレハイブリダイゼーション後にスライドを冷まさないでください。ハイブリダイゼーション温度は、各プローブについて経験的に決定する必要があります。摂氏60度は、一般的に1 kbのプローブでうまく機能するため、出発点として推奨されます。
  15. SSC洗浄液を別々のジャーで55°Cに加熱し、適切な温度の水浴に入れます。
  16. ハイブリダイゼーションが終了したら、55°Cで5×SSC溶液を含む浴を使用して、各スライドからカバーガラスをはがします。 各スライドを温かいSSC溶液内で水平に保持します。カバーガラスが外れたら、スライドを傾けてカバーガラスを下まで落とします。
  17. 2×SSCで55°Cでスライドジャーで30分間洗浄します。
  18. 0.2×SSCで55°C、スライドジャーで20分間洗浄します。
  19. 0.1×SSCで55°C、スライドジャーで20分間洗浄します。
  20. 23-26°Cで0.1×SSCに移し、スライドジャー中で3分間インキュベートします。
  21. スライドジャーでPTwで10分間洗浄します。
  22. TNバッファーでスライドジャーで2回、各5分間洗浄します。
  23. 600 μLのTNBブロッキングバッファーを各スライドにピペットで移し、23-26 °Cで3時間インキュベートします。
  24. 一次抗体溶液(TNB溶液で1:400に希釈したペルオキシダーゼ標識抗DIG抗体)を各スライドに500 μLをピペットで移します。熱可塑性ラボフィルムを各スライドに慎重に重ね、4°Cで12〜16時間インキュベートします。
  25. スライドをTNTバッファーで6回、スライドジャー内で穏やかに攪拌しながら5分間ずつ洗浄します。
  26. 各スライドに100 μLのチラミド-ビオチン作業溶液をピペットで移します。熱可塑性実験室用フィルムカバースリップで覆い、23-26°Cで12分間インキュベートします。
    注:このインキュベーションステップは、バッチごとに2枚または3枚のスライドを使用して、インキュベーション時間を適切に制御できるように、ずらして実行します。チラミドのインキュベーション期間は、cRNAプローブの感度と濃度に応じて最適化する必要がある場合があります。
  27. スライドをTNTバッファーで6回、スライドジャー内で穏やかに攪拌しながら5分間ずつ洗浄します。
  28. ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン (SA-HRP、TNBバッファーで1:100に希釈) を含む溶液200 μLを各スライドにピペットで移し、熱可塑性ラボフィルムカバースリップで覆います。23-26°Cで1時間インキュベートします。
  29. スライドをTNTバッファーで6回、スライドジャー内で穏やかに攪拌しながら5分間ずつ洗浄します。
  30. 各スライドに100 μLのチラミド-Alexa 488ワーキング溶液をピペットで移し、熱可塑性ラボ用フィルムカバーガラスで覆い、暗所で23-26°Cで12分間インキュベートします。
  31. スライドをTNTバッファーで6回、スライドジャー内で穏やかに攪拌しながら5分間ずつ洗浄します。
  32. スライドジャー中で3% H2O2/1× PBSで1時間インキュベートし、前のステップからペルオキシダーゼを不活性化します。
  33. スライドをTNTバッファーで6回、スライドジャー内で穏やかに攪拌しながら5分間ずつ洗浄します。

6. pS6免疫染色

  1. 500 μLの4%パラホルムアルデヒド/1× PBS溶液を各スライドにピペットで移し、23-26°Cで15分間インキュベートして切片を固定します。
  2. 1× PBS/0.1% Triton X-100 500 μL を各スライドにピペットで移し、5 分間インキュベートして切片を透過化します。
  3. スライドジャーに1×PBSを入れて2回洗います。
  4. 市販のチラミドシグナル増幅ブロッキング溶液B(Table of Materials)のセクションごとに2〜3滴をピペットで動かし、23〜26°Cで1時間インキュベートします。
  5. 400 μLの免疫組織化学ブロッキング溶液を各スライドにピペットで移し、23-26°Cで30分間インキュベートして切片をブロックします。
  6. 200 μLのウサギ抗pS6一次抗体溶液(免疫組織化学ブロッキング溶液で1:200に希釈、最終濃度:1 μg/mL)を各スライドにピペットで移し、熱可塑性ラボフィルムカバースリップで覆い、4°Cで12〜16時間インキュベートします。
  7. スライドジャーで1× PBS/0.1% Triton X-100を5分間ずつ3回洗浄します。
  8. 市販のペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体溶液(材料表)のスライドあたり2〜3滴をピペットで動かし、23〜26°Cで1.5時間インキュベートします。
  9. スライドジャーで1× PBS/0.1% Triton X-100を5分間ずつ3回洗浄します。
  10. スライドをブロットして乾燥させ、100〜200 μLのチラミド-Alexa 555ワーキング溶液を各スライドにピペットで移し、熱可塑性実験室用フィルムカバースリップで重ね、暗所で7分間インキュベートします。
  11. スライドジャーで1×PBSでそれぞれ5分間2回洗浄します。
  12. 希釈した核染色液500 μL(1× PBS中)を各スライドにピペットで移し、23-26°Cで30分間インキュベートします。
  13. スライドジャーで1×PBSを23〜26°Cでそれぞれ5分間2回洗浄します。
  14. スライドを退色防止封入剤で取り付け、埋込剤を暗所で24時間硬化させます。
  15. スライドはイメージングまで適切な温度で保存し、蛍光の退色を防ぎます。

