カルシウム蛍光色素標識とナノ粒子追跡解析を用いたヒトの尿中ナノ結晶の推定

サマリー

本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)が健康な成人からのナノ結晶を含む尿中カルシウムを検出し、定量化できるかどうかを決定することであった。現在の研究結果は、NTAが腎臓結石疾患中の尿ナノ結晶を推定する潜在的なツールである可能性を示唆している。

要約

腎臓結石は、大人と子供の世界的に一般的になってきています。最も一般的なタイプの腎臓結石は、シュウ酸カルシウム(CaOx)結晶で構成されています。結晶尿は、尿がミネラル(例えば、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩)で過飽和になると発生し、腎臓結石形成の前に起こる。石のフォーマーの結晶を評価する標準的な方法には、顕微鏡、ろ過、遠心分離が含まれます。しかし、これらの方法は、主にナノ結晶ではなく微小結晶を検出する。ナノ結晶は、インビトロの微結晶よりも腎臓上皮細胞に有害であることが示唆されている。ここでは、ナノ粒子追跡解析(NTA)がヒトの尿中ナノ結晶を検出する能力について述べる。健康な成人は、尿中ナノ結晶を刺激するためにシュウ酸塩負荷を飲む前に、制御されたシュウ酸食を与えられた。尿はシュウ酸負荷の前後に24時間採取した。試料を処理し、エタノールで洗浄し、試料を精製した。尿中ナノ結晶をカルシウム結合蛍光色素で染色し、フルオ-4 AM.染色後、ナノ結晶のサイズと数はNTAを用いて決定した。この研究結果から、NTAは健康な成人のナノ結晶を効率的に検出できることを示している。これらの知見は、NTAが腎臓結石症患者におけるナノ結晶の貴重な早期発見方法である可能性を示唆している。

概要

尿結晶は、尿がミネラルで過飽和になると形成されます。これは健康な個体で起こり得るが、^腎臓結石1を有する個人でより一般的である。尿結晶の存在と蓄積は、腎臓結石を発症するリスクを高めることができます。具体的には、これは、結晶がランドールのプラークに結合し、核を持ち、蓄積し^{、時間2、3、4}の間に成長するときに起こる。結晶は、腎臓結石の形成と結晶の評価に先行して、腎臓結石形成体^3,5に予測値を有する可能性がある。具体的には、結晶が石^6,7を含むシュウ酸カルシウムの既往歴を有する患者において石の再発のリスクを予測するのに有用であることが示唆されている。

結晶は、腎上皮および循環免疫細胞機能^{8、9、10、11、12、13}に悪影響を及ぼすと報告<....

プロトコル

この研究で概説されたすべての実験は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)制度審査委員会によって承認されました。健康な成人(33.6±3.3歳;n=10)は、正常な血液包括代謝パネル、非タバコユーザー、非妊娠者、20〜30kg/m²のBMI、および慢性病状または急性疾患がない場合、研究に登録された。健康な参加者は、研究開始前に書面によるインフォームド・コンセント・フォームに署名しました。

1. 臨床プロトコルと尿の収集

1. 参加者は、尿を採取する前に、UAB臨床・トランスレーショナルサイエンスバイオニュートリションコアが調製した低シュウ酸塩食を3日間、一晩で速く摂取してから、尿を採取します(24時間サンプル)。
2. 翌日、参加者はシュウ酸塩の負荷(果物や野菜を含むスムージー、約8mMのシュウ酸塩)を消費する前に、24時間尿サンプル(シュウ酸塩前)を返してもらいます。参加者はその後、24時間尿を収集し(シュウ酸後サンプル)、翌日に尿を返します。
3. 以下に示すように、すべての尿サンプルを室温(RT)で処理する前に維持し 、図1に示す。

2. 尿処理

注: 使用される材料と機器はすべて、 一覧の一覧を参照してください

結果

この研究結果から、NTAはヒト尿中の尿中のナノ結晶を含むカルシウムの平均サイズと濃度を効率的に検出できることを示している。これは、フルオロフォア、フルオ4 AM、ナノ粒子追跡解析を用いて達成した。Fluo-4 AMはCaOxとCaPの両方の結晶に結合することができた。図3Aに示すように、CaOx結晶は50〜270nmの大きさであり、平均濃度は1.26 x 10^9粒子/mLであると判断した。CaP結晶は30〜225nmの大きさで、平均濃度は2.22 x 10⁹粒子/mLであった(図3B)。NTAがヒト尿中のナノ結晶を評価できるかどうかを判断するために、健康な成人は、制御されたシュウ酸塩食を消費し、続いて高いシュウ酸塩負荷を摂取するよう求められた。尿中ナノクリスタルの大きさと濃度を評価するために、負荷の前後に24時間の尿サンプルを採取した。プレシュウ酸尿サンプルには、110~300nmの間に尿ナノ結晶(1.65 x 10^8±3.29 x 10^{7粒子.......}

ディスカッション

NTAは、カルシウム結合プローブFluo-4 AMを用いてヒト尿中のナノ結晶を評価するために本研究で使用されている。尿中のナノ結晶を検出するための標準的な方法はありません。いくつかの研究グループは尿中のナノ結晶を検出し、サンプル^27、28を定量化する能力に制限されている広範なプロトコルまたは方法の使用に依存している。この研究は、高いシュウ酸負荷を摂取することから成る食事給餌研究に参加したヒトの尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出するための特定の敏感な方法を示す。シュウ酸塩の消費量は、シュウ酸塩の実世界消費(例えば、1/2ほうれん草サラダ)と同等であった。

NTA は、ブラウン運動を使用して溶液³⁰内の粒子を測定する、よく特徴付けられる高解像度ツールです。生物学的試料^31、32、33.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
卓上型遠心分離機	Jouan Centrifuge	CR3-12
シュウ酸カルシウム一水和物	前述の通り、研究室で合成29。		RTで保管します。ストック 10 mM
リン酸カルシウム結晶 (ヒドロキシアパタイトナノ粉末)	Sigma	677418	RTで保管;10 mM
エタノール	Fischer Scientific	AC615095000	RT の在庫;在庫 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	冷凍庫に保管 (-20°C;C);ストック5 mM
金ナノ粒子	シグマ	742031	2-8°Cで保存。C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
シリンジポンプ	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*蛍光色素は光に敏感です。ストックとアリコートは-20°Cの暗闇で保管する必要があります。