方法論記事

C.エレガンスを用いたC.アルビカンスにおける非致死性病原性表現型を研究するための2つの感染アッセイ

DOI：

10.3791/62170

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2021年5月17日

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1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真菌性日和見病原体は、生命を脅かす感染症だけでなく軽度の感染症を引き起こすこともありますが、病原性を研究する際には、非致死的な表現型はしばしば無視されます。そこで、宿主の生存と繁殖の両面をモニタリングする線虫モデルを開発し、真菌の病原性を調査しました。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

病原体は人間にとって致命的となる可能性がありますが、それらの多くは非致死的な表現型を持つさまざまな感染タイプを引き起こします。カンジダ・アルビカンスは、ヒトの日和見真菌病原体であり、院内感染の4番目に多い原因であり、~40%の死亡率をもたらします。しかし、他のC.アルビカンス感染症はそれほど深刻ではなく、致死的になることはめったになく、女性の~75%に影響を与える外陰膣カンジダ症や、主に乳児、エイズ患者、がん患者に影響を与える中咽頭カンジダ症が含まれます。マウスモデルはC.アルビカンスの病因を研究するために最も頻繁に使用されますが、これらのモデルは主に宿主の生存を評価し、費用と時間がかかり、複製に制限があります。そのため、C. albicansを研究するために、Drosophila melanogaster、Danio rerio、Galleria mellonella、Caenorhabditis elegansなど、いくつかのミニモデルシステムが開発されています。これらのミニモデルは、C. albicansの変異体ライブラリーや多様な遺伝的背景のスクリーニングに適しています。ここでは、C.エレガンスを用いてC.アルビカンス感染を研究するための2つのアプローチについて説明します。1つ目は、宿主の繁殖を測定し、個々の宿主の生存を監視する繁殖力アッセイです。2つ目は、C.アルビカンスの感染が複数世代にわたる宿主の個体数増加にどのように影響するかを測定する系統拡大アッセイです。これらのアッセイを組み合わせることで、C. albicansの病原性を迅速に評価するためのシンプルで費用対効果の高い方法が提供されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カンジダ・アルビカンスは、口腔、胃腸、泌尿生殖器など、さまざまなニッチに生息するヒトの日和見病原体です1。通常、C.アルビカンスは共生しますが、粘膜感染症と血流感染症の両方を引き起こし、後者は致命的となる可能性があります。C. albicans感染の重症度は宿主の免疫機能に依存しており、免疫不全の人は健康な人よりも感染しやすい1。宿主関連因子に加えて、C. albicansは、菌糸、バイオフィルム形成、宿主上皮細胞へのC. albicansの接着と浸潤を促進する機能を持つ分泌型アスパルチルプロテイナーゼ(SAP)の産生2、細胞溶解性ペプチド毒素であるカンジダリシン3,4など、いくつかの病原性形質を持っています。まとめると、これは、C. albicansの病原性が病原体とその宿主環境との間の相互作用から生じる複雑な表現型であることを示唆しています。したがって、病原性の調査は、in vitroアプローチとは対照的に、宿主環境として機能するモデル生物を使用して研究するのが最適です。

