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方法論記事

ブタ誘導多能性幹細胞(piPSC)の神経前駆細胞(NPC)への分化

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DOI:

10.3791/62209

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2021年6月11日

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1Department of Surgery, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of São Paulo, 2Department of Veterinary Medicine, Faculty of Animal Sciences and Food Engineering, University of São Paulo, 3Department of Pharmacology, Institute of Biosciences, São Paulo State University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ブタ誘導多能性幹細胞(piPSC)に由来する神経前駆細胞の化学分化および培養の方法について説明しています。

要約

iPS細胞由来ニューロンは、主にげっ歯類などの前臨床研究で使用されるほとんどの動物モデルが所見を臨床に応用するための基準を満たせない場合に、精神疾患の神経新生および初期の表現型の変化を研究するための魅力的な in vitro モデルです。ヒト以外の霊長類、イヌ科動物、ブタ類は、主にヒトとの生理学的、遺伝的、解剖学的類似性から、生物医学研究や医薬品開発の目的に適したモデルと考えられています。ブタモデルは、トランスレーショナルニューロサイエンスに特に関心を集めており、安全性と同種移植の試験を可能にしています。ここでは、ブタiPS細胞の作製と、そのさらなる神経前駆細胞(NPC)への分化について説明します。生成された細胞は、RT-qPCRによって確認されたNPC マーカーNestin および GFAPを発現し、免疫蛍光法によりNestin、b-Tubulin III、およびVimentinに対して陽性でした。これらの結果は、大規模動物モデルからの化学阻害剤を用いた in vitro 誘導後のNPC様細胞の生成の証拠を示しており、これは再生およびトランスレーショナル医療研究の興味深く適切なモデルです。

概要

多くの研究者がヒトの神経疾患の細胞メカニズムと病理学的発達をよりよく理解しようとしていますが、磁気共鳴画像法(MRI)などの非侵襲的技術をヒトに使用するには多くの制限があり、ほとんどの場合、トラクトトレースや細胞内記録などの侵襲的技術を適用することは不可能です1.また、ドナーの長期にわたる苦痛状態が脳に影響を与え、研究に支障をきたす可能性があるため、質の高い死後脳組織を取得することも困難です2。したがって、トランスレーショナルリサーチで数十年にわたって使用されてきた動物モデルは、今日まで関連性があり、疑問視されている必要があります。特定の動物モデルの選択は、最近の実験計画と計画の中心的な問題になりつつあり、一貫した結果を得るためには、最も適切なモデルの選択には、異なる種の生理学だけでなく、重要なことに、研究の特定の目的に関する深い知識が必要であることが明らかになっている3。

しかし、動物モデルは、人間の脳の構造と発達を降伏させる際に、いくつかのユニークな発達的、解剖学的、分子的、および遺伝的特徴を持っているため、しばしば限界を示します。したがって、げっ歯類のデータなど、研究に用いる動物から収集されたデータを解釈し、推定することはやや困難です1。

トランスジェニックモデルを含む、現在利用可能な多種多様な動物モデルの中で、ヒト以外の霊長類、イヌ、ブタ4などの大型動物は非常に価値があると考えられています。臓器の大きさに関するヒトとブタの生理学的、遺伝的、解剖学的類似性は、診断および治療アプローチの開発におけるこれらのモデルの重要性を強調しています。特に、ブタモデルはトランスレーショナルニューロサイエンスに特に関心を集めており、安全性と同種移植試験を可能にしています。これは、心血管、肺、胃腸の疾患に関連する研究、特に新しい治療法の試験(幹細胞を用いた再生医療研究など)に使用されています5、6。

この文脈では、in vitroモデル、より特異的に誘導された多能性幹細胞(iPSC)由来ニューロンは、主にげっ歯類などの前臨床研究で使用されるほとんどの動物モデルが所見を臨床に応用するための基準を満たせない場合に、精神疾患の神経新生および初期の表現型の変化の研究を可能にする魅力的なモデルです。

iPS細胞の使用は、特にiPS細胞由来の神経前駆細胞(NPC)を使用することにより、in vitroでの疾患モデリングを可能にすることにより、神経科学に大きな利益をもたらしました。なぜなら、NPCはin vitroでの疾患モデリングのための興味深いツールであることが示されているからです7,8,9。iPS細胞は、アルツハイマー病10、統合失調症11、およびパーキンソン病、レット症候群、脊髄性筋萎縮症、ダウン症候群、筋萎縮性側索硬化症などの多くの疾患から、Mungenast氏らによって作成されています2。前臨床動物モデルシステムも、iPS細胞由来のNPCを機能的な脊椎移植片として使用し、免疫応答が最小限またはまったく検出されなかったことが報告されています12,13,14。

