免疫蛍光染色を用いた結腸粘膜の微小上皮ギャップの評価と定量化

Summary

ここでは、炎症を起こした結腸粘膜のトランスセルラおよびパラセルパル透過性が増強される特定の場所を視覚化する新しい方法について説明します。このアッセイでは、リジン固定性デキストランに結合した10 kDaの蛍光色素を適用して、結腸粘膜の高透過性領域(HPR)を視覚化します。

Abstract

腸粘膜の内側を覆う上皮細胞は、管腔の内容物と間質を分離する物理的障壁を作り出します。上皮バリア障害は、炎症性腸疾患(IBD)などのさまざまな病状の発症と関連しています。炎症を起こした粘膜では、上皮単層を破損する表在性びらんまたは微小びらんが、高透過性の部位に対応します。微小侵食の形成には、細胞の脱落やアポトーシスなど、いくつかのメカニズムが関与しています。これらの微小侵食は、多くの場合、結腸にランダムに分布する微視的な上皮ギャップを表します。これらの上皮ギャップの視覚化と定量化は、腸上皮バリア機能を調査するための重要なツールとして浮上しています。ここでは、炎症を起こした結腸粘膜のトランスセルラおよびパラセルパル透過性が増強される特定の場所を視覚化する新しい方法について説明します。このアッセイでは、リジン固定性デキストランに結合した10 kDaの蛍光色素を適用して、結腸粘膜の高透過性領域(HPR)を視覚化します。細胞死マーカーの追加使用により、HPRは上皮の押し出し/脱落が起こるアポトーシス病巣を包含していることが明らかになりました。ここで説明するプロトコルは、腸内の微小侵食を視覚化および定量化するためのシンプルでありながら効果的なアプローチを提供し、腸の上皮バリアが損なわれる疾患モデルで非常に有用なツールです。

Introduction

胃腸粘膜(GI)は、細胞外環境と内部宿主環境を分離する物理的障壁を作り出し、栄養素、水、電解質の吸収に関与しています。腸の障壁は、糖タンパク質からなる粘液層、上皮細胞の単層、およびその下にある固有層が免疫であり、間質細胞が存在します。物理的バリアを形成する腸上皮細胞は、接着結合(AJ)、タイトジャンクション(TJ)、デスモソーム(DM)などの異なるタンパク質複合体によって結合されています。上皮バリア機能の障害は、腸の透過性を増大させ、有害物質や病原体が内腔から間質1に移動する^{ことを可能にします。}クローン病(CD)などの炎症性腸疾患(IBD)、潰瘍性大腸炎(UC)、不確定性大腸炎(IC)など、上皮バリアが損なわれる疾患が増えています。IBDの罹患率は世界中で増加しており、欧米では0.5%に迫っています。IBDの原因は不明であるが、腸壁で引き起こされる過剰な免疫/炎症反応は、腸管上皮の恒常性の維持を制限することにより、上皮バリアの破壊に直接寄与する^2,3,4。さらに、結腸性炎症が長期にわたる患者は、結腸直腸がん(CRC)を発症するリスクが高くなります⁵。腸上皮バリアの乱れに関連する他の病状は、過敏性腸症候群、肥満、セリアック病、非セリアック性グルテン過敏症、および食物アレルギーです⁶。これらの理由から、ヒトで発生する病因を模倣した動物モデルにおける腸管上皮バリアの完全性の解析を可能にする実験的アプローチの開発が急務となっています。

ここでは、胃腸の受動的傍細胞と、結腸上皮の炎症過程に関連する経細胞透過性を簡単な手法で評価しました。高分子の経壁流を調べるために、結腸嚢におけるFITC-デキストラン(4 kDa)とRITC-デキストラン(10 kDa)の生体 内受動的拡散を測定しました。さらに、蛍光10kDaのリジン固定性デキストランを腸嚢の内腔に注入することで、炎症を起こした粘膜の透過性の高い領域を特異的に特定しました。アポトーシスマーカーとAJタンパク質に対する抗体を使用することで、炎症を起こした粘膜の高透過性領域が、上皮細胞がアポトーシスを起こし、細胞間結合が破壊される特定の領域に対応することを実証することができました。この新しい手法は、腸上皮バリアが損なわれている任意のモデルで上皮の完全性を評価するために使用できます。

