ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

サマリー

我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。

要約

感覚システムは、行動を演出するために不可欠な手がかりを収集しますが、動物は生物学的に関連する情報を解読する必要があります。ロコモーションは、動物が周囲の環境の関連する感覚的手がかりから離れなければならないことの深い手がかりを生成します。例えば、魚が泳ぐと、体のうねりから発生した流れは、毛細胞を含むメカノ受容性ニューロマストによって検出され、横線系を構成する。その後、毛髪細胞は感覚的な感覚的なニューロンを介してセンサーから脳に流体運動情報を送信します。同時に、モータ指令のカロリー放電は、感覚過負荷を防ぐためにヘアセルに中継される。移動中の予測運動信号の抑制効果を考慮すると、横線系の感度を評価する際に重要である。我々は、数時間続くことができるゼブラフィッシュ幼虫(受精後4〜7日)における後側索神経および腹側運動根活性を同時に監視するin vivo電気生理学的アプローチを開発した。単一または複数のニューロンからの活性を検出することができる緩いパッチクランプ技術を使用して、細胞外のニューロンの記録が達成される。腹側根の記録は運動ニューロン活動を検出するためにガラス電極で皮膚を通して行われる。当社の実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させるモータ挙動全体の感覚入力の内因性または誘発変化を監視する可能性を提供します。

概要

メカノ感覚系の無透過ニューロンは、聴覚とバランスの間に毛細胞から脳に情報を伝達する。電気生理学は、直接録音を通じて、刺激性ニューロンの感受性を明らかにすることができる。毛髪細胞からの全細胞のパッチ適用は困難な場合がありますが、下流の不毛なニューロンからの記録は容易であり、制御された刺激^1、2、3に応答して行動電位の評価を可能^にする。毛細胞を刺激すると、そのたわみ、メカノ感覚構造を変更し、したがって、刺激性ニューロン^4、5、6における作用電位(スパイク)の増加を引き起こす。外部刺激がない場合、無気泡性ニューロンはまた、毛細胞から無フェ性シナプス後末端^7、8へのグルタミン酸漏れにより自発的にスパイクし、感度^9,10の維持に寄与することが示されている。アフェレント活性のパッチクランプ記録は、マイクロフォニックス

プロトコル

すべての動物のケアと実験は、フロリダ大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました.

1. 電気生理学的記録用材料の調製

1. シリコンエラストマー底の録音皿を作ります。
   1. 自己混合シリコーンエラストマー成分(例えば、シルガード)の薄い層を、浅い縁が浅いリムとレベルアップするまで、カバーガラス底の組織培養皿に分配する。約0.5mLで十分です。
   2. 蓋をして、室温で最低48時間皿を治します。
2. 解剖ピンを作る。
   1. DC電源を使用してエッチャント(3M KOH)の100 mLビーカーに負の電荷(5 V)を供給し、正に帯電した出力にタングステン線(0.002インチ、直径50.8μm)を取り付けます。
      注意: 負のワイヤと正のワイヤは、火花を発生させる危険性があるため、この手順の間に相互に接触してはなりません。
   2. エッチタングステンワイヤーは、先端が鋭いポイントに狭くなるまで、ワイヤーの先端を素早く繰り返しエッチャントバスに浸します。実体顕微鏡下で、先端からワイヤーを直線エッジカミソリの刃で約1mm切ります。さらに3回繰り返し、細かい鉗子を使用して硬化した録音皿にピンを挿入します。
3. 記録電極を準備します。
   1. ボロケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(内径:0.86mm、外....

結果

ゼブラフィッシュの幼虫が適切に固定化され、後方線の斜線が気になるガングリオンとVR記録が達成された後、同時に、アフェレントと運動ニューロンの両方で活性を測定することができます。記録チャンネルは、ギャップのない記録プロトコル(ステップ1.4)を使用して表示され、afferentおよびVRアクティビティを継続的に監視します。リアルタイムでは、自発的な無フェレントスパイク率の低下は、架空の泳ぎの発作を示すVR活動と同時に観察することができる(図1E)。最良の結果と正確なスパイク検出は、少なくとも0.5の信号対雑音比を達成した記録の製品であることがわかりました。カスタムの作成前処理スクリプトは、afferent および VR スパイク検出の視覚化を支援するプロットを生成します。自発的なスパイクは、しきい値、最小時間(0.01 ms)、最小スパイク間隔(ISI; 1 ミリ秒)などのスパイク パラメータの組み合わせを使用して識別されます。記録を確立しながら負圧を増加させることは、多くの場合、一度に複数の異なるユニットからの信号検出をもたらす。振幅によるフィルタリングは、独立したアフェレント.......

ディスカッション

説明された実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させる運動行動全体の感覚入力の内因性変化を監視する可能性を提供する。具体的には、幼虫ゼブラフィッシュにおける側線の無気泡性ニューロンと腹側運動根の同時細胞外記録を行うためのインビボアプローチを詳述する。自発的な発泡活動は、潜在的な同時運動活動^{1、2、39、40、41}を考慮せずにゼブラフィッシュで以前に特徴付けられてきた。腹側ルート記録で運動活動の存在を監視することなく、自発的な水泳中、さらには後のエフェレント阻害の影響により、発泡活動を解読することは過小評価される可能性が高い。