ここでは、ブタiPS細胞の作製と、推定される神経前駆細胞へのさらなる化学分化について説明します(図1および図2)。生成された細胞は、RT-qPCRによって確認されたNPCマーカーNestinおよびGFAPを発現し、免疫蛍光法によりNestin、β-Tubulin III、およびVimentinに対して陽性でした。これらの結果は、大規模動物モデルからの化学阻害剤を用いたin vitro導入後にNPC様細胞が作製されたことを示す証拠を示しており、これは再生医療およびトランスレーショナル医療研究のための重要かつ適切なモデルである。

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プロトコル

これらの実験は、サンパウロ大学畜産食品工学部の動物実験倫理委員会によって承認されました(許可番号:n°5130110517およびn°4134290716)。

注:細胞培養およびインキュベーションを含むすべての手順は、制御された雰囲気(空気中38.5°Cおよび20%CO2 、最大湿度)で行われます。細胞継代は、解離試薬との5分間インキュベーションにより行い、遠心分離後(300 x g)に細胞を回収しました。

1. ブタ線維芽細胞のiPS細胞へのリプログラミング

  1. 実験の準備
    1. 特に明記されていない限り、10%ウシ胎児血清(FBS)、0.1 mMの非必須アミノ酸、および1%抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)を補充したイスコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)からなる線維芽細胞と293培地を準備します。
    2. 低浸透圧DMEM/F12(ヒト胚性および人工多能性幹細胞の増殖に最適化)に、20%血清置換、0.1 mM非必須アミノ酸、1 mMグルタミン、3.85 μM β-メルカプトエタノール、10 ng/mL bFGF、および1%抗生物質を添加したiPS細胞培養培地(リプログラミング培地)を調製します。
    3. 必要に応じて、マウス胚性線維芽細胞(MEF)をT75フラスコ(10 mL)に播種して、翌日に70〜80%のコンフルエント(T75あたり約6 x 105 )を取得します。翌日、0.5 mg/mLマイトマイシンCを200 μLで2時間30分インキュベートし、不活化します(培地を事前に交換せずに、MEFを含むT75にマイトマイシンを添加します)。
    4. インキュベーション期間後、インキュベーション後に細胞を解離溶液で5分間インキュベートした後、1x105 濃度の6ウェルプレートでゼラチンで以前にコーティングしたウェルに播種します。
    5. 0.1%ゼラチン溶液と37°Cで20分間インキュベートしてウェルをコーティングし(ウェル全体を覆うにはウェルあたり約1 mLのゼラチン溶液)、すぐに吸引します。次に、溶液を取り出し、培地(ウェルあたり2 mL)と交換します。
  2. トランスフェクションとレンチウイルスの産生
    1. T75培養フラスコで293細胞を約90%のコンフルエント度に達するまで培養します。
    2. 細胞を解離し、抗生物質を使用せずに新しいT75フラスコごとに5 x 106 細胞を播種します。
    3. 翌日、トランスフェクション用のフラスコ(T75)あたり2つの溶液を調製します:1:1.5 mLのIMDM(抗生物質なし、血清なし)と各ベクターの適切な濃度(12 μgのOSKM、1.2 μgのTAT、1.2 μgのREV、1.2 μgのhgpm2、および2.4 μgのVSVG2°生成)、を調製します。2:1.5 mLのIMDM(抗生物質なし、血清なし)と36μLのリポフェクション試薬(または製造元の推奨による) 15。
    4. 溶液を混合し、15分間インキュベートします。
    5. その間、293細胞の培地を交換し、フラスコあたり10%FBSを添加したIMDMを7mLのみ追加します。
    6. インキュベーション期間後、各フラスコに3 mLのリポフェクション試薬+プラスミドを加えます。6時間後に培地をIMDM 10%FBSと交換します(オプション)。
    7. 培地(全容量 - T75あたり10 mL)を24時間、48時間、72時間の時点で収集します。0.45 mm PVDFフィルターでろ過し、超遠心分離前にバランスを取るために秤量します。
    8. 48,960 x gで1時間30分遠心分離します。
    9. 上清を流し込んで捨て、残りの内容物(約200 μL)を4°Cで1時間インキュベートします。
    10. ウイルスペレットを数回ピペッティングで繊細に再懸濁し、ウイルス溶液を分注します。
  3. 伝達
    1. 6ウェルプレートのウェルあたり2x104 個の線維芽細胞を播種します。分子解析(PCRなど)および形質導入コントロール(GFP解析など)(オプション)用のウェルを含めます。
    2. 翌日、培地1 mLを取り出し、臭化ヘキサジメトリン1 μL(8 μg/mL)とウイルス溶液50 μLを加えます。
    3. 3〜4時間インキュベートした後、培地を完全に交換(2 mL)します(0日目)。
    4. 細胞を5日間培養し、2日ごとに培地を交換します。
    5. 事前に、項目1.1.3に記載されているように、0.1%ゼラチンコーティングプレートとMEFプレートを準備します。
    6. 細胞を解離し、リプログラミング培地で細胞を再播種するには、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してウェルを洗浄します。PBSを取り外します。
    7. 1ウェルあたり1 mLの解離試薬を添加し、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
    8. 細胞をコニカルチューブに移し、細胞を300 x g で5分間遠心分離し、1〜3 mLのiPS細胞培地に再懸濁します。
    9. ノイバウアーチャンバーまたはセルカウンター装置を使用して細胞をカウントし、1-2 x 104 濃度で、あらかじめ0.1%ゼラチンでコーティングされたMEFで覆われたウェルに播種します。
    10. iPSC培地は2日ごとに交換してください。
    11. iPSCコロニー(Passage 0, P0)は、再プログラミング期間の約10日後に出現します。形態学的に典型的なコロニー(丸みを帯びたエッジと核細胞質比の高い細胞)を26G針を使用して手動で選択し、コロニーと周囲のMEFを分離します。
    12. 10 μL または 100 μL のピペットチップを使用して、新しいウェルごとに 1 コロニーを個別に移し、推定 iPSC 細胞株のクローン培養および特性評価を行います。
  4. ブタiPSC継代
    1. 手動の継代とコロニーピッキング
      1. 倒立顕微鏡を清掃し、層流フードに移します。
      2. 顕微鏡を紫外線(UV)で15分間滅菌します。
      3. コロニー移す前に、ゼラチンとMEFでコーティングされたウェルをPBSで洗浄してください。PBSを取り外します。
      4. iPSC培地2mLを添加します。
      5. 使用する井戸で目的のコロニーを特定します。
      6. インスリン注射針のベベルを使用して、コロニーを周囲の細胞から分離します。
      7. コロニーが小さい場合は、10 μLピペットで培地の境界を上下にピペッティングして、ウェルからコロニーを取り外してください。
      8. コロニーが大きい場合は、針でいくつかの小さなセグメントに切ります。
      9. コロニーまたはコロニーの断片を10 μLピペットで吸引します。
      10. それを新しい井戸に移します。
    2. クローンラインの酵素的継代
      1. PBSを使用してウェルを洗浄します。PBSを取り外します。
      2. 1ウェルあたり1 mLの解離試薬を添加し、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
      3. 約100μLの細胞を新しいウェルに移します。この量は細胞株によって異なる場合があります。したがって、Confluency の毎日の視覚的分析を強くお勧めします。