脊椎動物と無脊椎動物の両方の生物を含むいくつかの宿主モデルが、C. albicans感染を研究するために開発されました。ゴールドスタンダードと考えられているマウスモデルは、その適応免疫系と自然免疫系、および全身および特定の臓器の両方で疾患の進行を監視する能力のためによく使用されます5。ただし、このホストモデルには、メンテナンスコスト、子孫の数が少ない、サンプルサイズが小さいことに伴う検出力と再現性の低下など、大きな制限があります5。そのため、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ワックスガ(Galleria mellonella)、線虫(Caenorhabditis elegans)など、より単純なモデル生物が開発されています。これらの非哺乳類モデル生物は、マウスモデルと比較して、より小さく、実験室のメンテナンスが少なくて済み、サンプルサイズが大きいため、より大きな検出力と再現性が得られます。これらの各モデルには、感染モデルを選択する際に考慮する必要がある特定の長所と短所があります。G. mellonellaは、37°Cで増殖でき、さまざまな食細胞を持っているため、人間と最も生理学的に類似した環境を提供します7。さらに、このモデルでは、特定の接種物7を直接注入することができます。しかし、完全に配列決定されたゲノムはなく、変異株を作成する確立された方法もありません。G. mellonellaと同様に、D. rerioモデルでは、特定の接種物5,7を直接注入することができます。また、適応免疫系と自然免疫系の両方5を持ち、これはこの非哺乳類モデルに特有のものですが、維持するためには水生繁殖タンクが必要です。D. melanogasterおよびC. elegansは、同様の長所と短所を有しており、これには、操作が容易で変異株を生成する完全配列決定されたゲノム7が含まれるが、適応免疫またはサイトカイン7を有していない。これらすべての非哺乳類モデルの中で、C.エレガンスは最も迅速なライフサイクルを持ち、遺伝的に同一の子孫を大量に生成するために自家受精し、大規模なスクリーニングに最も適している6,7,8。C.エレガンスは、抗真菌薬9,10のハイスループットスクリーニング、病原性因子7の特性評価、およびC.アルビカンス特異的宿主防御ネットワーク11の同定に非常に強力である。C.エレガンスの自然免疫系は、ヒトと高度に保存された複数の要素を持っています12。宿主の自然防御には、抗菌ペプチド13(AMP)および活性酸素種14,15,16の産生が含まれます。

C. albicans感染の重症度は、主に宿主の生存率によって測定されますが、非致死性の病原性の表現型を捕捉することはできません。宿主の適応度について見落とされがちな側面は繁殖ですが、いくつかの研究は、C.アルビカンスが精子の生存率を低下させることによって生殖に影響を与えることを示唆しています17,18、これは研究すべき宿主の適応度の重要な側面である可能性があることを示唆しています。したがって、C. albicans感染が宿主の繁殖力に与える影響は、非致死性の病原性の表現型を研究するための有用な方法です。我々は、健康な宿主の生存と繁殖の両方の表現型を調査するために、C.エレガンスを用いた2つの感染アッセイを開発した19,20。ここでは、繁殖力と系統拡大アッセイの両方について説明します。繁殖力は、単一の宿主の子孫と生存の両方を測定し、系統拡大は3つの宿主世代にわたる感染の影響を評価します。これらのアッセイを利用して、C. albicansの欠失変異体をスクリーニングし、致死的および非致死的な病原性表現型の劇的な違いと微妙な違いの両方を捉える方法を示します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 実験の準備手順

