超音波誘発薬物放出のための蛍光標識マイクロバブルの特性評価のためのマルチタイムスケール顕微鏡法

Summary

提示されたプロトコルは、超音波誘発薬物送達用途のために設計された蛍光標識マイクロバブルの応答を特徴付けるために使用することができ、その活性化メカニズムとその生物効果を含む。本論文では、関連する長さとタイムスケールを捉えるために実施されるイン ビトロ および インビボ 顕微鏡技術の範囲をカバーする。

Abstract

マイクロバブル造影剤は、超音波で薬物送達アプリケーションのための大きな約束を保持しています。ナノ粒子に薬物を封入すると、全身毒性が低下し、薬物の循環時間が長くなります。マイクロバブル支援薬物送達に対する新しいアプローチでは、ナノ粒子がマイクロバブルシェルに組み込まれ、超音波によるナノ粒子ペイロードの局所的かつ誘発放出が可能になる。広大な超音波パラメータ空間内のリリースメカニズムの徹底的な理解は、効率的で制御されたリリースのために重要です。提示されたプロトコルのこのセットは、蛍光標識を含むシェルを持つマイクロバブルに適用されます。ここでは、修飾ナイルレッド染料でドープされたポリ(2-エチルブチルシアノアクリル)ポリマーナノ粒子を搭載したマイクロバブルに焦点を当てています。粒子は変性カゼインシェル内に固定されています。マイクロバブルは、激しい攪拌によって生成され、カゼインおよびナノ粒子を含む液相中にパーフルオロプロパンガスの分散を形成し、その後、マイクロバブルシェルが自己集合する。ナノ粒子放出プロセスのすべての関連タイムスケールでナノ粒子安定化マイクロバブルを特徴付けるために、様々な顕微鏡技術が必要です。ナノ粒子の蛍光は、単一のマイクロバブルの共焦点イメージングを可能にし、シェル内の粒子分布を明らかにする。1秒間に1,000万フレームの明視野顕微鏡を用いた in vitro 超高速イメージングは、超音波の浸透に応答して気泡ダイナミクスに関する洞察を提供します。最後に、バブルシェルからのナノ粒子放出は、蛍光顕微鏡法によって最もよく可視化され、毎秒50万フレームで行われる。 生体内での薬物送達を特徴付けるために、血管系内のナノ粒子の放出を引き起こし、内皮層を越えてそれらの外挿を、数分間のタイムスケールにわたって、後側皮膚折り歯室に埋め込まれた腫瘍の生体内顕微鏡を用いて研究する。これらの相補的特徴付け技術の組み合わせは、マイクロバブルの挙動とそのペイロード放出を、 インビトロ と インビボの両方の時間および長さのスケールの範囲で提供します。

Introduction

超音波は、最も広く使用されている医療画像技術です。それは非侵襲的、速く、安全、費用効果が大きく、そして携帯用^{1、2、3である}。しかし、血液は、貧しい超音波散乱剤であり、そして、血液プールのコントラストは、超音波造影剤³の静脈注射によって増強することができる。この強化された血液プールコントラストは、診断目的のための臓器灌流の定量化を可能にし、 例えば、冠状動脈疾患⁴ および転移性肝疾患⁵の検出において。実際、腫瘍血管構造は重要な予後因子⁶であることが証明された。現在、マイクロバブル支援、標的分子イメージング、治療用の造影剤の調整に向けた主要な研究努力が行なわれつつある。

市販の超音波造影剤は、通常、1 μmから10 ^μm9までの範囲の直径を有するコーティングされたマイクロバブルの懸濁液^7,8からなる。超音波造影剤マイクロバブルは赤血球⁷よりもわずかに小さいので、マイクロバブルは閉塞を作成することなく、最小の毛細血管にも安全に到達することができます³。マイクロバブルは、圧縮ガス^core11のために、組織10と比較して超音波後方散乱係数が劇的に増加した。さらに、マイクロバブルエコーは、高非線形、すなわち、そのスペクトルは、駆動周波数の高調波およびサブハーモニクスを含む。また、エコー強度は、バブル¹²の共振応答に強く依存する。組織は直線的にしか散らばるが、少数のマイクロバブルは高調波画像化^13,14において高い検出感度を達成するのに十分である。この非線形コントラスト生成は、^body15内の単一の気泡を追跡するのに十分な強度を持つことさえできます。

超音波造影剤のシェルは、溶解および合体に対して気泡を安定化させ、それによって血液プール¹⁶内のそれらの循環時間を増加させる。シェルは、脂質、ポリマー、または変性タンパク質^3,8から構成することができます。それは、界面張力を低下させ、それによってラプラス圧駆動溶解¹⁷の効果を制限し、ガス拡散¹⁸に対する抵抗バリアを作成する。さらに安定性を高めるために、コントラストマイクロバブルは、典型的には、血中¹¹に低い溶解度を有する高分子量ガスで満たされる。マイクロバブルシェルは、超音波^insonation11に対するマイクロバブルの応答を劇的に変化させます。コーティングされていない気泡は、そのサイズに反比例する特性共振周波数を有し、脂質被覆の添加は、シェル³の本来の剛性に起因するコーティングされていない泡立ちのそれに対する共振周波数を増加させる。さらに、シェルは、コーティングされた気泡³の減衰の支配的な供給源を構成する拡張粘度を通じてエネルギーを放散する。安定化シェルは、マイクロバブルの表面にリガンドを標的に結合することによって、機能化することができるという付加的な利点を有する。このターゲット設定は、これらの気泡、特に超音波^14,19による分子イメージングに多くの用途を可能^にする。

マイクロバブル造影剤は、超音波で薬物送達アプリケーションのための大きな約束を保持しています。血管の閉じ込めで振動するマイクロバブルは、細管の壁³上の局所的な正常および剪断応力と同様に、マイクロストリーミングを引き起こす可能性があります。高い音響圧では、大きな振幅振動は慣性キャビテーションと呼ぶ激しいプロセスでマイクロバブル崩壊を引き起こし、今度は血管^の破裂または膣の浸入につながる可能性がある。これらの暴力的な現象は、ソノペメネーション²¹などの生物効果を誘発し、内皮壁を横切る間皮間への治療薬の血管外挿を、超細胞的または細胞内に増強する。また、このメカニズムはまだ十分に理解されていないが、ストロマが豊富な腫瘍^21,22およびバイオフィルム^23,24の細胞外マトリックスを介して治療剤の浸透を改善するかもしれない²⁶。