2. ブタiPS細胞によるNPCへの誘導

  1. 実験の準備
    1. B27-マイナスビタミンA(20 μL / mL)、N2(10 μL / mL)、1 mMグルタミン(10 μL / mL)、ペニシリン-ストレプトマイシン(1 μL / mL)を補給した50%神経基礎培地と50%DMEM / F-12で構成される神経誘導培地(NIM)を準備します。溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、BMPシグナル伝達阻害剤LDN193189およびALK阻害剤SB431542をそれぞれ最終濃度0.1 μMおよび10 μMで添加します。
    2. 6ウェルプレートのウェルに1 mLのマトリックス溶液をコーティングし、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。マトリックス溶液を取り出し、iPS細胞培養用のE8培地を添加します。
    3. 導入プロトコルの 13 日目に、B27-マイナス ビタミン A (20 μL/mL)、N2 (10 μL/mL)、NEAA (10 μL/mL)、1 mM グルタミン (10 μL/mL)、ペニシリン-ストレプトマイシン (1 μL/mL) を補給した 50% 神経基礎培地と 50% DMEM/F-12 で構成される神経拡張培地 (NEM) を準備します。溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、FGF2とEGFを最終濃度10 ng/mLになるように添加します。
  2. 導入プロトコル
    1. iPS細胞が100%のコンフルエント度に達する前日に、細胞を新しいウェルに移します(1:1分割)。PBS1mLを加えてウェルを洗います。PBSを取り外します。
    2. 0.5 mM EDTAを1 mL加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
    3. EDTAを取り出し、E8培地1mLを加えます。
    4. ウェルから細胞をやさしく洗い流し、マトリックス溶液でコーティングした新しいウェルに内容物を移します。
    5. 翌日、PBSでウェルを洗います。PBSを取り出し、NIMを2mL加えます。
    6. 誘導媒体を14日間毎日交換します。
    7. 14日目に、PBSを使用してウェルを洗浄します。PBSを取り外します。
    8. ウェルあたり1 mLの細胞解離試薬を添加し、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
    9. 細胞をコニカルチューブに移し、細胞を300 x g で5分間遠心分離し、6 mLのNEM培地に再懸濁します。
    10. 解凍後の回収溶液60 μL(10 μL/mL)を加え、溶液2 mLをマトリックスコーティングされた各ウェルに移します。
    11. NEM媒体は翌日に交換し、その後は2日ごとに交換します。
      注:誘導プロトコルを通過した各ウェルは、新しいNPCラインを生じさせると見なされます。したがって、それぞれの細胞を混合しないでください。