7. 顕微鏡イメージング

  1. 使用する蛍光色素に適したフィルターを装備した落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用した画像スライド。

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結果

現在のプロトコルは、実験者の目的の遺伝子とニューロン活動マーカーpS6が蛍光標識された顕微鏡画像を取得することを目的としています。記載されている方法には、チラミドシグナル増幅が含まれ、バックグラウンドがほとんどまたはまったくない明確で強力な標識が生成されます。pS6免疫染色は、通常、神経細胞体全体を満たす細胞質蛍光シグナルとして現れますが、嗅覚受容体ニューロンの in situ ハイブリダイゼーションシグナルは細胞質染色として現れます。pS6は嗅覚ニューロンの活性化の一過性マーカーであるため、感覚器官の固定前の1時間後に活性化された細胞では、関連する免疫染色シグナルがより強く現れます。pS6の染色と受容体との間の蛍光クロストークは、適切なバンドパス顕微鏡フィルターが使用されていれば予想されません。

標識切片は、2種類の染色間の共局在を評価するために使用でき、研究中の活性化ニューロンの集団によって発現される遺伝子の同定が可能になります。図2A,Bは、ネコの匂いに曝露したマウ...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、ORまたはVR受容体の in situ 検出とニューロン活動の間接的なマーカーであるpS6の免疫検出の組み合わせにより、嗅覚系の化学的手がかりによって活性化された感覚ニューロンを確実に識別します。実験者は、組織学の完全性を維持し、RNaseフリー条件下でハイブリダイゼーションの前にすべてのステップを実行するために特別な注意を払う必要があります。これを怠ると、mRNAが分解され、リボプローブの標識が損なわれる可能性があります。嗅器官の解剖中は、固定されていない組織は特に壊れやすく、簡単に損傷する可能性があるため、注意が必要です。

このプロトコルにおけるin situハイブリダイゼーションは、2ラウンドのシグナル増幅を含み、蛍光強度はハイブリダイゼーションまたはシグナル発生に関連する因子によって影響を受ける可能性があることに注意しなければならない。例えば、インキュベーションの温度と期間は経験的に最適化する必要があります。標識が弱いのは、プローブ濃度が低い、...