  1. C.アルビカンスと大腸菌の培養物の準備
    注:この研究で使用した株を 表1に示します。
    1. C.アルビカンスおよび大腸菌株をグリセロールストックとして-80°Cで維持します。
    2. 滅菌爪楊枝を使用して、C . albicansを 固形酵母ペプトンデキストロース(YPD)(1%酵母抽出物、2%バクトペプトン、2%グルコース、1.5%寒天、0.004%アデニン、0.008%ウリジン)に縞模様で濾し、30°Cで一晩成長させます。
      注: C.アルビカンス 株が補助栄養性の場合は、必要なアミノ酸を培地に補充してください。
    3. 滅菌ループまたはつまようじを使用して、1つの C.アルビカンス コロニーを2mLの液体YPDに接種します。30°Cでインキュベートし、24時間振とうします。
    4. 滅菌爪楊枝を使用して、大 腸菌 (OP50)をLuria Broth(LB;10 g/Lトリプトン、5 g/L酵母抽出物、10 g/L NaCl、15 g/L寒天)寒天プレートに線でなじで貼り付けます。30°Cで一晩インキュベートします。
    5. 1つのOP50コロニーを50 mLのLBに接種し、30°Cで一晩振とうしながらインキュベートします。
  2. 線虫増殖培地調製
    1. 2Lのフラスコに、29gの線虫増殖培地粉末(NGM;17.5g/L寒天、3.0g/L塩化ナトリウム、2.5g/Lペプトン、0.005g/Lコレステロール)を1Lの水に加え、攪拌棒で混ぜる。
    2. 大腸菌の異常増殖を抑制し、C. albicansの増殖を可能にするために、オートクレーブ後に0.2 g / Lの硫酸ストレプトマイシンをNGMに補給します。
      注:線虫の維持にNGMを使用する場合、ストレプトマイシンは必要ありません。
  3. 線虫の個体数の維持
    1. 金属スプレッダーを使用して、調製したNGM寒天プレートに300 μLの大 腸菌 培養物を一晩広げます。この手法は、シードと呼ばれます。
    2. プレートを室温(RT)で乾燥させます。プレートを30°Cで一晩成長させます。
    3. 3〜4日ごとに、新たに播種したNGMプレートに 大腸菌をチャンクすることにより、線虫の個体数を維持します。20°Cで保存してください。 チャンキングは、ランダムな線虫の集団を新たに播種したプレートに素早く移すために使用される技術であり、これにより個体群の増殖が可能になります。これを行うには、滅菌ヘラを使用して、NGM寒天プレートから小さな正方形(1 x 1インチ)を切り取ります。正方形を新しい播種したNGMプレートに慎重に移し、線虫が下を向く側を新しい寒天8に向けます。
      注:20°Cに維持された C.エレガンスは 、~48時間後に子孫を産むため、線虫の集団を同期する際に考慮すると便利です。25°Cで維持された C.エレガンスは 、より早く成長し、繁殖し、15°Cで維持された個体群は成長が遅くなります。
  4. 線虫の個体群の同期
    1. まず、NGM/OP50で維持されている既存の線虫集団から始めます。
    2. ~3 mLのM9バッファーを線虫を含むNGMプレートにピペットで移します。線虫の卵を皿から洗い流し、ピペットの先端をそっと使って寒天から卵をこすり落とします(くっつく傾向があります)。P1000ピペットを使用して、卵と虫の両方を含む液体を15 mLのコニカルチューブに移します。プレートに残っている卵の数を評価するには、解剖顕微鏡を使用して寒天を観察します。
    3. 279 x gおよびRTで2分間円錐形に遠心分離します。
    4. 線虫ペレットを乱さないように注意しながら、上清を取り除きます。
    5. 3mLの25%漂白剤溶液(取り扱い時には「注意」)を追加します。
    6. チューブを2分間反転させます。解剖顕微鏡を使用して線虫が死んでいることを確認してください-それらはまっすぐで動かなくなります。
      注:これは既存の線虫のみを殺します。卵の完全性は影響を受けません。
    7. 279 x gおよびRTで2分間遠心分離します。
    8. 上清を取り除き、ペレットを3mLのM9に再懸濁します。
    9. 279 x gおよびRTで2分間遠心分離します。
    10. 上清を取り除き、ペレットを300μLのM9に再懸濁します。
    11. 解剖顕微鏡を使用して、5 μLの卵を小さなペトリプレートにピペッティングして卵の濃度を確認します。理想的な濃度は20〜100個の卵の間であるべきです。培養物が希薄すぎる場合は、遠心分離して余分な液体を除去して溶液を濃縮します。培養物が濃縮されすぎる場合は、目的の濃度に達するまでM9を追加します。
  5. 線虫感染(播種)のために C.アルビカンス と 大腸菌 の培養物を準備します。
    1. ブランク溶液を準備します。キュベットに、900 μLのddH2Oと100 μLの液体YPDを組み合わせます。
    2. キュベットを分光光度計に挿入します。上矢印を使用して波長を600ナノメートルに設定します。「0 ABS 100%T」ボタンをクリックして、ブランク溶液を設定します。
    3. 新しいキュベットに、900 μL の ddH2O と 100 μL の一晩酵母培養液を組み合わせます。分光光度計からブランク溶液を取り出し、酵母溶液を含むキュベットを追加します。画面に表示されている光学濃度を記録します(ボタンを押さないでください)。読み取り値に10を掛けます(測定された酵母溶液は10分の1の希釈でした)。
    4. 1.5 mLの微量遠心チューブでddH2Oを使用して、培養を3.0 OD600/mLに標準化します。1 OD600 は、約 3 x 10-7 CFU/mL21 です。
      注:OD600 の読み取り値が6.7、3 OD / 6.7 OD = 0.447 mLの場合、447 μLの C.アルビカンス 培養物を微量遠心チューブに加えます。最高速度(16、873 x g)で30秒間遠心分離します。上清を取り除き、1 mLのddH2Oに再懸濁します。
    5. 大腸菌培養物を50mLのコニカルチューブに移します。
    6. 培養物を279 x gでRTで2分間遠心分離します。
    7. 上清の大部分を吸引し、~1 mLを残します。
    8. ペレットを残りの上清に再懸濁し、事前に秤量した1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
    9. 微量遠心チューブを最大速度で30秒間スピンダウンします。
    10. p1000ピペットを使用して、上清を取り除き、最終的なペレットを秤量します。
    11. 大腸菌をddH2Oで200 mg / mLに希釈します。
    12. マスターミックス計算(表2)を使用し、適切にスケーリングします。

