2つの蛍光色素分子間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用の研究に使用できます。ここでは、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してアクセプターの感作放出およびドナー分子の消光を検出することによって、生細胞中のFRETを測定する方法に関するプロトコルが提供される。
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サマリー
要約
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、励起ドナーからアクセプター分子へのエネルギーの無放射移動であり、分子の距離と配向、およびドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルの重なりの程度に依存します。FRETは、生細胞内のタンパク質の相互作用を経時的におよび異なる細胞内コンパートメントで研究することを可能にする。顕微鏡を使用してFRETを測定するためのさまざまな強度ベースのアルゴリズムが文献に記載されています。ここでは、アクセプターの感作放出およびドナー分子の消光の両方を測定することに基づいてFRET効率を定量化するためのプロトコルおよびアルゴリズムが提供される。生細胞中のレシオメトリックFRETの定量には、蛍光タンパク質のクロストーク(スペクトルスピルオーバー、またはブリードスルー)の決定だけでなく、顕微鏡セットアップの検出効率も必要です。ここで提供されるプロトコルは、これらの重要なパラメータを評価する方法を詳述しています。
概要
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の顕微鏡ベースの分析により、生細胞内のタンパク質間の相互作用の評価が可能になります。これは、細胞内のどこで、どの細胞内コンパートメントで相互作用が起こるか、そしてこの相互作用が時間とともに変化するかどうかに関する情報を含む、空間的および時間的情報を提供する。
テオドール・フェルスターは1948年にFRETの理論的基礎を築きました1。FRETは、励起ドナーからアクセプター分子への無放射エネルギー伝達であり、分子の距離と遷移双極子の相対配向、およびドナー発光スペクトルとアクセプター吸収スペクトルの重なりに依存します。エネルギー伝達率は、ドナー - アクセプター距離の6乗に反比例する。したがって、FRETは、1〜10nmの範囲の分子近接を測定するために使用することができる。
FRETは、ドナー分子の他の脱励起プロセスと競合し、アクセプターのいわゆるドナー消光および感作放出をもたらす。ドナー消光は放出されたドナー光子の数の減少であり、増感放出は放出された受容体光子の増加である。多くの顕微鏡FRET分析では、アクセプター光退色2、ドナー光退色2、またはアクセプター3のFRET増感光退色などの蛍光強度測....
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プロトコル
1. プラスミド構築
- eGFP-mCherry1融合プローブの作製には、制限部位AgeIおよびBsrGIを用いてmCherry110を挿入したN1哺乳類細胞発現ベクター(材料の表を参照)を使用します。
- 以下のオリゴヌクレオチドを使用して、終止コドンなしでeGFP11 を SalI-BamHI フラグメントとして増幅します:N末端プライマー5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3'およびC末端プライマー5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'。
- この SalI-BamHI フラグメントをN1ベクターのマルチクローニングサイトに挿入し、緑色蛍光タンパク質と赤色蛍光タンパク質の間にRNPPVリンカー(5アミノ酸)リンカーを導入します。
注:このリンカーは、GFP-Cherryドナー-アクセプターペアの平均FRET効率が約0.25 -0.3になります(図1A)。測定されたFRET効率をスケーリングするために、さまざまな長さの硬い12 およびらせん状....
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結果
図1は、ドナーチャネル、チャネル1(488、505〜530nm)、転送チャネル、チャネル2(488、>585nm)、およびアクセプターチャネル、チャネル3(561、>585nm)で得られた画像をそれぞれ示す。GFPのみ、チェリーのみ、GFPとチェリーを共発現し、GFP-Cherry融合タンパク質を発現する細胞の代表的な画像。GFP-Cherry融合タンパク質を発現するNRK細胞(陽性対照、図2A)およびGFP-Cherryを共発現するNRK細胞(陰性対照、図2B)で計算された平均細胞FRET効率を、各細胞における受容体対ドナー比強度比(Q)または分子比NA/NDDに対してプロットした。図2Cは、関心領域の輪郭を描き、高い自家蛍光を有する核周囲小胞.......
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ディスカッション
提示されたプロトコルは、共焦点顕微鏡によるアクセプターの感作放出の検出およびドナー分子の消光を使用してFRETを定量するための遺伝的に結合された1対1の蛍光タンパク質較正プローブの使用を詳述している。この方法は、異なる細胞内区画における生細胞の生理学的状況におけるタンパク質相互作用を評価するために適用することができる。空間分解能は、提示されたアルゴリズムを適用して、画像の各ピクセル(ピクセルごとのFRET)におけるFRET効率を計算することによってさらに改善することができる。強度ベースの絶対FRET効率の決定には、 S 因子で定量化されたクロストークの決定と、α因子で定量化された所定の顕微鏡セットアップによるドナー分子とアクセプター分子の検出効率の決定が必要です。ここでは、クロストーク効率と検出効率の両方の定量化を可能にするプロトコルが提供されます。蛍光タンパク質の遺伝情報の直接結合は、生細胞における等モル発現を保証し、それによってα因子の決定を可能にする。次に、α因子の知識は、生細胞のFRET効率を定量化するための前提条件です。提供されたプロトコルの重要なステップは、直接結合蛍光タンパク質キメラの適切なクローニング、.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
このプロジェクトに機器とスペースを提供してくれたスタンフォード大学医学部の神経科学イメージングサービスに感謝します。この研究は、スタンフォードがん研究所とスタンフォード婦人科腫瘍学部門の学内資金、およびハンガリー国立研究開発イノベーションオフィスのGINOP-2.3.2-15-2016-00026、GINOP-2.3.3-15-2016-00030、NN129371、ANN135107によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5% トリプシン-EDTA フェノールレッド (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25030081 |
参考文献
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
