Method Article

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

DOI:

10.3791/62175

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August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

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この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。

Abstract

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細胞は様々なDNA損傷剤に継続的に曝され、異なる細胞応答を誘導する。生化学的および遺伝的アプローチを適用することは、DNA損傷部位におけるDNA修復複合体の募集および組み立てに関連する細胞事象を明らかにする上で不可欠である。ここ数年、部位特異的なDNA損傷を誘発するための強力なツールが開発されました。さらに、新しい精液技術により、固定細胞と生細胞の両方を用いて、単一細胞分解能レベルでこれらのプロセスを研究することができます。これらの技術は様々な生物学的プロセスの研究に使用されてきたが、本明細書では、エンドヌクレアーゼベースのサイト特異的DNA損傷と組み合わせて、DNA修復の分野で最も広く使用されているプロトコルを提示し、指示された方法でDNA修復因子のゲノム占有率を視覚化し、定量化することを可能にする それぞれ。これらの技術は、損傷したゲノム遺伝子座に結合した新しいタンパク質を同定するための強力なツールと、DNA修復中の微調整調節に必要な翻訳後の改変を同定するための強力なツールを提供する。

Introduction

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私たちのゲノムは、様々なDNA損傷剤によって絶えず挑戦されています。これらの攻撃は、紫外線や照射などの環境源、ならびに酸化ストレスまたは複製エラーによって引き起こされる代謝副産物などの内因性源から派生することができる1,2。これらの病変は、一方または両方のDNA鎖の完全性に影響を及ぼし、かつ、発生したエラーが持続する場合、転座やゲノム不安定性を頻繁に引き起こし、腫瘍形成3、4を生じる可能性がある。ゲノムの完全性を維持するために、進化の間に複数の修復システムが開発されました。特定の種類のDNA損傷の化学的および物理的特性に従って、複数の修復メカニズムを活性化することができる。不一致は、基本的な部位、一本鎖の破断、及び8-オキソグアニン(8-oxoG)は、ミスマッチ修復または塩基切除修復経路5,6によって除去することができる。UV誘導光産物および嵩高い付加物によって引き起こされる病変は、ヌクレオチド切除修復(NER)またはDNA二本鎖破断修復(DSBR)プロセス7、8によ....

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Protocol

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1. 特定タンパク質の免疫検出

  1. 細胞培養の調製と実験のセットアップ
    1. 10%の胎児の子牛血清、2 mMグルタミンおよび1%の抗生物質抗抗薬溶液を添加したDMEM培地中の単層のU2OS細胞を維持する。
      注: エンドヌクレアーゼベースのDNA損傷誘導の場合は、システムの漏れを避けるために、炭処理またはステロイドフリーの媒体を使用してください。
    2. 加湿した5%CO2 環境で、37°Cで80%の合流まで成長させ、2〜3日ごとに培地を再生します。
    3. 培地を吸引し、1x PBSで細胞を洗浄します。トリプシン-EDTA溶液で細胞を取り外します。細胞が剥離すると、細胞に培地を添加してトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を生じる。
    4. 細胞計数チャンバーを使用してセルをカウントします。24ウェルプレートに2 x 10個の4 セル/mL/wellをプレートし、各ウェルに無菌12mmの丸いカバーリップを付けます。
    5. 加湿した5%CO2雰囲気中の37°Cで24時間細胞をインキュベートし、カバーリップに付着させます。
    6. 細胞を10ng/mLのネオカルジノスタチン(NCS)で、有害物質を培養培地に直接ピペット化して治療する。NCS含有培地で細胞を15分間インキュベートし、1x PBSで洗浄し、新鮮な補充された培養培地を細胞....

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Results

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細胞内の部位に誘導されたDSBによる修復プロセスの研究は、安定または一時的なトランスフェクションを介して達成することができる。しかし、安定したトランスフェクションは均質な細胞集団を保証し、統一され、より信頼性の高い細胞応答を与える。一過性トランスフェクションの場合、細胞集団のごく一部のみがプラスミドを占め、実験に多様性を導入します。ER-I-PpoIまたはER-AsiSIエンドヌクレアーゼベースの細胞系を確立するには、50%のコンフルエント細胞集団が必要であり、これはエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドでより効果的にトランスフェクトされる。トランスフェクションの場合、市販のトランスフェクション試薬またはウイルス感染ベースの方法も使用できる。顕微鏡可視化技術を適用し、過渡的トランスフェクションが必要な場合、トランスフェクション後24時間に4-OHT添加によって指示されたDSBを誘導することができ、ER融合型エンドヌクレアーゼに結合し、核転位およびDSB誘導を可能にする。最も適切な時点を決定するために、4-OHT治療後の異なる時点でγH2AXの免疫蛍光ベースの顕微鏡およびウェスタンブロット検出を行うことができる。生理学的条件下では、細胞.......