2. 繁殖力アッセイ

注: 補足表1 に示す代表的なデータと、 図1Aに示す概略図を示します。

  1. 35 mm x 10 mmのペトリプレート、0.2 g/Lのストレプトマイシン硫酸塩を添加したNGM、大腸菌 OP50培養、LBおよびC.アルビカンス 培養、YPD、ワイヤーピック、M9緩衝液(3.0 g/L KH2PO4、6.0 g/L Na2HPO4、0.5 g/L NaCl、1.0 g/L NH4Cl)、 15mLのコニカルチューブ。
    実験の2日前
  2. C. albicans株を2 mLのYPDに、大腸菌(OP50)を50 mLのLBに接種し、30°Cで一晩増殖させます。
  3. 0.2 g/L のストレプトマイシン硫酸塩を添加した NGM を含む 35 mm x 10 mm のペトリプレートを準備します。準備されたプレートの数は、実験全体に耐える必要があります。推奨される反復回数は、処理ごとに 10 回です。10回の反復の場合、70枚のプレートが使用されます。NGM1Lで~250枚のプレートが作れます。
    実験の1日前
  4. 35 mm x 10 mm NGM 寒天プレートにストレプトマイシンを添加した 0 日目、2 日目、3 日目の 0 日目、2 日目、3 日目の播種プロトコルに従って、マスターミックス濃度で播種します (表 2)。プレートの中央に適量のマスターミックスをピペットで移します。微生物の増殖の単一のスポットは宿主の摂食に十分であり、種子の外側の宿主を簡単に特定できるため、培養物を広げる必要はありません。プレートをRTで一晩インキュベートします。
    注:Day 0 マスターミックスには、各実験的処理の反復ごとに 50 μL の「シード」が含まれています。2日目から7日目には、各実験的治療の反復ごとに10μLの「シード」が含まれます。線虫は0日目プレートに同期されてから48時間後にL4ステージに到達するため、1日目プレートはありません。それらがL4に到達すると、個々の線虫は2日目のプレートに移されます。
1回のレプリケートの場合大腸菌(OP50)制御条件C.アルビカンs&大腸菌(OP50)の治療状態
OP50H2O(ヘリウム2O)トータルOP50C.アルビカンスH2O(ヘリウム2O)トータル
0日目6.25 UL43.75 UL50 UL6.25 UL1.25 UL42.5 UL50 UL
2-7日目1.25 UL8.75 UL10 UL1.25 UL.25 UL8.5 ul10 UL