超音波媒介性薬物送達は、前臨床^27,28および臨床試験²²の両方で有望な結果を示している。また、比較的低周波超音波(1MHz)で使用した場合、マイクロバブルは、血液脳関門透過性を局所的かつ一時的に増加させ、それにより、前臨床試験および臨床研究29,30,31,32,33,34の両方で脳の円質に入ることを可能にする薬剤が報告されている。

一般的に超音波媒介性薬物送達には2つのアプローチがあります:治療材料は気泡と共に投与することができ、または気泡殻^28,35,36に取り付けたり、ロードしたりすることができます。第2のアプローチは、薬物送達の点でより効率的であることが示されている³⁷。マイクロバブルは、シェルに取り付けられたナノ粒子(リポソームまたはポリマーナノコンストラクト)に封入された薬物または遺伝物質を装填したり、マイクロバブルシェル^35,36に直接組み込んだりすることができる。ナノ粒子にロードされたマイクロバブルは、ナノ粒子ペイロード28、^{33、38、39、40}を局所的に放出する(焦点を当てた)超音波によって活性化することができる。このようなマイクロバブルが細胞と直接接触している場合、ペイロードが^{sonoprinting34,35}と呼ばれるプロセスで細胞細胞質膜に堆積することさえできることをインビトロで示されている。

マイクロバブルの不変のための超音波パラメータ空間は広範囲であり、 生体内の 生物学的条件はさらに複雑さを追加します。したがって、焦点を当てた超音波とナノ粒子にロードされたマイクロバブルの組み合わせは、標的治療の分野で課題を提起する。

この研究の目的は、超音波パラメータの関数としてのマイクロバブルの応答を詳細に画像化し、シェル破裂とその後の蛍光標識シェル材料の放出につながるメカニズムを研究するために使用できるプロトコルを提供することです。このプロトコルのセットは、蛍光色素を含むシェルを持つマイクロバブルに適用可能です。図1は、SINTEF(ノルウェー・トロンハイム)で開発された高分子ナノ粒子およびタンパク質安定化マイクロバブルの概略図を示す。これらの気泡はパーフルオロプロパンガス(_C3F8)で満たされ、シェルを安定させるナノ粒子にはNR668が含まれており、これはナイルレッド蛍光色素^38,43の親油性誘導体です。ナノ粒子はポリ(2-エチルブチルシアノクリレート)(PEBCA)で構成され、PEGylatedです。ポリエチレングリコール(PEG)による機能化は、単核貪食細胞系によるオソニゼーションおよび貪食を減少させ、それによって循環時間^14,44を延長する。その結果、PEGylationは標的部位に到達するナノ粒子の量を増加させ、それにより、治療¹⁶の効力を向上させる。図2は、4つの顕微鏡法を使用して、研究者が関連するすべての時間と長さのスケールをカバーすることを可能にする方法を示しています。なお、光学顕微鏡で達成可能な空間分解能は、回折限界によって決定され、これは目的の光の波長および数値開口(NA)および物体照明源⁴⁵の波長に依存する。手元にあるシステムの場合、光学解像度の制限は通常 200 nm です。さらに、生体内顕微鏡検査を使用して、細胞内レベル⁴⁶上で画像を作成することができます。本研究で用いたナノ粒子・タンパク質安定化マイクロバブルの場合、生体内顕微鏡に関連する最小長スケールは小さな毛細血管の大きさ(≥10μm)です。単一のマイクロバブルに対するインビトロ高速光学イメージング(毎秒1000万フレーム)および高速蛍光イメージング(毎秒50万フレーム)の実験について説明します。ナノ秒タイムスケールにおける高速明視野イメージングは、振動気泡の時間分解された放射状ダイナミクスを研究するのに適しています。対照的に、高速蛍光顕微鏡は、蛍光標識ナノ粒子の放出を直接可視化することを可能にする。さらに、マイクロバブルシェルの構造は、Zスタック3次元(3D)共焦点顕微鏡を用いて調べることができ、走査型電子顕微鏡(後者のプロトコルは現在の作業には含まれていない)を用いて調べることができます。生体内顕微鏡は、多光子顕微鏡を使用して、側側の窓腔内で生育する腫瘍を画像化し、生体内の蛍光標識ナノ粒子の運命に関するリアルタイム情報を提供^する。これらの顕微鏡法の組み合わせは、最終的には、インビトロとインビボの両方の超音波に応答して治療用マイクロバブル剤の挙動に関する詳細な洞察を提供する。

Protocol

注:すべての実験手順は、ノルウェー動物研究当局によって承認されました。プロトコルで使用された材料の詳細については、 資料表を参照してください。

1. マイクロバブルの製造

注:この研究では、目的のマイクロバブルは、タンパク質およびナノ粒子安定化マイクロバブルであり、生産プロトコルは以前に説明された28,33,48です。したがって、製造プロトコルは、ここで簡単にまとめました。

1. まず、ピペットを使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.5重量%のカゼインを含む超純水を混合し、蛍光色素の0.21重量%で標識されたナノ粒子の1重量%、NR668(改変ナイルレッド)を無菌ガラス圧着トップバイアル(10mL、直径2cm)に混合する。ポリマーナノ粒子は、Mørchらが述べたようにミニエマルジョン重合法を用いて作製する。³⁸.
   注:ここでは、色素はナノ粒子放出の可視化を可能にするモデル薬として機能します。ナノ粒子溶液を使用する場合は、ラボコート、ゴーグル、手袋を着用してください。ナノ粒子溶液のこぼれを100%アセトンですぐに拭き取ります。
2. バイアルにゴムキャップをかぶり、わずかに混ぜ、室温で10分間超音波浴に入れ、可能な凝集体を排除します。ガラスバイアルの底から約0.5cmの攪拌機の先端を用いて分散工具を置きます。ガス容器に接続されたガラスピペットを使用して、溶液がわずかに泡立ち始めるまで、溶液を含むバイアルのヘッドスペースにパーフルオロプロパンガスを加えます。
   注:攪拌中にガラスバイアルの滑りを防ぐために、分散ツールのベースの周りにセルフシールフィルムをラップします。
3. 分散工具を使用して、1935× g (3mmの回転半径で24,000 rpm)で溶液を4分間激しく攪拌します。ゴム製キャップでバイアルを閉め、バイアルを密封してさらに使用します。
   注:攪拌は液体中の気体を包み込む。マイクロバブルシェルは、アクティブなステップを必要とせずに、その後自己組み立てます。
4. 過剰なカゼインとナノ粒子溶液を4°Cで保存し、100%アセトンで分散工具を洗浄します。

