初代細胞培養は、in vitroでミクログリアの生物学を研究するために主に使用されるアプローチの1つです。本研究では、マウスの生後1日目(P1)からP4まで、ミクログリアを簡便かつ迅速に単離する方法を開発しました。
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初代細胞培養は、in vitroでミクログリアの生物学を研究するために主に使用されるアプローチの1つです。本研究では、マウスの生後1日目(P1)からP4まで、ミクログリアを簡便かつ迅速に単離する方法を開発しました。
ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の単核食細胞であり、恒常性を維持し、CNSの炎症過程を調節する上で重要な役割を果たします。in vitroでミクログリアの生物学を研究するために、初代ミクログリアは不死化ミクログリア細胞株と比較して大きな利点を示しています。しかし、出生後のマウス脳からのミクログリアの分離は、比較的効率が悪く、時間がかかります。このプロトコルでは、新生児マウスの脳から一次ミクログリアを分離するための迅速でわかりやすい方法を提供します。このプロトコルの全体的なステップには、脳の解剖、初代脳細胞の培養、およびミクログリアの分離が含まれます。このアプローチにより、研究者は高純度の初代ミクログリアを得ることができます。さらに、採取した初代ミクログリアは、リポ多糖の挑戦に応答することができ、免疫機能を保持していることが示されました。私たちは、高純度の初代ミクログリアを効率的に単離するための簡素化されたアプローチを開発し、in vitroでの幅広いミクログリア生物学研究を促進しました。
中枢神経系(CNS)に常在する免疫細胞であるミクログリアは、神経病理学的課題に応答する恒常性の維持に極めて重要な役割を果たしています1。近年、アルツハイマー病2などにおけるミクログリアの生理学的機能を把握するための集中的な研究が行われています。現在、中枢神経系の発生、老化、および疾患中に得られた単一細胞分解能でのミクログリアの転写プロファイルは、健康な脳と病気の脳におけるミクログリア機能の理解を深めるのに役立ちます3。以前の研究では、ADおよびその他の神経変性疾患における疾患関連ミクログリアサブタイプが特定されました4,5,6。この亜集団は、アミロイドβ(Aβ)沈着に近接しています。食作用と脂質代謝に関連する遺伝子(例:Apoe、Tyrobp)は、これらの集団でアップレギュレーションされていることがわかりました6,7。しかし、ミクログリアの動的分子プロファイルの変化を制御する細胞内プロセ....
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すべての動物実験手順は、上海交通大学の動物研究委員会と実験動物管理の施設管理委員会によって承認されました。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われています。
1. 培養バッファー、フラスコ、カバースリップの調製
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図1では、細胞播種後7日目と35日目にCX3CR1+/GFPから採取した一次ミクログリアを示しています。ミクログリア/マクロファージ細胞マーカーIBA1の免疫蛍光染色で示されたように、IBA1陽性細胞は全てGFPシグナル陽性、S100β(アストロサイトマーカー)およびCC1(オリゴデンドロサイトマーカー)陰性であり、精製されたGFP陽性細胞は確かにミクログリアであることが示唆されます。次に、単離された細胞の95%以上がGFP陽性細胞であることが判明し、単離されたミクログリアは高純度であることを示しています10。さらに、初代ミクログリア細胞の機能をin vitroでさらに特徴付けるために、単離されたミクログリアを10 ng/mLおよび100 ng/mLのLPSで24時間処理しました(図2を参照)。対照と比較して、LPS曝露は、CD68の発現をアップレギュレートし、長く分岐したプロセスを持つアメーバ形態への変換を含む、活性化された表現型を誘導しました。こ.......
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このプロトコルは、前に説明した方法に基づいており、いくつかの変更が加えられている11。単離されたミクログリアの生存率と純度を向上させるためのヒントを以下に示します。まず、組織単離や細胞培養に使用するバッファーを調製する際には、コンタミネーションを避けるように注意してください。手術器具、容器、プラスチック機器が無菌であることを確認してください。通常、脳の解剖は、交差汚染を避けるために、一般的な細胞培養用の細胞培養フードとは別に、別の組織培養フードで行います。第二に、組織の解剖と播種のステップは、経験豊富な研究者が10〜12匹の子犬に対して約1.5〜2時間かかる必要があります。大規模な調製は可能ですが、特に組織解剖の時間を確実に延長します。しかし、低酸素および虚血誘発性の細胞活性化を最小限に抑えるために、損傷シグナルへの細胞曝露を減らすために、細胞単離を適時に終了する方がよい。第三に、アストロサイト単層の破壊を避けるために、混合細胞培養を穏やかに取り扱う必要があります。さらに、分離プロセス中にフラスコを激しく振らないでください.......
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すべての著者は、利益相反がないことを明らかにしました。すべての著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
著者は、COVID-19の発生と戦う英雄たちに敬意を表したいと思います。著者は、優れた研究室運営を提供してくれたFang Lei氏(復旦大学)、ミクログリアの分離について議論してくれたZikai Zhou博士、Jing Li博士、Shanghai Mental Health CenterのGuiqing He博士に感謝します。最後になりましたが、著者は、この研究で犠牲になったすべての動物に感謝と敬意を示しています。本研究は、National Key R&D Program of China(Grant No. 2017YFC0111202)(B.P.)、National Natural Science Foundation of China(Grant No. 31922027)(B.P.)および(Grant No. 32000678)(Y.R.)、およびShenzhen Science and Technology Research Program(Grant No.JCYJ20180507182033219およびJCYJ20170818163320865)(BP.)および(グラント番号。JCYJ20170818161734072)(S.X.)。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| セルストレーナー、40 & マイクロ;m | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22-363-547 | |
| DNase I | シグマ | 11284932001 | |
| ダルベッコのモディファイド イーグル メディウム (DMEM) | ギブコ バイ ライフ テクノロジー | C11995500BT | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) | ギブコ バイ ライフ テクノロジー | 14190-144 | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | ギブコ バイ ライフ テクノロジー | ズ 10099141 | |
| パパイン、懸濁液 | サンゴン バイオテック | パパイン、懸濁液ペ | |
| ニシリン-ストレプトマイシン100X溶液 | Hyclone | SV30010 | |
| Poly-D-Lysine | ThermoFisher Scientific | A3890401 |
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