表2: 繁殖力アッセイのために線虫に感染するために必要な大腸菌およびC.アルビカンスの培養物のマスターミックス量。

実験日(0日目)

  1. 線虫とプレート~50個の卵を、コントロールプレート(OP50のみ)と処理プレート(C.アルビカンス + OP50)の各Day 0複製に同期させます。20°Cで48時間インキュベートします。
    2日目
  2. Day 0プレートから8 個をピッキングして、1匹のL4センチュウを複製したDay 2播種プレートのそれぞれに移します。L4宿主は、その体の背側22の中央にある小さなポケットによって識別することができる。同じタイプの播種プレートから孵化および成熟した線虫を移す(すなわち、D0コントロールプレートからのL4線虫は、2日目のコントロールプレートに移す必要がある)。
  3. 2 mLのYPDおよび大腸菌(OP50株)に必要なC.albicans培養物を50 mLのLBに接種します。
    3日目
  4. 2日目のプレートから3日目の播種プレートに線虫を移し、各複製を追跡します(すなわち、2日目の複製Aを3日目の複製Aプレートに移動する必要があります)。
  5. 2日目(卵のみを含む)と3日目(単一の成体を含む)プレートを20°Cで24時間インキュベートします。
  6. 35 mm x 10 mm NGM にストレプトマイシンプレートを添加した 4 日目および 5 日目に、1 プレートあたり 10 μL のマスターミックスを使用して播種し(表 2)、プレートを RT で 24 時間インキュベートします。
    4日目
  7. 線虫を3日目のプレートから4日目の播種プレートに移します。
  8. 3日目と4日目のプレートを20°Cで24時間インキュベートします。
  9. 解剖スコープを使用して、各Day 2プレートの生存可能な子孫を数えます。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、2日目のプレートを捨てます。
    注:打ち切りとは、プレート上で消える線虫を指します。これは、線虫がプレートから這い出したときに発生する可能性があります。24時間のウィンドウではあまり一般的ではありませんが、死んだ線虫の死骸は寒天に崩壊し、検閲にもつながります。打ち切りデータは、最終子孫および生存データ分析に含まれません。
  10. 2 mLのYPDに C.albicans 株を、50 mLのLBに大 腸菌 (OP50)を接種します。
    5日目
  11. 線虫を4日目のプレートから5日目の播種プレートに移します。
  12. 4日目と5日目のプレートを20°Cで24時間インキュベートします。
  13. 各Day 3プレートの生存可能な子孫を数えます。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、3日目のプレートを捨てます。
  14. 1プレートあたり10 μLのマスターミックスを使用して、6日目および7日目にストレプトマイシンプレートを添加した35 mm x 10 mmのNGMをシードし(表2)、プレートを室温で24時間インキュベートします。
    6日目
  15. 線虫を5日目のプレートから6日目の播種プレートに移します。
  16. 5日目と6日目のプレートを20°Cで24時間インキュベートします。
  17. 各Day 4プレートの生存可能な子孫を数えます。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、4日目のプレートを捨てます。
    7日目
  18. 線虫を6日目のプレートから7日目の播種プレートに移します。
  19. 6日目と7日目のプレートを20°Cで24時間インキュベートします。
  20. 各Day 5プレートの生存可能な子孫を数えます。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、5日目のプレートを捨てます。
    8日目
  21. 各Day 6プレートの生存可能な子孫を数えます。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、6日目のプレートを捨てます。
    9日目
  22. 各 Day 7 プレートの生存可能な子孫を数えます。最大の線虫(親)を数えないでください。死んだ、またはプレート上になくなった(打ち切り)複製に注意してください。子孫の数が記録されたら、7日目のプレートを捨てます。
    注:このアッセイは、生存率の評価にも使用できます。各線虫がいつ死んだかを記録します。実験の最後に、7日間の実験で生き残った線虫の割合を各処理で比較することができる。線虫は時々食物/病原体の発生源から這い離れて、ペトリプレートのスライドを登ろうとします。先に進む前に、プレートのすべての領域を確認してください。死んだ線虫は一般的に死骸を残します。位置を特定できない線虫を検閲し、その線虫を死んだものとしてカウントしないでください。子孫と生存の最終分析に打ち切りデータを含めないでください。
  23. データセットの正規性に応じて、一元配置ANOVAまたはKruskal-Wallisのいずれかを使用して、雛のサイズと晩雛の繁殖のデータを分析し、GraphPad Prismソフトウェアを使用して治療グループ間の有意差を特定するための事後的なTukey/Dunnの多重検定を行います。Wilcoxon log-rank 検定を使用して生存曲線間の差を検出します。