2. 単一の気泡をイメージング

1. 共焦点顕微鏡
   1. サンプル準備
      1. 単一のマイクロバブルを次のようにして、泡溶液を希釈します。通気針(19 G-21 G)を、セクション1に記載された手順に従って生成されるマイクロバブルを含むガラス圧着上部バイアルに入れます。大きな泡がバイアルのシールから離れるように、バイアルを逆さまにします。
      2. バイアルが逆さまになっている間に、小さな(〜1 mL)の注射器の別の針先(19 G)をバイアルに挿入します。少量の気泡懸濁液を取り除き、次のステップでピペットを容易にするため、注射器の内容物を小さなチューブに移します。
         注:抽出する懸濁液の量は、気泡懸濁液の種類と濃度に依存します。この場合、0.2mLが抽出された。
      3. ピペットを使用して、濾過されたPBSでマイクロバブル懸濁液(セクション1から)を希釈し、¹⁰⁵ マイクロバブル/mL×約2×¹⁰⁵ 〜6の濃度を達成し、単一泡イメージングを可能にします。
         注意:気泡の種類によっては、気泡懸濁液を洗浄して蛍光染料を除去することをお勧めします。これは、蛍光色素がシェルに注入される気泡で特に重要です。泡を洗浄するには、気泡懸濁液を希釈し(例えば、 PBSの10mLで100μLの気泡溶液を取ることによって)、遠心分離機(通常は100× gの速度で)最後に、マイクロバブルを含む上清をピペットで除去し、さらなる分析を行います。残りの溶液は、遊離蛍光粒子を含み、廃棄することができる。洗浄工程は必要に応じて繰り返す必要があります。
      4. 混合物にグリセロールを加えると、培地の粘度が増加し、ブラウン運動によって引き起こされる動きが除去され、それ以外の場合はむしろ遅い共焦点Zスタックイメージングを妨げるであろう。
         注意:グリセロールの量は、画像化される気泡の種類によって異なります(ここでは、〜50%)。気泡の一部のタイプ, グリセロールは、安定性に悪影響を持っている可能性があります ^49.しかし、共焦点像の下では約30分の気泡には顕著な変化は認められなかった。さらに、グリセロールはマイクロバブルの音響応答を変化させる可能性があるため、マイクロバブルが起きていないイメージング法でのみ使用できます。
      5. マイクロバブル懸濁液を薄い壁のあるチャンバーに入れ、チャネルスライドなどの最適なイメージングを行います。
   2. イメージングプロトコル
      1. 共焦点顕微鏡のスイッチを入れ、共焦点顕微鏡で使用する適切な目的と目的のレーザーとスキャナーを選択します。
         注:ここでは、0.08 μm/ピクセルの解像度に60倍の水浸し目標を使用し、バブルサイズに応じて、256 x 256ピクセルまたは128 x 128ピクセルの領域を画像化します。これらの特定の実験では、488 nmレーザーとガルヴァーノスキャナを使用します。発光波長は蛍光色素に依存し、一般的にブロードバンドです。
      2. 明視野でマイクロバブルを見つけ、共焦点顕微鏡に切り替えます。共焦点顕微鏡がスキャンする間に、目的の上面と底面を設定します。Zスタックを取得して3D構造を観察します。Z 方向に 100 nm のステップ サイズを使用します。
2. 明視野顕微鏡
   1. 光学系の組み立て
      注: 明視野顕微鏡の設定の概略図を 図 3A に示します。邪魔されない超音波の伝播を確実にするために、水浴は2つの開口部を含んでいる:光源のための1つと超音波トランスデューサーのための1つ。光学系は(モジュラー)顕微鏡、高速カメラ、および一致する光学装置から成っている。マイクロバブル振動の周期は、通常、1 μs(1 MHz超音波を使用)の順序であるため、カメラは少なくとも毎秒500万フレームのフレームレートで記録するように設定する必要があります。ここでは、カメラは、高調波を含むバブルダイナミクスのすべての詳細をキャプチャするために、毎秒1000万フレーム(256 x 400ピクセル)で256フレーム(256×400ピクセル)で記録するように設定されます。
      1. 適切な倍率、作動距離、NAを顕微鏡に取り付けて、水浸漬目的を取り付けます。
         注:水の浸漬目的は、水の徐々に蒸発にもかかわらず、安定した作業距離を提供するために使用されました。ここでは、60倍の倍率で水浸出目的、2mmの作動距離、および1のNAを選択した。
      2. 照明には最低 1 kW のピーク出力を持つストロボライトを使用し、顕微鏡とカメラの間のチューブレンズを使用して、できるだけ少ない周囲光が高速カメラのセンサーに到達するようにします。
      3. 単一のマイクロバブルに焦点を当て、リアルタイムイメージング用の光学および音響システムのアライメントを行う場合は、調光可能なハロゲン光源を使用します。
   2. 音響システムの組み立て
      1. プログラム可能な任意波形発生器とパワーアンプ(56dBゲイン)を使用して、滑らかなエンベロープと波形でトランスデューサを駆動します。オシロスコープを任意波形発生器に接続して信号を確認します。パーソナルコンピュータを任意波形発生器に接続し、社内で書かれたスクリプトを使用して、受信する音響圧力波をプログラムします。
      2. パルス/遅延発生器をマスタートリガとして使用し、光システムと音響システムを同期させます。パルス/遅延発生器とカメラソフトウェアにトリガ遅延を設定し、超音波波が気泡に到達できるように、超音波伝送後に16 μsの記録が開始されるようにします。記録開始前に光源を1.5 μsトリガーし、バブル振動中の適切な照明を確保します(タイミング図については 図3B を参照)。
      3. 適切な中心周波数を持つ適切なトランスデューサを選択します。水浴の開口部に置き、試料ホルダー膜からの反射を最小限に抑え、立ち波形成を低減するために、光軸に対する角度になるように配置する。
         注:ここでは、2.25MHzの中心周波数を有する単一要素の集光型浸入変換器、焦点距離1"、および0.75"の要素直径を、光軸に対して35°の角度で配置しました。伝達機能の較正は、音響システムで使用されているのと同じアンプを使用して行う必要があります。超音波送信周波数の関数として光ファイバーハイドロフォンを使用してトランスデューサの電圧振幅から圧力振幅への転送関数を較正する。
   3. サンプルホルダーの選択
      1. 光学的および音響的に透明な膜を備えたサンプルホルダーと、同じサンプル内の複数の単一のマイクロバブルのイメージングを可能にする大きさの大きさを使用します。
         注:ここでは、体積10mL、膜領域25cm2、膜厚175μmの細胞培養カセットを使用しました。下膜の音響反射、顕微鏡の目的と上膜によって反射された波からの干渉により、その場合の音響圧力は任意の波形発生器でプログラムされるものとは異なる場合があります。サンプルホルダー膜に対して角度でトランスデューサーを配置すると、立ち波形成が減少しますが、膜からの反射を増加させることができます。
      2. サンプルを完全に沈め、トランスデューサと顕微鏡の目的の両方の焦点内に持ち込むことができることを確認してください。3Dマイクロポジションステージに取り付けられたアルミニウム・サポートを使用して、サンプルホルダーを独立して移動します。
   4. 光学系と音響システムのアライメント
      1. 3D 変換でセットアップを調整するには、水浴を XY 変換ステージに取り付け、実験中に移動しないように、ステージを光学表に取り付けます。その後、水浴に水を満たし、調光可能なハロゲン光源をオンにします。アライメント中に、顕微鏡の目的を側面に移動して、超音波反射を防止します。
      2. サンプルホルダーアームにニードルハイドロフォン(0.2mm)を取り付け、目的の視野に先端を置いて水浴に針ハイドロフォンを置きます。アンプと任意の波形発生器をオンにします。5~10回の超音波サイクルの単一パルスと15Hzのパルス繰り返し周波数を使用します。最大圧力振幅に達するまで、タンクをXY方向に、針をZ方向に移動します。
