ここでは、患者末梢血単核細胞からヒト心筋細胞を強固に生成・拡張するプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
単一の血液引き分けから患者固有の心筋細胞を生成することは、心血管疾患の精密医療に大きな関心を集めています。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)からの心臓分化は、胚性心臓の発達に不可欠なシグナル伝達経路によって調節される。2次元および3次元プラットホーム上の多数の心臓分化方法は、様々な効率および心筋細胞収率と開発された。これらの方法の多様性は従うのが難しい可能性があり、これは現場外の調査官を困惑させた。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)からの患者特異的心筋細胞の堅牢な生成と拡大を詳述した包括的なプロトコルを提示する。まず、非集積センダイウイルスベクターを用いた患者の血液サンプルからの高効率iPSCリプログラミングプロトコルについて説明する。次に、ほとんどのヒトiPSCラインから打ち負かす心筋細胞を堅牢に生成できる、小分子媒介単層分化法を詳述する。さらに、スケーラブルな心筋細胞拡張プロトコルは、産業および臨床グレードのアプリケーションのために患者由来の心筋細胞を急速に拡大することができる低分子(CHIR99021)を使用して導入されています。最後に、これらのiPSC-CMの分子同定と電気生理学的特徴付けのための詳細なプロトコルが描かれています。このプロトコルは、心血管の発達と幹細胞生物学に関する限られた知識を持つ初心者にとって実用的なものになることを期待しています。
概要
ヒト人工多能性幹細胞の発見は、現代の心臓血管医学1,2に革命を起こしました。ヒトのiPSCは、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、心臓線維芽細胞を含む、心臓内のすべての細胞タイプを自己再生し、生成することができます。iPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)は、遺伝的に遺伝性心血管疾患(CVD)をモデル化し、新薬の心の安全性をテストするための無期限のリソースとして役立つことができる3。特に、iPSC-CMは、長いQT症候群4および拡張型心筋症(DCM)5のような心筋細胞の欠陥に由来するCVDの遺伝的および分子的病因を調査する準備が整っている。CRISPR/Cas9媒介ゲノム編集と組み合わせることで、患者iPSC-CMは先天性心不全(CHD)6、7、8を含むCVDの複雑な遺伝的基盤を理解するための前例のない道を開いた。ヒトiPSC-CMは、心臓発作9の間に損傷した心筋を補充するための自己細胞源として役立つ可能性を示している。近年、心臓再生および薬物検査....
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プロトコル
実験議定書とヒト被験者のインフォームド・コンセントは、全国小児病院の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
1. 細胞培養培地、溶液、試薬の製造
- PBMC メディアの準備
- 20 mLの基礎PBMC培養培地(1x)と0.52 mLのサプリメントを混ぜます。SCFとFLT3の20 μL(ストック濃度:100 μg/mL)、4 μLのIL3、IL6、EPO(ストック濃度:100 μg/mL)、L-グルタミン代替(100x)を200 μL加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用して無菌フードでフィルター。これを完全な血液メディアと名前を付けます。
- 20 mL の基礎 PBMC 培養培地 (1x) と 0.52 mL のサプリメントを混合します。L-グルタミン代替(100x)の200 μLを加えます。それらを徹底的に混ぜます。0.22μmのフィルター単位を使用してフィルター。これを補足血液培地とします。
- 完全なE8メディアを準備する
- E8基底メディア500mLとE8サプリメント10mL(4°Cで一晩解凍)を混ぜて完全なE8メディアを作ります。使用前に室温(RT)に平衡化します。
- iPSCパスジングメディアの準備
- 40 μLの Y-27632 ロックインヒビター (1:....