3. リネージュ拡張アッセイ

注: 代表的なデータを補足表2 に、図 2Aに概略図を示します。

  1. 以下を入手または調製します:0.2 g / Lのストレプトマイシン硫酸塩、 大腸菌 OP50培養物、LB、C.アルビカンス 培養物、YPD、M9バッファー、ワイヤーピック、15 mLコニカルチューブを添加したNGM寒天を含む100 mm x 15 mmペトリプレート。
    -2日目
  2. C. albicans株を2 mLのYPDに、大腸菌(OP50)を50 mLのLBに接種し、30°Cで一晩増殖させます。
    -1日目
  3. 100 mm x 15 mm NGM 寒天培地プレートにストレプトマイシンを添加し、プレートあたり 300 μL のマスターミックスを添加します(表 3)。滅菌金属スプレッダーを使用して、マスターミックスをプレートに広げます。プレートを30°Cで一晩インキュベートします。 治療ごとに6回の繰り返しが推奨されます。したがって、1回の治療につき7枚のプレート(同期線虫用に1枚のプレート、成虫各成虫に6枚のプレート)を調製する。
大腸菌(OP50)制御条件C. albicansおよびE. coli(OP50)。治療条件
1回のレプリケートの場合OP50H2O(ヘリウム2O)トータルOP50C.アルビカンスH2O(ヘリウム2O)トータル
1.25 UL8.75 UL10 UL37.5 UL7.5 UL255 UL300 UL

表3: 系統拡大アッセイのために線虫に感染するために必要な大腸菌およびC.アルビカンスの培養物のマスターミックス量。

線虫の個体数増加:0日目

  1. 線虫を同期させ、コントロール(OP50のみ)および処理(C.アルビカンス + OP50)ごとに1枚のプレートに10〜25個の卵をプレートし、20°Cで48時間インキュベートします。
    2日目:
  2. 各コントロールおよび処理の Day 0 プレートから 1 つの L4 ワームを、同じ処理のシード プレートに移します。L4宿主は、その体の背側22の中央にある小さなポケットによって識別することができる。
  3. 20°Cで5日間インキュベートします(同期後合計1週間)。
    7日目:
  4. p1000ピペットを使用して、5 mLのM9バッファーを使用して各プレートから線虫の全個体群を洗浄し、15 mLのコニカルチューブに移します。
  5. 4°Cで1時間保存し、線虫が落ち着いてカウントしやすくします。
  6. 各円錐形を最終容量10 mLまでM9バッファーで希釈します。
  7. 生物学的複製ごとに、20 μLアリコート中の線虫の数を数えます。これを繰り返して、生物学的複製ごとに 6 回のテクニカル複製を取得します。逆計算して、合計人口サイズを決定します。サンプルが希薄すぎる場合(すなわち、サンプル当たりの線虫が10個未満の場合)、少量のM9バッファーに集団を濃縮する。
    注:生きた線虫の遠心分離は、線虫に害を及ぼしません。
    計算例:
    70 ホスト = X (ホスト合計)
    20μL(分量) 10,000μL(総容量)
  8. データセットの正規性に応じて、一元配置ANOVAまたはKruskal-Wallisのいずれかを使用して系統拡大のデータを分析し、GraphPad Prismソフトウェアを使用して治療グループ間の有意差を特定するための事後的なTukey/Dunnの多重検定を行います。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、C.エレガンスを感染モデルとして使用して、C.アルビカンスの病原性を非致死的な表現型として測定する2つのアッセイを紹介します。 最初のアッセイである繁殖力は、C. albicansの感染が子孫の生産と生存のために単一の宿主にどのように影響するかをモニターします。2つ目のアッセイである系統拡大は、C.アルビカンスの感染が複数世代にわたる個体数の増加にどのように影響するかを測定するものです。