Protocol

すべての手続きは、CINVESTAV実験動物のケアと使用のための機関委員会(CICUAL)によって審査され、承認されました。

1. 材料・試薬の調製

1. ハルトマン溶液(130 mM NaCl、28 mM乳酸、4 mM KCl、1.5 mM CaCl₂)を37°Cまで温め、95% O₂/5% CO₂でバブリングします。溶液の生理学的pH(7.4)を維持します。
2. 受動的傍細胞透過性を分析するには、1 mg/mL の FITC-デキストラン(4 kDa)と 1 mg/mL の RITC-デキストラン(10 kDa)を予熱したハルトマン溶液に溶解して、作業溶液を調製します。
3. Alexa Fluor647 Fixable-Dextraan(10 kDa)の4 μg/mL溶液をHartmann溶液に調製します。作業溶液は15mLのコニカルチューブに保管し、使用するまで光から保護してください。
   注:結腸あたり300μLの作業溶液が必要になります。
4. 大腸ごとに5cm切片を2つ切開して外科用縫合糸を準備します。縫合糸を閉じていない結び目にループします。

2. 消化管トラックの解剖と準備

1. マウスを安楽死させる前に、固形食品を6時間控えてください。広告の自由な飲料水を提供します。
   注:可能であれば、マウスを栄養ジェルサプリメント(精製水、糖蜜、カボチャ、コーンシロップ、ヒマワリの種、小麦タンパク質、植物油、食品酸、親水コロイド、電解質、トウモロコシ繊維、NIH-31Mミネラルミックス、NIH-31Mビタミンミックス)に置きます。
2. マウスを_CO2 チャンバーで安楽死させ、その後、制度倫理プロトコルに従って子宮頸部脱臼を行います。
3. 腹部と胸部を70%エタノールで滅菌します。
4. はさみを使用して、腹部の中央に切開を行い、腹腔を露出させます。
5. オリエンテーションの目的で、盲腸の直前と肛門縁の直前にある小腸の端(回腸の端部分)を切開することにより、大腸を分離して解剖します。外科用鉗子を使用して腸間膜を穏やかに除去し、結腸をハルトマン溶液に入れます。
6. 重要なことは、動物間の一貫性を維持するために、類似のセクションを特定し、透過性を評価するために使用することです。盲腸に近い領域を使用することを強くお勧めします。
7. 鈍いプラスチックカニューレを備えたインスリン注射器を使用して、結腸に存在する管腔の内容物を穏やかに洗い流します。便がしっかりしている場合は、鈍い鉗子を使って慎重に押します。糞便を取り除いた後、400μLのハルトマン溶液で3回洗浄します。
8. 近位領域(盲腸に最も近い領域)を結び、結腸の遠位領域に事前に結ばれた縫合ループを配置します。鈍いプラスチック製カニューレを装備したシリンジの助けを借りて、腸嚢に欲求プローブを含む溶液を充填します。プラスチック製のカニューレを慎重に取り外し、遠位部でループを結びます。
9. 腸嚢を6 mLのハルトマン溶液を入れた15 mLの円錐形チューブに入れ、1時間インキュベートしてFITC/RITC-Dextranの受動パラセルフローを評価するか、30分間インキュベートしてAlexa Fluor Fixable-Dextranのフローを分析します。
   1. 腸嚢を含む円錐管を5%_CO2 で37°Cに維持し、光から保護します。
10. FITC/RITC-Dextranを用いて受動透磁率を測定する。0分と60分で、コニカルチューブから100 μLのサンプルを採取し、96ウェルプレートに移します。100 μLの新鮮なメディアを再度追加して、失われたボリュームを置き換えます。
11. 蛍光プレートリーダーでFITCおよびFITCのサンプルおよび標準試料を測定(FITC励起/発光:495 nm/519 nm;RITC励起/発光:570/595 nm)。
12. Alexa Fluor 647 Fixable-Dextranを使用して受動透過性を測定するには、腸を切除し、手術用結節の近くで切断し、腸を切断して内腔を露出させ、プローブで溶液を除去します。腸の内腔を冷たいハルトマン溶液で2回洗います。
13. ティッシュを、あらかじめ最適切断温度コンパウンド(O.C.T.)を充填したティッシュモールドに入れます。切片化する側に応じて、組織を垂直または水平に向けます。サンプルは-80°Cで保存します。