      3. マイクロスコープの焦点を合わせて、ハイドロフォンの先端に再び焦点を合わせます。
         注:このプロトコルは顕微鏡焦点とトランスデューサの焦点の間の位置合わせを保障する。位置合わせ後に顕微鏡とトランスデューサの位置を変更しないでください。
   5. サンプル準備
      1. サンプルソリューションを準備するために、ステップ2.1.1.1から2.1.1.3を繰り返します。バブル溶液を希釈してシングルバブルイメージングを可能にし、隣接する気泡の音響相互作用を排除します。
      2. サンプルホルダーの出口を開きます。シリンジを使用して、サンプル溶液を完全に充填するまでサンプルホルダーの他の開口部に注入します。超音波分野との不要な相互作用を防ぐために、サンプルホルダーの内側に気泡がないことを確認してください。
      3. サンプルホルダの両方のバルブを閉じ、サンプルホルダーを光軸に垂直に配置します。
         注:充填されたサンプルホルダーレベルを保ち、移動中に泡がサンプルホルダーの片側に移動するのを防ぎます。
   6. イメージングプロトコル
      1. 前述の社内書き込みスクリプトを介して任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧力をプログラムします。
         注:ここでは、音響圧力波は、8サイクルガウステーパーパルスで、40サイクルの単一のバーストでした。これらの実験で使用された超音波周波数は、1MHz、2MHz、または3MHzで、81kPaから1200kPaまでの音響圧振幅を有する。
      2. 顕微鏡の焦点に単一のマイクロバブルを見つけるために、XYZステージを使用してサンプル溶液を含むサンプルホルダーを移動します。サンプルホルダーの隅にある視野から始めて、マイクロバブルの端がはっきりと見え、焦点を合わせられるようにします(理想的なカメラビューの 場合は図3C を参照)。
      3. 以前ハロゲン光に接続されていた光ファイバの端部をストロボライトに取り付け、もう一方の端が水浴に接続されるようにします。録音をトリガーします。
      4. ステップ 2.2.6.2 ~ 2.2.6.3 を超音波設定ごとに必要な回数だけ繰り返し(周波数と音響圧力)、マイクロバブルを含む細胞培養カセットを前の場所から少なくとも 2 mm (焦点面) から移動して、これまでの実験で視野のマイクロバブルが不変にならないようにします。
         注:ここでは、各実験を~20回繰り返しました。サンプルホルダ全体がゾンフィスされたら、サンプルホルダーを空にし、その後の実験のために新鮮なサンプル溶液で補充します。
   7. データ分析
      1. プログラミング環境を採用し、研究課題に応じたデータ解析を行い、画像処理後にエッジ検出を行います。画像領域の特性を測定する関数を使用して、各気泡の周囲のバブルの中心と強度プロファイルの導体を見つけ、気泡の輪郭(したがって、気泡半径 R)を検出する。単一のマイクロバブルの時間の経過とともに半径から関連するパラメータを抽出します。
         注: 本研究では、単一のマイクロバブルの記録を二項化およびフィルタリングするための画像処理にプログラミング環境が使用されました。社内スクリプトを使用して、各バブルの周囲の強度プロファイルの微分を見つけます。
3. 蛍光顕微鏡
   1. 光学系の組み立て
      1. 2.2節で説明する明視野顕微鏡で使用されているのと同じベースで、蛍光顕微鏡のセットアップ(図4A)を構築します。
         注: セクション 2.3 で説明されているセットアップは、セクション 2.2 で明視野顕微鏡で説明されている設定と組み合わせることができます。蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡の両方を組み合わせることで、ナノ粒子放出をイメージングしながらマイクロバブルガスコアを可視化することができます。
      2. 128 フレーム (256 μs) の場合、高速カメラを秒あたり 500,000 フレーム (400 x 250 ピクセル) で録画するように設定します。
         注:光強度は蛍光で制限されており、粒子送達が発生するタイムスケールが気泡ダイナミクスよりも長いため、イメージング時間は明視野実験よりも長くなります。
      3. 十分な光を供給するのに十分な高いパワーを持つレーザーを選択し、適切な励起波長を有し、サンプルの漂白を避けるためにアクロス視変調器と結合されていることを確認します。
         注:この研究では、532nmの励起波長を有する5W連続波レーザーを使用して、ナノ粒子の蛍光を励起した。
      4. レーザーと顕微鏡の目的との間にビームスプリッター、二色性ミラーおよびノッチフィルターを配置し、蛍光放射をカメラに到達させながら、励起光をサンプルに向けます。
   2. 音響システムの組み立て
      1. マイクロバブルを起こすためには、セクション 2.2.2 と同じ音響セットアップを使用します。これらの特定の実験でトランスデューサを単一要素に変更し、中心周波数2.25MHzの集焦点浸変換器、焦点距離1.88"、および要素直径1"に変更します。光軸に対して35°の角度で配置して、サンプルホルダー膜からの反射を最小限に抑え、定在波形成を低減します。
   3. 光学系と音響システムのアライメント
      1. セクション 2.2.4 で説明されている手順を繰り返します。
   4. サンプル準備
      1. セクション 2.2.5 で説明されているようにサンプル ソリューションを準備します。
   5. イメージングプロトコル
      1. 前述の社内書き込みスクリプトを介して任意波形発生器に所望の超音波駆動周波数と音響圧振幅を設定します。
         注:ここでは、音響圧力波は、10サイクルのガウステーパーパルスを備えた140サイクルの超音波の単一のバーストとしてプログラムされました。一般に、バブルダイナミクスの研究に必要なものと比較して、バイオ効果を誘導するためには、より長いパルス持続時間が必要です。これらの実験で使用された超音波周波数は、1MHz、2MHz、または3MHzで、81kPaから1200kPaまでの音響圧振幅を有する。
      2. パルス/遅延発生器で、記録中のマイクロバブルからのナノ粒子の蛍光励起用のレーザーのトリガ遅延を設定します。
         注:これらの特定の実験では、トリガ遅延は20 μs~170 μsで、合計150 μsの時間でした。タイミング図を 図4Bに示します。
      3. 顕微鏡の焦点に単一のマイクロバブルを見つけるために、XYZステージを使用してサンプル溶液を含むサンプルホルダーを移動します。サンプルホルダーの角の視野から始めます。マイクロバブルのインターフェースがはっきりと見え、焦点を合わせている理想的なカメラビューについては、 図4C を参照してください。録音をトリガーします。
      4. ステップ2.3.5.3を超音波設定ごとに所望の回数だけ繰り返し(周波数および音響圧力)、マイクロバブルを含む細胞培養カセットを以前の位置から少なくとも2mm(光学面)から移動させ、これまでの実験で視野内のマイクロバブルが超音波処理されないようにする。
         注:この研究では、各実験を~10~20倍に繰り返しました。サンプルホルダ全体がゾンフィスされたら、サンプルホルダーを空にし、その後の実験のために新鮮なサンプル溶液で補充します。実験の間にサンプルホルダを移動する距離は、音響ビームサイズによって異なります。
   6. データ分析
      1. 研究課題に従って蛍光顕微鏡記録を分析します。マイクロバブルごとに、蛍光顕微鏡実験でナノ粒子の送達が起こったかどうかを視覚的に判断する。ガスコアからサンプルホルダー膜へのナノ粒子の剥離および堆積が単一のマイクロバブルに対して観察された場合、プログラミング環境で発生したその送達を手動で入力する。