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開示事項

著者は、いかなる種類の競合する利益も持っていないと宣言しています。

謝辞

リソースを提供してくださったGAG PereiraとJA Yunes、管理および技術支援を提供してくださったAPF FerreiraとWO Bragança、共焦点顕微鏡の支援を提供してくださったLife Sciences Core Facility(LaCTAD-UNICAMP)スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP、助成金番号2009/00473-0および2015/50371-0からF.P.)、PRP/UNICAMP(助成金番号2969/16、725/15、348/14、および315/12からF.P.)、FAPESPフェローシップからV.M.A.C.(2014/25594-3、2012/21786-0、2012/01689-0)、T.S.N.(2012/04026-1)、およびCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superi(CAPES)フェローシップからT.S.N.への支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x 増幅希釈液 (反応緩衝液 from Alexa Fluor 555 チラミド SuperBoost キット)サーモフィッシャーサイエンティフィックB40923 または B40922、チラミド-Alexa 488 またはチラミド-アレクサ 555 信号増幅
20x SSCメルク (Calbiochem)8310-OPn/a
30% ウシ血清アルブミン (BSA)メルク (シグマ-アルドリッチ)A9576n/a
30% 過酸化水素 (H2O2)メルク (Sigma-Aldrich)H1009n/a
無水酢酸メルク (Sigma-Aldrich)320102n/a
アガロースメルク (Sigma-Aldrich)A9539n/a
増幅希釈剤 (TSA ビオチンキットより)アコヤ バイオサイエンス (パーキン エルマー)SAT700001EAチラミド-ビオチンシグナル増幅用ワーキング溶液中の増幅バッファー B として参照
抗 pS6 (Ser 244/247) ウサギ ポリクローナル抗体サーモFisher ScientificCat# 44-923G、RRID:AB_2533798n/a
ブロッキングバッファー 1x (Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost キットから)サーモフィッシャーサイエンティフィB40923 または B40922、チラミドシグナル開発ステップのブロッキング溶液 B として参照されました
ブロッキング試薬 (TSA Biotin キットから)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA製剤でブロッキング試薬 A として参照
サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306n/a
デンハルト溶液 (50x)メルク (シグマ-アルドリッチ)D9905n/a
脱酸素ホルムアミドメルク (Sigma-Aldrich)F9037n/a
デキストラン硫酸溶液 (50%)メルク (ケミコン)S4030n/a
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)メルク (Sigma-Aldrich)E9884該当なし
Hoechst 33342 核染色サーモフィッシャーサイエンティフィックH1399該当なし
塩酸 (HCl)メルク (Sigma-Aldrich)320331n/a
嗅覚刺激n/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
パラホルムアルデヒドMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
ペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体 (Fabフラグメント)Merck (Roche)11207733910; RRID:AB_514500オキシダーゼ標識抗DIG抗体
ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体(polyHRP-conjugated goat anti-rabbit reagent from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroxidase-conjugated streptavidin (from TSA biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold 退色防止封入剤Thermo Fisher ScientificP36934色防止封入剤として参照)
RNaseフリー超純水Thermo Fisher Scientific10977015n/a
塩化ナトリウム (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
水酸化ナトリウム (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
スクロースMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
トリエタノールアミンMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma 塩酸塩 (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 conjugate (from Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 conjugate (from Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin conjugate (from TSA Biotin kit)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Yeast tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922該当なし
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923該当なし
DIG RNA ラベリングキット (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910該当なし
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis 試薬 (バッファー、ラダー、テープ)Agilent5067-5580、5067-5581、および5067-5579自動電気泳動システムとして参照
マウス: C57BL/6J 近交系ジャクソン研究所品番: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColumnsCytiva Biosciences28903408ゲルろ過ベースの精製キット
QIAquick ゲル抽出キットQiagen28506カラムベースのゲル精製キット
RNeasy MinElute クリーンアップキットQiagen74204カラムベースの RNA 精製キット
TSAビオチンキットAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotides
5' –AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr692
5' –ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC –3フィートIntegrated DNA Technologiesn/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		統合DNAテクノロジーn/aOlfr124
5' –TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr1509
5' –TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –TACATCCTGACTCAGCTGGG
ACG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr1512
5' –GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr78
5' –CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr691
5' –AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr638
5' –TTAGTGCACCTTTTTTTGCAAC –3フィート統合DNAテクノロジーn/a
5' –TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aOlfr569
5' –TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r1
5' –CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r2
5' –ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC –3'Integrated		DNA Technologiesn/a
5' –TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r13
5' –AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –CTCTAAGAACAGCAGTAAATGG
ATCT –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r89
5' –ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r118
5' –ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ATCGGATCCGCTGATTTTTTTTTCT
CCCAGATGCTTTTGG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r116
5' –ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r28
5' –GGTGACCCATATTCTGTGTATAA
CTGT –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r41
5' –CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r46
5' –AGTGGGTCTTTTTTAGAAAGGAG
TG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r69
5' –GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG –3フィート		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'統合DNAテクノロジーn/a
5' –TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r90
5' –CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r107
5' –CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA –3フィート		統合DNAテクノロジーn/a
5' –ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG –3フィート		統合DNAテクノロジーn/aVmn2r83
5' –ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG –3フィート		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy ベクターPromegaA1360推奨 PCR クローニングベクター
Other materials
1mL シリンジフィッシャーサイエンティフィック14-829-10Fn/a
コニカルチューブ (15 mLと50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin jarsFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
解剖ツールと鉗子RobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
ドライバスn/a n/a/a
電気泳動機器フィッシャーサイエンティフィック09-528-110Bn / a
ファインポイントペイントブラシWinsor&ニュートン10269097n/a
蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡ライカ マイクロシステムズTCS SP5IIn/a
加熱プレートフィッシャーサイエンティフィックHP88850200n/a
加湿チャンバー (高温で使用する場合は、プラスチック製のタッパーウェア容器内に密封する必要があります)サーモフィッシャーサイエンティフィック22-045-034n/a
糸くずの出ない実験室用キムワイプKimberly-Clark34120、糸くずの出ない実験用ティッシュペーパーとして参照されました
微量遠心分離機 エッペンドルフ5401000013n/a
マウスケージInnoViveM-BTM、MVX1n/a
PCRサーモサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィック4375786n/a
ピペット p1000、p200、p20 使い捨てチップフィッシャーサイエンティフィック02-707-408、02-707-411、02-707-438該当しない
組織学埋め込み金型サーモフィッシャーサイエンティフィック22-19該当なし
量子ビット4 蛍光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックQ33238感度蛍光法として参照
カミソリの刃またはメスフィッシャーサイエンティフィック12-640該当なし
RNAタペステーションまたはバイオアナライザーアジレント4200テープステーションシステムまたは2100バイオアナライザー 機器n/a
RNaseフリー ガラスまたはプラスチックメスシリンダーとビーカーフィッシャーサイエンティフィック10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
実体顕微鏡ライカマイクロシステムズM80n/a
スーパーフロストプラス 顕微鏡スライドサーモフィッシャーサイエンティフィック12-550-15正に帯電した顕微鏡スライド
パラフィルムBemis CompanyPM999は、熱可塑性実験室用フィルム
バスサーモフィッシャーサイエンティフィックTSCIR19n / a
はック は TNB バッファー DAPI 核染色のされました ペル、 (退 ミニ ミニ nはプラスチック 高と呼ばれるウォーターとして参照されました

参考文献

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