生体内電気生理学的記録は本質的に困難です。私たちの経験では、健康的な準備を維持することは、発送性ニューロンと腹側運動根の成功した、長期的.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100mLビーカー	PYREX	1000	エッチャント用レセプタクル
10倍水浸対物レンズ	オリンパス	UMPLFLN10xW	幼虫の位置決めと記録電極のための低倍率
オ	リンパス	LUMPLFLN40XW	位置電極チップの高倍率とパッチクランプ
abfload.m		補足コーディングファイル	生の電気生理学記録を.matファイルに変換するためのカスタム記述されたMATLABスクリプト
AffVR_preprocess.m		補足コーディングファイル	記録データの前処理のためのカスタム記述されたMATLABスクリプト
BNC同軸ケーブル	ThorLabs	2249-C-12	増幅器とデジタイザーチャネルの接続;
ホウケイ酸ガラスキャピラリーとフィラメント	ワーナーが必要機器	G150F-3	内径:0.86、外径:1.50; 記録電極を形成するために使用される毛細管ガラス
burst_detect 補足コーディングファイル	AffVR_preprocess.m		を実行するために必要なカスタムライティングMATLAB機能
	N/A	N/	A 任意のコンピュータは、
電気エッチング解剖ピンに使用される	DC電源	Tenma	72-420
電気生理学デジタイザー	Axon Instruments, Molecular Devices	Axon DigiData 1440A	は、パッチクランプデータ
フィラメント	Sutter Instrument Company	FB255B	マイクロピペットプーラーファイン鉗子に使用される2.5mmボックスフィラメント
	ファインサイエンスツール	デュモン#5(0.05×0.02mm) 商品番号11295-10	虫の操作とピン挿入
固定ステージDICに使用顕微鏡	オリンパス	BX51WI	パッチクランプ記録を視覚化し、確立するために使用される
柔軟な、テーパーピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-169	柔軟なチップは、先端で細胞外溶液を分注するための記録電極への挿入を可能にします
FluoroDish	World Precision Instruments Inc.	FD3510-100	カバーガラス底皿記録皿
KimWipe KimTech		34155	ワイプは、幼虫から余分な液体を吸い上げるために使用されます
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	セルフミキシングシルガードエラストマー
MATLAB	MathWorks	R2020b	データ前処理用コマンドラインソフトウェア
微小電極増幅器	Axon Instruments, Molecular Devices	MultiClamp 700B	デュアルチャネル記録用パッチクランプ増幅器
Microforge	成重	MF-830 microforge	記録電極
マイクロマニピュレータを研磨制御ユニット	Siskiyou	MC1000-eR/T	マイクロマニピュレーターを制御するための4軸ダイヤルコーディネーター
マイクロピペットプーラー	Sutter Instrument Company	Flaming/Brown P-97	ピラリーガラスを記録電極に引き込むための
制御ユニット	Siskiyou	MC1000e	は、顕微鏡を固定ステージと準備
マイクロマニピュレーター	の周りに配置しますSiskiyou	MX7600
Axon MultiClamp 700Bコマンダーダウンロードページからダウンロード可能な	MultiClamp Commander	Molecular Devices	2.2.2をダウンロード
光学エアテーブル	ニューポートコーポレーション	VH3036W-OPT	ブレッドボードアイソレーションテーブル 顕微鏡を浮かべ、記録中の振動を最小限に抑えます
pCLAMP	Molecular Devices	10.7.0	は Axon pCLAMP 10 からダウンロード可能 Electrophysiology Data Acquisition &分析ソフトウェア ダウンロードページ
パーマネントインクマーカー		VR電極の前縁側をマーキングするための	amazon.com からの
ペトリディッシュ	ファルコン	35-3001	麻痺性ピペットホルダーに幼虫を浸すために使用される
	分子デバイス	1-HL-U	記録電極を保持し、ヘッドステージに接続します
空気圧トランスデューサ	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	記録電極を制御するため 内圧
水酸化カリウム	Sigma-Aldrich	221473-25G	エッチング用 解剖ピン
シリコンチューブ	Tygon	14-169-1A	空気圧トランスデューサーをピペットホルダーに接続するための
spike_detect		補足コーディングファイル	AffVR_preprocess.m
実体顕微鏡	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	、ピンの先端を視覚化し、幼虫の
ストレートエッジかみそりブレード	、amazon.com からのCanopus	の注文
			切断しますAffVR_preprocess.mシリンジを実行するために必要なカスタムメイドのMATLAB関数
	Becton Dickinson Compoany	309602	記録電極に注入するための細胞外溶液で満たされ
転送ピペット	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	使い捨て、幼虫を転送するための非滅菌ピペット
カインメタンスルホン酸	Syndel	12854	高用量で幼虫を安楽死させるために使用される医薬品麻酔薬。
タングステンワイヤー	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	715500	0.002インチ、50.8 μm直径;解剖ピンを作るために使用
真空ろ過ユニット	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	電気生理学用電極リンガー電圧クランプ電流クランプヘッドステージに使用される細胞外溶液を滅菌するために使用される単回使用、滅菌、真空ろ過ユニット
	Molecular Devices	CV-7B	には、左右のヘッドステージとして使用されるMultiClamp 700Bアンプが付属しています
α-bungarotoxin	ThermoFisher	B1601	(記録前に幼虫を固定化するため

4つのコンピュータで動作する必要がありますの取得を可能にします 幼の顕微鏡は、タスク キャ顕微鏡電動は、パッチクランプ記録可能なヘッドステージと付属の記録電極を配置します 注文 ペトリディッシュに挿入する際に適切な向きを確保するための ー チューブ を実行するために必要なカスタム記述されたMATLAB関数はの準備中には、補足コーディングファイルswimbout_detect解剖ピンを作成しながらタングステンワイヤーを、ています トリ)