3. 生体内顕微鏡

1. 下皮折り窓室手術(前に説明^した26,47,50)
   1. 窓チャンバーを配置する前に1週間動物を順応させます。雌マウスと雄マウスの両方を使用することができ、年齢は重要ではないが、マウスの体重が少なくとも22〜24gであることを確認して、皮膚が十分に柔軟になるようにする。
   2. 術中および術後鎮痛治療を用いて全身麻酔下で手術を行う。フェンタニル(0.05 mg/kg)/メデトミジン(0.5mg/kg)/ミダゾラム(5mg/kg)/水(2:1:2:5)の皮下注射で動物を10g重量当たり0.1mLの用量で麻酔する。動物の体温を維持するために加熱パッドまたは加熱ランプを使用してください。
   3. 皮膚が窓チャンバーの2つの対称的なポリオキシメチレンフレームの間に挟まれるように、動物の背中の皮膚の二重層を優しく引っ張ります。二重皮層を通って伸びる2つのねじを置き、部屋の上端に沿って縫合することによってチャンバーを固定する。
   4. 皮膚の片側のチャンバーの円形フレーム内の皮膚を取り除きます。皮膚を取り除くフレーム内に直径11.8mmのカバーガラスを置き、組織に窓を形成します。
   5. 麻酔を終了させる解毒剤として、10gあたり0.1 mLの用量で、アトペマゾール(2.5mg/kg)、フルマゼニル(0.5mg/kg)、水(1:1:8)の皮下注射を使用してください。一晩加熱回収ラックに動物を置きます。25 mg/mL のエンロフロキサシンで動物の水を補い、外科現場での感染を防ぎます。
2. 腫瘍モデル作成
   1. 癌細胞を37°Cで、適切な培養培地中の5%の_CO2 雰囲気で、10%のウシ胎児血清と100U/mLペニシリンと100mg/mLストレプトマイシンを補充します。
      注:ヒト骨肉腫(OHS)細胞株はこのプロトコルで使用されましたが、他の細胞株も使用することができます。
   2. ステップ3.1.5の翌日に、イオフルラン(誘導時に5%、メンテナンス中に1〜2%)で動物を数分間麻酔する。カバーガラスを取り外し、30μLの細胞培養培地に5×¹⁰⁶ 個のがん細胞を塗布し、カバーガラスを交換します。
   3. 腫瘍をイメージング前に2週間増殖させ、この期間中に週に少なくとも3回、動物の体重と健康状態をモニタリングする。
3. 光学系の組み立て
   1. 超音波治療中に(前の研究²⁶で説明したように)、懸害のある研究課題に応じて適切な顕微鏡と目的で、生体内イメージングを行います。実験用セットアップの概略図については 、図 5A を参照してください。
      注:この特定の実験のために、20x水浸しの目的(1.0のNAおよび2mmの作動距離)および脈打つレーザーを装備した多光子顕微鏡が使用された。画像は、400 x 400 ^μm2の視野を持つ31フレーム/秒(512 x 512ピクセル)で共振スキャンモードで取得されました。励起波長は790nmであった。2つのガリウムヒ素リン化検出器の前のフィルターは、蛍光の検出のために590nmのロングパス590nmおよびバンドパス525/50nmであった。
4. 音響システムの組み立て
   1. 適切な超音波トランスデューサを導波管(カスタムメイド)に取り付け、光軸に対して45°の角度で目標の下に配置し、下面皮折り窓室のカバーガラスからの反射を最小限に抑え、立ち波形成を低減します。導波管に蒸留水と脱気水を入れます。導波管の上に超音波カップリングゲルを塗布します。
5. 光学系と音響システムのアライメント
   1. 超音波の焦点に光軸を合わせます。目的の焦点に光ファイバーハイドロフォンを配置します。次に、アンプと任意波形発生器をオンにして、パルス繰り返し周波数100Hzの短いバースト(5〜10サイクル)でトランスデューサを励起し、オシロスコープのハイドロフォン信号で最高圧が検出された位置に超音波トランスデューサを移動します。
      メモ:位置合わせ後にトランスデューサの位置を変更しないでください。
6. イメージングプロトコル
   1. 導波管と目的の間のXY位置決め段階に接続された加熱された動物のホルダー(カスタム設計)を置き、さらにカップリングゲルを加えます。動物を麻酔し、尾静脈カテーテルを置きます。加熱されたホルダーにマウスを置き、ホルダーに窓チャンバーを固定します。窓の部屋のカバースリップの上に水滴を加え、腫瘍組織をイメージするために目的を所定の位置に動かします。
   2. 図5B は、事象の順序を示す実験のタイミング図を示す。蛍光標識された2 MDaデキストランを静脈内(30μL、生理食塩水で希釈した4mg/mL)を注入して血管構造を可視化し、XY翻訳段階を使用してマウスを動かし、適切な血管を持つ位置を見つけます。超音波治療の前にベースライン画像を記録します。画像化する顕微鏡や染料の詳細や研究課題に応じて、フレームレート、視野、記録の長さを調整します。
      注:これらの実験では、400 x 400 ^μm2の視野で毎秒31フレームを記録し、5分間連続的にイメージングを行いました。
   3. 任意の波形発生器に所望の超音波駆動周波数、パルス長、音響圧振幅を設定します。
      注:これらの実験では、1MHzの周波数を使用し、パルス長は10 ms、陰圧振幅は0.2 MPa~0.8 MPaの間で使用されました。0.5 Hzまたは0.1 Hzのパルス繰り返し周波数を使用して、新しいマイクロバブルが超音波パルス間の処理領域に再浸透することを可能にしました。
   4. 50 μL マイクロバブル(2 × ¹⁰⁸ ~5 × ¹⁰⁸ マイクロバブル/mL)を静脈内に注入し、²⁶に記載されているように、イメージング中に超音波を適用します。
7. データ分析
   1. 研究課題に応じて、(オープンソース)画像処理ソフトとプログラミング環境を用いて画像を分析し、ⁱⁿ²⁶で述べ、血管パラメータ(直径、分岐、流速、方向)、血管内のナノ粒子の蓄積、および運動およびデキストランおよびナノ粒子の腫瘍組織への外挿の深さなどを決定する。