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Discussion

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DNA修復は比較的最近の研究分野ですが、様々な生化学的・顕微鏡的手法を用いて、私たちの知見は急速に広がっています。遺伝子の修復過程に関与する遺伝子に起こる変異は、腫瘍形成の主要な原因の一つであり、したがってDNA修復経路の重要なステップを解明することが不可欠であるため、遺伝情報の保存は細胞にとって極めて重要である。

生化学的手法(すなわち、ウェスタンブロット、免疫沈降、質量分析など)は、多数の細胞を必要とし、研究された修復プロセスは所望の細胞集団のスナップショットを表す。ChIP実験を行うことは、DSB修復のプロセスを研究するために特定の実験を設計する際に、面倒で面倒で多くの考慮事項を考慮する必要があります。次の手順は、例を示します: (I) セルは適切に lysed する必要があります。クロマチン分画(II)クロマチンへのアクセス性を高めるために、細胞溶解と核溶解バッファを別々に使用して2段階溶解法を適用することを強くお勧めします。超音波処理の適切な条件は、各細胞タイプに最適化する必要があります (III) 精製された抗体の適切な量は、異なる企業からの同じタンパク質に対する抗体が.......

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Acknowledgements

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この研究は、国立研究開発・イノベーション事務所の助成金GINOP-2.3.2-15-00020、GINOP-2.3.2-15-2016-00036、GINOP-2.2.1-15-2017-00052によって資金提供されました。 EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009,NKFI-FK 132080,ハンガリー科学アカデミーBO/27/20,ÚNKP-20-5-SZTE-265,EMBO短期フェローシップ8513,テンタス財団

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), StabilizedSigma AldrichA5955
Anti-γ H2A.X(リン酸化S139)抗体アブカムab26350
ウシ血清画分VアルブミンBioseraPM-T1725
TrackIt™シアン/イエローローディングバッファーサーモフィッシャーサイエンティフィック10482035
DMEM 1.0 g/L グルコース、L-グルタミンなしロンザ12-707F
ドキシサイクリンシグマ アルドリッチD9891
Dynabeads&;M-280 ヒツジ抗マウス IgGInvitrogen11202D
Dynabeads >M-280 ヒツジ 抗ウサギ IgGInvitrogen11204D
EDTA SigmaAldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
エタノールモルケミカル02910-101-340
ウシ胎児血清(南米原産)、EU承認GibcoECS0180L
酸を含まないホルムアルデヒド 37% 溶液シグマアルドリッチ1.03999
GlutaMAX™サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック35050038
グリシンSigma アルドリッチ50046
IPure キット v2ジアゲノードC03010015
イソアミルアルコールシグマ アルドリッチW205702
LiClシグマ アルドリッチL9650
NaClシグマ アルドリッチS5886
Na-DOCシグマ アルドリッチD6750
NaHCO3シグマ アルドリッチS5761
ストレプトマイセス・カルジノスタチンからのネオカルジノスタチンシグマ・アルドリッチN9162
NP-40 シグマ・アルドリッチI8896
PBS 粉末 Ca2+、Mg2+なしシグマ・アルドリッチL182-50-BC
フェノール・シグマ・アルドリッチP4557
パイプグマAldrichP1851
ポリソルベート20(Tween 20)モルケミカル09400-203-190
KClシグマAldrichP5405
ProLong™DAPI付き金退色防止剤サーモフィッシャーサイエンティフィックP36935
プロテアーゼ阻害剤カクテルセット Iロシュ11873580001
プロテイナーゼKシグマ アルドリッチP2308
P-S2056 DNAPKcs 抗体アブカムab18192
RNase Aロシュ10109169001
CH3COONaシグマ アルドリッチS2889
SDSシグマ アルドリッチL3771
トリス アセテート-EDTAバッファーシグマ アルドリッチT6025
トリス-HClシグマ アルドリッチ91228
トリトン X-100モルケミカルズ09370-006-340
ブタ膵臓からのトリプシンシグマ アルドリッチT4799
トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッド不使用Gibco15400054
ズ シズ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

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