繁殖力アッセイには、 C. albicans 感染中の宿主適応度の複数の測定値があります。 C. albicans の感染が宿主の適応度、生存率、繁殖の2つの異なる尺度にどのように影響するかを評価するために、個々の宿主を監視する繁殖力アッセイ19を開発しました。簡単に説明すると、単一の宿主をコントロールプレート(未感染)または C.アルビカンス...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、真菌の病原性を測定する2つの簡単なアッセイを紹介します。どちらのアッセイも、C .エレガンス を宿主システムとして活用し、致死的および非致死的な宿主表現型の両方のモニタリングを含みます。例えば、繁殖力アッセイでは、個々の感染した宿主の繁殖成功を調査しながら、個々の生存率も測定します。毎日のモニタリングでは、総雛のサイズだけでなく、繁殖のタイミングや死亡時刻も把握できます。系統拡大アッセイは、繁殖力アッセイの簡易版として開発されました。これは、宿主の移動と毎日のカウントが少なくて済むため、煩雑さが軽減されます。系統拡大アッセイは、宿主の適応度の複数の側面を組み合わせた多世代にわたる定量的な尺度を提供します。これらのアッセイを組み合わせることで、変異株や多様な臨床分離株を含む C.アルビカンス 株の病原性を迅速にスクリーニングする強力な方法となります。さらに、宿主が病原体を食物源として飼育する感染アッセイの容易さを考えると、これにより、他の微生物病原体に適用してその病原性を評価することが容易になります。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らには、開示すべき競合する利害関係はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorian Feistel氏、Rema Elmostafa氏、McKenna Penley氏には、アッセイとデータ収集の開発にご協力いただき、誠意を表します。この研究は、NSF DEB-1943415 (MAH) の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL エッペンドルフ マイクロチューブ 3810Xミリポア シグマZ606340
100 mm x 15 mm ペトリプレートシグマ-アルドリッチP5856-500EA
15 mL ファルコン コニカルズフィッシャー・サイエンティフィック14-959-70C
50 mL ファルコン コニカルズフィッシャー・サイエンティフィ14-432-22
アデニン・ミリポア シグマA8626
寒天(粒状、細菌学グレード)Apex BioResearchは、20-248
アルミニウムワイヤー(95%Pt、32ゲージ)Genesee Scientific59-1M32P
塩化アンモニウムミリポアシグマ254134
細菌細胞スプレッダーSPサイエンスウェア21TP50
クトペプトンフィッシャーBioReagantsBP1420-500
ディスポーザブル培養チューブ (20 x 150 mm)FIsherブランド14-961-33
解剖顕微鏡 (NI-150 高輝度イルミネーター)ニコンインスツルメント株式会社
大腸菌Caenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
ミディアム ペトリ皿 (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal SpatulaSP Scienceware8TL24
線虫増殖培地 (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
カリウムリン酸塩モノベーシックシグマP0662-500G
塩化ナトリウムッシャーサイエンティフィックBP358-1
ナトリウムッシャーサイエンティフィBP332-500
レプトマイシン硫酸塩サーモフィッシャーサイエンティフィ11860038
トリプトンミリポアシグマ91079-40-2
ウリジンミリポアシグマU3750
野生型 C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
酵母エキスミリポア Sigma8013-01-2
ック を生成しますバフィリン酸フィックストック

参考文献

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