Results

このマイクロバブルは、プロトコルに記載されているように、様々な顕微鏡法を用いて、様々なタイムスケールで分析した。

共焦点顕微鏡におけるナノ粒子の蛍光(図6A)は、シェルが不均一な粒子分布を有することを示す。他の顕微鏡法は、気泡特性評価に使用することができます。例えば、 図6B は、前の研究³⁴で示したように走査型電子顕微鏡を用いたマイクロバブルの全体構造を示す。

放射状動態および表現性気泡挙動は、マイクロバブルを毎秒1000万フレームで画像化した in vitro の明視野顕微鏡法を用いて研究することができる。単一のマイクロバブルの半径は、社内で書かれたスクリプトを使用して時間の経過とともに抽出されました。このような放射状応答の例を 図 7 に示す。

典型的な成功したナノ粒子の送達のイメージシーケンスは、セクション2.3.6で説明されているように、 図8Aに示されている。マイクロバブルシェルに埋め込まれたナノ粒子は、レーザー光が気泡に到達すると蛍光のために点灯することが分かる。超音波の沈着によって駆動され、蛍光ナノ粒子は、マイクロバブルのガスコアから剥離し、サンプルホルダーの膜上に堆積する。最後に、レーザーがオフになり、蛍光ナノ粒子が励起されなくなりました。マイクロバブルの蛍光標識ペイロードの配信に失敗すると、通常、 図8Bに示す画像シーケンスのように見え、蛍光ナノ粒子は超音波暴露中にそのまま残るマイクロバブルの殻に点灯する。

超音波中のリアルタイムの生体内多光子顕微鏡検査は、血液中のナノ粒子挙動に対する超音波およびマイクロバブルの影響、腫瘍血管の透過性の増強、およびナノ粒子の送達の改善を調査するために使用された。音響圧力、周波数、およびパルス長さの関数として細胞外マトリックスへの浸透の程度と運動は特徴付けることができる。超音波処理の効果は、血管の大きさおよび形態に関して、そして結果として生じる気泡の閉じ込めに関して異なる場合がある。超音波治療が血流と方向にどのように影響するかを決定することができます。時間の経過に関するナノ粒子の外挿を示す実験例を、^0.826のメカニカルインデックス(MI)で図9に示す。生体内多光子顕微鏡の結果は、超音波暴露中のナノ粒子の空間的および時間的な空洞化を解明し、ナノ粒子の超音波介在性の基礎となるメカニズムを完全に理解し、そのような技術を最適化するために非常に有益である²⁶。

図1:変性カゼインにおける蛍光標識ポリマーナノ粒子のシェルを有するマイクロバブルの概略図。マイクロバブルは、通常、直径1 μm~10 μm です。ナノ粒子は、直径が100nm~200nm38の間にあります。略称: _C3F8 = パーフルオロプロパンガス.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:明視野、蛍光、共焦点、および生体内顕微鏡に関連する時間と長さの尺度を示す概略図の概要。

図3:明視野顕微鏡実験の模式図表現(A)実験用セットアップ、(B)タイミング図、(C)典型的な記録されたフレーム。スケールバー (C) = 10 μm省略形: fps = 1 秒あたりのフレーム数。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:蛍光顕微鏡実験の模式図 (A)実験用セットアップ、(B)タイミング図、および(C)典型的な記録されたフレーム。スケールバー (C) = 10 μm省略形: fps = 1 秒あたりのフレーム数。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:生体内顕微鏡実験の模式図表現(A)実験設定、(B)タイミング図、および(C)典型的な記録されたフレーム。スケールバー(C)= 50 μm緑はデキストラン-FITCに対応し、赤からナノ粒子に対応します。略語: GaAsP = ガリウムヒ素ホスフェド.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:単一のナノ粒子及びタンパク質安定化マイクロバブルの3D構造(A)共焦点顕微鏡を用いてナノ粒子を示し、(B)走査型電子顕微鏡を用いて3D構造を示す。(B)は³⁴から許可を得て複製されています。スケールバー (A) = 5 μm;スケールバー(B)=2 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:2.89μm半径ナノ粒子とタンパク質安定化マイクロバブルの典型的な球状振動は、超音波周波数1MHzで内振し、音響圧振幅142kPa(A-D)の高速記録と時間曲線(下)の対応する気泡半径の画像である。スケールバー = 5 μm、赤い線は初期半径を示します。照明プロファイル(任意の単位)は黄色で示されます。倍率は120倍です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:高速蛍光顕微鏡からの画像配列(A)ナノ粒子とタンパク質安定化マイクロバブルの蛍光標識ナノ粒子の導入に成功し、超音波周波数2MHzで、音響圧振幅600kPaでの超音波処理を行った。(B)ナノ粒子とタンパク質安定化マイクロバブルの蛍光標識ナノ粒子の分娩に失敗し、超音波周波数2MHzで、音響圧振幅は210kPaである。スケールバー= 10 μm倍率は120倍です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図9:ナノ粒子およびタンパク質安定化マイクロバブルを超音波周波数1MHzで、音響圧振幅800kPaでのインソネーション後の生体内顕微鏡検査 (A)血管内のナノ粒子、および(B)(A)の白い破線二乗で示される領域の画像配列(A)デキストラン(緑色)およびナノ粒子(赤)スケールバー= 50 μm倍率は20倍です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