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結果
PBMCからのヒトiPSCリプログラミング
完全な血液培地を7日間用いて培養した後、PBMCsは可視核と細胞質(図1B)で大きくなり、ウイルストランスフェクションの準備ができていることを示す。センダイウイルスのリプログラミング因子によるトランスフェクションの後、PBMCはエピジェネティックなリプログラミングプロセスを1週間受ける。一般的に、1 x 10 5 PBMCのトランスフェクションから30〜50 個のiPSCコロニーを得て、リプログラミング効率は0.03%-0.05%です。完全に再プログラムされた細胞は、完全なE8メディアに導入されるとコロニーを付着し、形成を開始します(図1C)。これらの初期のiPSCコロニーはさらに7日間拡張され、その後機械的に切断され、個別に拾われます。各iPSCコロニーは、個々のiPSCラインを確立するために、6ウェルプレートの1つのウェルに転送されます。4-5の.......
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ディスカッション
iPSCリプログラミングの間、明確な核と細胞質で拡大されるまで1週間培養PBMCsに重要です。PBMCsは増殖しないため、iPSCのリプログラミングを成功させるためには、ウイルス導入に適切な細胞数が重要です。PBMCsの細胞数、感染の多重度(MOI)およびウイルスの価動体は、最適なトランスダクション結果に到達するために考慮され、調整されるべきである。心臓分化の場合、初期シード密度は、chiR99021 が投与された日に iPSC が 90% 以上のコンフルエントに到達するために重要です。一方で、心臓分化時にiPSCのコンフルエントが少ない場合、CHIR99021は毒性があり、実質的な細胞死につながります。一方、iPSCがコンフルエントを超えた場合、自発的な分化が起こって、指向性心臓分化の効率が損なわれます。初期のiPSC-CMの拡張については、タイミングと心筋細胞の品質を考慮する必要があります。初期のiPSC-CMは、心筋細胞の純度が十分に高い場合にのみ、強く増殖することができます。培養中の既存の非心筋細胞もCHIR99021治療に応答して増殖し、初期のiPSC-CMの増殖に悪影響を及ぼす可能性がある。さらに、分化の20日目までに心筋細.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
謝辞
この研究は、米国心臓協会(AHA)キャリア開発賞18CDA34110293(M-T.Z.)、追加ベンチャーズAVIFおよびSVRF賞(M-T.Z.)、国立衛生研究所(NIH NHLBI)が1R01HL1242245、1R01HL1225220およびR010.I096(D010.6)によって支援されました。明タオ・ジャオ博士は、全国小児病院のアビゲイル・ウェクスナー研究所のスタートアップ資金にも支えられてきました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 高速リアルタイム PCR システム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| Axon Axopatch 200B マイクロ電極アンプ | モレキュラーデバイス | マイクロ電極アンプ | |
| B27 サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17504044 | |
| B27 サプリメント マイナスインスリン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm固定・透過キット | BDバイオサイエンス | 554714 | 固定・透過処理液・パーマ/ウォッシュバッファー |
| BDバキュテイナーCPTチューブ | BDバイオサイエンス | 362753 | 血球分離チューブ |
| CHIR99021 | セレック・ケミカルズ | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A16517 | 仙台ウイルスリプログラミングキット |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | アクイジションボード | |
| ダイレクトゾール RNA Miniprep キット | Zymo Research | R2050 | RNA 抽出キット |
| DMEM/F12 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11330057 | |
| エッセンシャル 8 メディウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1517001 | iPSC 培養用 E8 培地 |
| GlutaMAX サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 35050061 | L-グルタミンの代替品 |
| 成長因子の減少 マトリゲル | コーニング | 356231 | 基底膜マトリックス |
| iScript cDNA Snythesis Kit | バイオ・ラッド | 1708891 | cDNA 合成 |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| ノックアウト血清補充 (KSR) | サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ | ック 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | 電気生理学データ収集・解析ソフトウェア | |
| 組換えヒト EPO | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PHC9631 | |
| 組換えヒト FLT3 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PHC9414 | |
| 組換えヒトIL3 | Peprotech | 200-03 | |
| 組換えヒトIL6 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| 組換えヒト SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11875093 | |
| RPMI 1640 培地、グルコースなし | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11879020 | |
| SlowFade Gold 退色防止 封入剤 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S36936 | 封入剤 |
| StemPro-34 SFM | サーモFisher Scientific | 10639011 | PBMC 培養培地 |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR マスターミックス |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | セレックケミカルズ | S1049 |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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再版と許可