3. NPCの通過

  1. PBS1mLでよく洗ってください。PBSを取り外します。
  2. 細胞解離試薬1 mLを添加し、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
  3. ウェルの細胞をやさしく洗い、内容物を円錐形のチューブに移します。
  4. 溶液を300 x gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、NEMを6mL加えます。
  5. ペレットを穏やかに均質化し、2 mLの溶液を、マトリックス溶液で以前にコーティングした新しいウェルに移します。

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結果

piPSCの特性評価
この特性評価は、再プログラムされた細胞の多能性の獲得を決定することを目的としていました。そのために、胚様体形成、多能性マーカーの免疫蛍光染色、遺伝子発現と胚様体(EB)への自然分化を行いました。

生成された細胞コロニーは、piPSC16、17で予想されるように、明確に定義された境界を持つ細胞クラスター内で平らでコンパクトな形態を示し、線維芽細胞の形態とは非常に異なっていました。それらはアルカリホスファターゼ陽性(図3)で、OCT4、SOX2、SSEA1、TRA 1-60染色で部分的に陽性でした(図4)。これらの細胞はEBを形成することができ、内因性多能性遺伝子OCT4およびNANOGを発現しました(表1)。

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ディスカッション

このプロトコルを通じて、線維芽細胞は、OCT4、SOX2、c-MYC、およびKLF4の外因性発現を使用して in vitro で再プログラムされました。再プログラムされた細胞は、20回以上in vitro で維持されました。これらの系統を化学阻害剤を用いて神経細胞分化に供したところ、RT-qPCRで確認された神経前駆細胞のマーカー であるNestin と GFAPが発現し、免疫蛍光法によりNestin、β-Tubulin III、Vimentinが陽性でした。興味深いことに、おそらくNPC様細胞に分化するために使用される再プログラムされたブタ線維芽細胞の胚性により、ネスチンの存在と発現は、再プログラミングと分化のすべての段階で異なるレベルで検出されました。実際、ネスチンの時空間的発現は、ヒトおよびブタの新生児および胎児の線維芽細胞で報告されています。

推定piPSCの作製についてはすでにいくつかの報告で議論されています

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

クリスティン・フロイデ教授は、プロトコールと科学的な議論の支援で認められています。この研究は、サンパウロ研究財団(FAPESP)(#2015/26818-5、#2017/13973-8および#2017/02159-8)、全米科学技術開発評議会(CNPq#433133/2018-0)、および高等教育要員改善調整(CAPES)(資金調達コード001)からの助成金によって財政的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
293FTInvitrogen# R70007
6ウェルプレートCostar# 3516
anti-B-Tubulin IIIabcam# ab7751
anti-NANOGabcam# ab77095
anti-NESTINMillipore# ABD69
anti-OCT4Santa Cruz biotechnology# SC8628
anti-SOX2abcam# ab97959
anti-SSEA1Millipore# MAB4301
anti-TRA1-60Millipore# MAB4360
anti-VIMENTINabcam# ab8069
B27-Minus Vitamin ALife Technologies# 12587010
DMEM/F-12Life Technologies# 11960
ロバ反ヤギ 488Invitrogen# A11055
EGFSigma# E9644
ウシ胎児血清Gibco# 10099
FGF2Peprotech# 100-18B
GlutaMAXGibco# 35050-061
GlutamineGibco# 25030-081
ヤギ抗マウス 594Invitrogen# A21044
ヤギ抗ウサギ 488Invitrogen# A11008
臭化ヘキサジメトリンSigma Aldrich# 107689
HighCapacity  kitLife Technologies# 4368814
IMDMGibco# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12Gibco# 12660-012
Knockout serum交換用Gibco# 10828-028
LDN-193189Sigma-Aldrich# SML0559
白血球アルカリホスファターゼキットSigma Aldrich# 86R
Lipofectamine P3000™Invitrogen# L3000-015
マトリゲルコーニング# 354277
マイトマイシンCSigma Aldrich# M4287-2MG
N2Life Technologies# 17502048
Nanodrop ND-1000Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal mediumLife Technologies# 21103049
非必須アミノ酸Gibco# 11140-050
Penicillin-StreptomycinGibco# 15140-122
Revita CellGibco# A2644501
Rnase outLife Technologies# 10777019
SB431542Stemgent# 72232
StemPro AccutaseGibco# A11105-01
SW28 ローターBeckman Coulter# 342207
TrizolLife Technologies# 15596026
TrypLE ExpressGibco# 12604-021
β-mercaptoethanolGibco# 21985-023

参考文献

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