マイクロバブルの表面から周囲の媒体へのナノ粒子の送達における様々なステップに関する情報を得るために、異なる光学顕微鏡法を組み合わせて得た。気泡振動のイメージングを行い、また、気泡殻からのナノ粒子の放出のイメージング、飛び出し、 および生体内の腫瘍の細胞外マトリックスを通る浸透を行った。 インビトロ イメージングは、より複雑な in vivo セットアップと比較して、多くの超音波パラメータのスクリーニングを可能にします。イメージングモダリティのこの範囲を組み合わせることの利点は、異なるタイムスケールで得ることができる補完的な情報です - 正常な配信のためにマイクロバブルを特徴付け、最適化し、治療効果を得るために重要な機能。このアプローチは、蛍光標識されたナノ粒子と薬剤を含む全てのマイクロバブルの送達メカニズムを理解するのに役立ちます。

単一のマイクロバブルを研究するために使用される顕微鏡法の中で最も重要なステップは次のとおりです。蛍光顕微鏡では、ナノ粒子を蛍光標識して、粒子放出の可視化を可能にする必要があります。さらに、サンプル溶液は、共焦点、明視野、蛍光顕微鏡法で分析するために単一のマイクロバブルを分離するのに十分に希釈する必要があります。さらに、超音波駆動周波数と音響圧力を選択して、気泡を最も効率的に励起することが重要です。研究の質問がナノ粒子ペイロードの送達に関する場合、適切な超音波パラメータは調査の一部であるべきです。共鳴の次に、これらの気泡は、ナノ粒子放出の閾値を超えて、典型的には比較的高い音響圧力振幅(MI >0.3)⁵¹で駆動する必要があります。明視野顕微鏡イメージングの場合、モーションブラーを最小限に抑え、エイリアシングを回避するために、十分に高いフレームレートの高速カメラを選択することが重要です。

明視野顕微鏡は、主に利用可能な光源のイメージングフレームレートと強度によって制限され、高いフレームレートはバブルダイナミクスに対してより詳細な時間分解的な洞察を与えるが、より短い露光時間のためにより強い照明を必要とする。粒子放出をより詳細に研究するために、蛍光イメージング用のフレームレートは、原則として、レーザー光の強度を増加させることによって増加させることができる。しかし、蛍光標識マイクロバブルによる高強度レーザー光の吸収は、高量子収量染料を有しても熱を発生させる。この熱は、危機に瀕している実験を妨げ、極端な場合には、光熱キャビテーション⁵²を誘発する可能性があります。したがって、実際には、適用されたレーザーフルエンスには限界がある。しかし、強烈なレーザー照明は、リポソーム⁵³からの粒子放出を誘導するために意図的に使用することもできる。温度は、気泡の種類⁵⁴に応じて、気泡のダイナミクスと超音波応答に影響を与えます。したがって、 in vitro およびインビタルメソッドを客観的に比較する場合、プロトコルで議論されている in vitro 方法は、37°Cで行われるべきである。 現在の論文で議論されている in vitro 法のもう一つの制限は、マイクロバブルがサンプルホルダー膜の下に浮かぶので、気泡が自由場環境になれないことを示しています。さらに、単一のマイクロバブルを撮像する場合の選択バイアスがある。しかし、単一の気泡に対して繰り返し実験を行うことで、交配因子のサイズ分布の大きさと除去の効果を調査することができます。気泡の反応が大きさの関数として理解できれば、気泡と気泡の相互作用を防ぐために濃度が高すぎないようにしながら、任意の気泡群の応答を計算することができる。最後に、明視野と蛍光顕微鏡の両方の方法は、2次元(2D)画像に畳み込まれたマイクロバブルに関する洞察を提供します。研究の質問が2Dイメージング以上を必要とする場合、プロトコルで説明されている設定とマルチプレーン^imaging55のサイドビューセットアップを組み合わせることで、気泡の3D挙動を解決することができます。

マイクロバブルを研究する別の方法は、音響特性⁵⁶である。しかし、単一のマイクロバブルのエコーを測定するには、超音波^beam56内の単一のマイクロバブルを見つけて隔離する必要があり、これは通常、狭いチューブまたは光学または音響ピンセット^57,58の使用によって取り組む課題を提起する。気泡を音響的にサイズ設定するために、マイクロバブルは、体積マイクロバブル振動⁵⁹を誘導しない共振周波数よりもはるかに高い周波数で幾何散乱体に内在することができる。「音響カメラ」の使用は、超音波に応答して単一のマイクロバブルの放射状ダイナミクスを画像化するそのような方法であり、そこで高周波超音波プローブは、低周波駆動波⁶⁰に対する気泡の放射状応答を決定するために使用される。この方法の欠点は、マイクロバブル半径の相対的な変化を決定するためにのみ使用できることです。したがって、光イメージング^61,62を介して絶対気泡半径を決定するために別の方法が必要^です。マイクロバブルが共振周波数より高い周波数で超音波に曝される方法の欠点は、このような高周波では、浸透深度が⁵⁹減少し、生体内アプリケーションの使いやすさが制限される点である。顕微鏡の他の形態は、走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、透過型電子顕微鏡検査^などのマイクロバブルの研究にも使用できる。しかし、これらの代替顕微鏡手法の達成可能な時空間的解像度は、一般的により限定的であり、これらの技術は、非回線解析によって超音波暴露の前後にイメージングが行われ、典型的には低スループット⁶³を提示するという欠点を有する。別の代替方法は、光散乱法を使用して、単一のマイクロバブルの放射状ダイナミクスをリアルタイムで研究するために使用することができるが、音響散乱法⁶⁴と比較して低い信号対雑音比を有する。