3. 免疫蛍光染色

1. 20 μm の凍結切片を 3.7% パラホルムアルデヒド (PFA) で室温で 20 分間固定した後、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 37 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂ PO₄) で 3 回洗浄します。
   注:洗浄が非常に強い場合、腸からの垂直部分が剥がれる傾向があります。
2. 0.2% TX-100/PBSを室温で12分間透過処理した後、冷たくしたPBSで3回洗浄してください。
3. 0.2% BSA/PBSで室温で1時間ブロックします。
4. 一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、室温で1時間インキュベートします。冷たいPBSで3回洗います。
5. ブロッキング溶液中の二次抗体と1時間インキュベートします。冷たいPBSで3回洗います。
6. 切り込み部分に封入剤を塗布し、カバースリップでシールします。スライドは-20°Cで最大3ヶ月間保存できます。

Results

炎症を起こした粘膜では、表在性びらんまたは微小侵食が上皮細胞単層の完全性を損ない、高透過性の部位を表しています^7,8。このような可能性を評価するために、デキストラン硫酸ナトリウム大腸炎マウスモデルにおいて、炎症を起こした結腸粘膜の受動透過性を分析しました。簡単に言うと、C57BL/6Jマウスは、飲料水に溶解した2.5%DSS(w / v、40-50 kDa)を5日間投与されました。このモデルは、大腸で上皮細胞の損傷と上皮バリア機能障害を誘発することを特徴とし、これにより管腔抗原が固有層に侵入することを可能にします。このような過程は、免疫系の刺激をもたらし、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの分泌をもたらし、それが上皮損傷をさらに増強する⁹。図1Aに示すように、DSSにばく露されたマウスは、5日間の治療後に~12%の体重減少を示しました。糞便血と下痢もすべてのDSS治療マウスで検出されました。さらに、大腸炎マウス...

Discussion

細胞増殖と上皮アポトーシスのバランスをとることによる上皮恒常性は、適切で機能的な腸管バリアを維持します。IBDなどの多くの臨床障害は、腸の透過性の変化、粘膜の炎症、および上皮の恒常性の破壊を伴うか、または特徴付けられます¹。これらのプロセス間の相互作用については、まだ非常に議論の余地があります。そのため、これらの過程を適切に解明するための新たな研究アプローチの開発は、この分野の重要な課題となっています。炎症中の腸透過性を間接的に研究するために利用できるいくつかの公開プロトコルがあり、例えば、上皮単分子膜における経上皮電気抵抗の測定や、腸オルガノイド、マウス腸および腸嚢における疎水性蛍光色素標識プローブの定量化などである10,11,12,13.物質の取り込みが腸粘膜で増加...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
活性型カスパーゼ-3抗体 (1:1000)	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  anti rabbit (1:1000)	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 anti rat (1:1000)	Invitrogen	A21209
共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8x)	Leica		HyD検出器  および白色光レーザー
E-カドヘリン抗体 (1:750)	Sigma	MABT26	ラットモノクローナル Delma-1 抗体
エタノール 70%	ジェネリック
固定可能-デキストラン	Invitrogen	D22914	デキストラン, Alexa Fluor, 10,000 MW, アニオン性, 固定可能
FITC デキストラン	Sigma	46944	フルオレセイン イソチオシアネート–dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's Solution	PiSA	HT PiSA
インキュベーター (AutoFlow NU-8500)	Nuaire
マイクロプレートリーダー (Tecan Infinite 200 PRO)	Tecan
Nunc F96 MicroWell ブラック&ホワイトポリスチレンプレート	ThermoFisher Scientific
パラホルムアルデヒド	Sigma	P6148
ファロイジン (1:1000)	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC Dextran Sigma		R8881-100MG	ローダミン B イソチオシアネート-デキストラン M. Wt. 10 kDa
二次抗体 (1:10000)	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP標識二次抗体
縫合糸	ジェネリック		絹編みこみとポリエステル編組外科的縫合糸が好ましい。
ZO-1 (1:1000)	Invitrogen	40-2200	Rb 抗ZO-1