超音波暴露中のリアルタイムの生体内顕微鏡検査は、超音波暴露中に血管系、マイクロバブル、ナノ粒子、または他の分子(この場合はデキストランなど)に関する新しい洞察を得るための強力な方法です。リアルタイムの生体内顕微鏡を行う場合の一般的な制限は、組織の小さな領域のみが画像化され、光の組織への浸透深さが限られているということです。画像化された血管が視野内に微小な気泡やナノ粒子をほとんど含まない場合、ナノ粒子の挙動や外挿に関する情報はほとんどあるいはまったく得られない。さらに、視野が限られているため、光と超音波の経路の間の適切な位置合わせが重要です。超音波圧力が気泡破壊を誘発するのに十分高い場合は、新鮮な気泡が超音波パルス間の視野に再浸透することを可能にするパルス繰り返し周波数を選択することも重要です。また、超音波は、窓室および目的のカバーガラスから反射されるように、角度でトランスデューサを配置することは、校正された圧力場を歪める定在波の形成を防ぐために反射を減らすために重要である。もう一つの実用的な問題は、セットアップが顕微鏡のセットアップで目標の上または下に超音波トランスデューサと導波管を取り付けるのに十分なスペースを持っている必要があるということです。後部窓室の腫瘍は、閉じ込めチャンバーとカバースリップのために限られた厚さを有する。ただし、必要に応じて、他のモデルを使用することができます。例えば、皮膚折り造りの腫瘍、例えば、乳腺脂肪^pad65 または腹部の様々な器官⁶⁶における腫瘍の腹腔内の活性化物イメージングである。このような腫瘍は、適切な微小環境下で交所的に増殖することができ、そのように、より臨床的に関連する症例を提示する。

本研究で説明する方法は、蛍光標識されたマイクロバブルの可能性を明らかにし、気泡および超音波を用いた薬物送達用途の基礎を研究する。顕微鏡法のこの組み合わせは、超音波の割り込みと関連する音響パラメータ空間に対するマイクロバブル応答に関する貴重な洞察を提供し、時間と長さのスケールの関連範囲にわたってマイクロバブルとペイロードの挙動の明確なビューを提示します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 MS/s デュアルチャンネル任意波形発生器 モデル 8026	Tabor Electronics		任意波形発生器 (プログラム可能)
2100 L	ENI		アンプ、窓室のセットアップに使用
2 MDa dextran	Sigma-Aldrich
33522 A	Agilent Technologies		任意波形発生器、窓室のセットアップ
A1R	ニコンインスツルメンツ		共焦点顕微鏡
ACE I	SCHOTT		調光可能 ACハロゲン光源
アチペマゾール	オリオン ファーマ		動物を目覚めさせる解毒剤
バイトリル	バイエル		エンロフロキサシン
BD ネオフロン 24 G	ベクトン ディキンソン &会社		尾静脈カテーテル
BNC モデル 575	Berkely Nucleonics Corporation		パルス/遅延発生器
Branson 2510 超音波クリーナー	Branson		超音波浴
チャネルスライド	Ibidi
CLINIcell 25	Laboratoires Mabio International		細胞培養カセット(容量10 mL、膜面積25 cm2、膜厚175 µm)
Cohlibri	Lightline		レーザー (5 W, 励起波長 532 nm)
DP03014 デジタル蛍光体オシロスコープ	テクトロニクス		オシロスコープ
フェンタニル	・アクタビス・グループ マウス
シ	シグマ・アルドリッチ		細胞培養培地用サプリメント
光ファイバー・ハイドロフォン	精密アライメントに使用される音響
フルマネジル	・フレゼニウス・カビ		動物を目覚めさせる解毒剤
加熱されたアニマルホルダー	カスタムデザイン		マウスがマウスのサイズに合う空洞にマウスを横向きに配置し、窓のチャンバーを平らに置き、両側にネジで固定するスチール製ホルダー。チャンバーの下には、トランスデューサーと皮膚との間の音響接触を確保するためのホルダーに穴があります。ホルダーは最高温度37°Cに加熱されます。C、および温度はマウスの直腸温度プローブからのフィードバックによって制御されます。ホルダーはXYポジショニングステージに取り付けられているため、動物を独立して動かして窓室のさまざまな領域を撮影できます
Hyper Vision HPV-X2	島津		ハイスピードカメラ
ImageJ	国立衛生研究所 ウィスコンシン大学光学・計算計装研究所	オープンソース画像処理プログラム
			水浸対物レンズ (倍率60倍、作動距離2mm)
MaiTai DeepSee	Spectra-Physics		Pulsed laser
MATLAB	Mathworks		プログラミング環境
メデトミジン	オリオン ファーマ		マウスの麻酔
ミダゾラム	アコード ヘルスケア限定		マウスの麻酔
Milli-Q	メルク		超純水
MVS 7010 高輝度キセノンストロボ	パーキンエルマー		ストロボライト
オリンパス-NDT C305	オリンパス		一振動子集束水浸トランスデューサー (中心周波数 2.25 MHz、焦点距離 1インチ、直径 1インチ)
NDT V304	オリンパス		単一要素集束浸漬トランスデューサ(中心周波数2.25MHz、焦点距離1.88インチ、直径1.25インチ)
ペニシリン	シグマ-アルドリッチ		動物に腫瘍を移植する前の細胞培養培地への添加
ペルフルオロプロパンガス	F2ケミカルズ
ロズウェルパーク記念研究所 1640	Gibco Thermo-Fisher		細胞培養培地
Safe-Lockチューブ	エッペンドルフ
ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich		動物に腫瘍を移植する前の細胞培養培地への添加
T 25 基本的な ULTRA-TURRAX	IKA 実験室技術		分散ツール
TDS 210	Tektronix		オシロスコープ、窓室のセットアップに使用
トランスデューサ	Precision Acoustics Ltd		使用ウィンドウチャンバーのセットアップ
U-TLU	オリンパス		チューブレンズ
VBA100-200	Vectawave		アンプ
ウィンドウチャンバー	カスタムメイド		ウィンドウチャンバーのセットアップに使用
XLUMPLFLN20 XW	オリンパス		20x 水浸対物レンズ
XY(Z) トランスレーションステージ	Thorlabs