アルツハイマー病マウスモデルにおける免疫蛍光染色によるアミロイドβ蓄積の検出

サマリー

アルツハイマー病の神経病理学において、最も重要な特徴の1つはアミロイドβの沈着です。このプロトコールでは、プラーク中のアミロイドβ蓄積を検出するための5×FADトランスジェニックマウスの免疫蛍光染色の方法について説明します。灌流、凍結切片、染色、定量のプロセスについて詳しく説明します。

要約

アルツハイマー病(AD)は、世界中で60〜70%の認知症の原因となっている神経変性疾患です。アルツハイマー病の特徴の一つは、脳内にアミロイドβ(Aβ)が蓄積していることにあることは間違いありません。Aβは、β-セクレターゼとγ-セクレターゼによるβ-アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解性切断から産生されます。病理学的状況では、APPのβ切断の増加はAβの過剰産生につながり、Aβプラークに凝集します。AβプラークはADの病理の特徴であるため、AD研究ではAβの量を検出することが非常に重要です。このプロトコールでは、Aβ沈着を可視化するための免疫蛍光染色法を紹介します。私たちの実験で使用したマウスモデルは5×FADで、これはヒトの家族性ADに見られる5つの突然変異を持っています。5xFADマウスの神経病理学的および行動的欠損は十分に文書化されており、Aβ病理を研究するための優れた動物モデルとなっています。5×FADマウスにおけるAβ蓄積を検出するための経心灌流、凍結切片、免疫蛍光染色、定量などの手順を紹介します。このプロトコルにより、研究者はADマウスモデルでAβの病理を調べることができます。

概要

アルツハイマー病(AD)は、世界中で60〜70%の認知症を引き起こし、多くの社会資源を消費する神経変性疾患^です1。アミロイドβ(Aβ)の蓄積がアルツハイマー病の病理学的特徴であることはよく知られています。アミロイド前駆体タンパク質(APP)は、多くの組織に存在する内在性膜タンパク質です。36-42アミノ酸²からなるAβペプチドは、その後の^APP3,4のβ-およびγ-セクレターゼの切断によって産生されます。APPの切断やAPP遺伝子の変異は、Aβの過剰産生につながります。Aβ分子は凝集してオリゴマーまたはフィブリルを形成することがあり、これらは神経毒性があると考えられています^5,6。これまでの研究では、Aβの蓄積は西暦^7,8,9年の神経細胞死と相関していることが示され^{ていました。}

5×FAD(C57BL/6J)トランスジェニックマウスは、 APPに3つの変異、 PSEN1に2つの変異を含んでいます。細胞内Aβの蓄積は、生後1.5ヶ月という早い時期に始まります。Aβの細胞外蓄積は、約2か月後に皮質と海馬で観察されました。蓄積は¹⁰歳とともに急速に増加しました。十分に文書化されたAβ病理学は、私たちのプロトコルの優れた動物モデルとなっています。

記載された染色法の目標は、ADマウスモデルの脳内におけるAβ沈着を可視化し、定量化することである。5×FADマウスにおけるAβ蓄積を検出するための経心的パラホルムアルデヒド灌流、凍結切片作製、免疫蛍光染色、定量化などの手順を紹介します。このプロトコールは、ADマウスモデルにおけるAβの病理を調べるための信頼性と簡便な方法です。

プロトコル

すべての実験手順は、徐州医科大学の動物管理・使用委員会の承認を得て、実験動物の管理と使用に関する中国政府規則のガイドラインに従って行われました。

1. マウスの灌流

注:灌流手順の詳細については、Wiliam Shainのラボ ¹¹のビデオを参照してください。

1. 腹腔内注射により、1% ペントバルビタールナトリウム (50 mg/kg 体重) を 5×FAD (C57BL/6J) トランスジェニック マウスに麻酔します^12,13。後足のつまみに対する反応の喪失は、適切な麻酔薬であることを示しています。マウスが適切に麻酔される前に灌流を開始しないでください。
2. 4本のピンを使用して、ポリフォームの板に手足を固定します。麻酔をかけたマウスの腹部を上向きに置き、手足を十分に伸ばします。虹彩はさみを使用して、剣状突起を切開します。その後、ダイヤフラムが露出します。
3. 手術用ハサミを使用して横隔膜を切開し、横隔膜の切開を胸郭の上限まで慎重に続けます。肋骨と胸筋を切断し、付着した組織を解剖して心臓を露出させます。
4. マウスの適切な心房を見つけます。虹彩ハサミで右の心房を切り開きます。
5. 心臓の左心室から37°C PBS(0.01 M、pH 7.2-7.4)を20 mL注入して血液を洗い流します。次に、左心室から室温の4%PFAを20mLゆっくりと注入して組織を固定します。PBSと4%PFAの注入速度は約5 mL/分です。固定振戦は数秒以内に観察されるべきです。.
   注意:4%PFAは目や気道を刺激し、アレルギー反応を引き起こす可能性があります。この手順は換気の良い場所で行う必要があり、オペレーターは安全ゴーグルとフェイスマスクを着用する必要があります。
6. 外科用ハサミを使用して頭を切り取り、解剖鉗子を使用して頭蓋骨を慎重に取り除き、脳を取り出します。次に、脳を5mLのプラスチックチューブに4mLの4%PFAを4mL浸し、4°Cで12〜24時間浸します。

2. 埋め込みと凍結切片

1. 4% PFAに固定した後、脳を4°Cの5 mLプラスチックチューブ内の4 mLの15%スクロースに移します。 12〜24時間後、脳は底に沈むはずです。
2. 脳を5mLのプラスチックチューブに入れた4mLの30%スクロースに4mL、4°Cで12〜24時間移します。その後、脳を埋め込む準備が整います。15%および30%のショ糖を段階的に浸す目的は、脳を脱水し、埋め込みおよび凍結切片中に細胞内に氷の結晶が形成されるのを防ぐことです。脱水した脳は、4°Cで1週間保存できます。
3. 脳を入れたスクロースを約1mLチューブに入れておきます。次に、同量の最適切断温度(OCT)コンパウンドをチューブに加え、適切に混合します。これにより、OCT化合物は脳をより十分に包み込むことができます。
4. OCTコンパウンドの厚い層をノブの表面に取り付け、-21°Cで凍結してから凍結切片化します。脳を中央から矢状に切り取ります。どちらかの半分をクライオスタットでの切片化に使用します。
5. OCTコンパウンドが固まったら、つまみを試験片ヘッドに取り付け、プラットフォームの表面にトリミングします。脳の半分をトリミングされた面に置き、中央を下にして置きます。
6. OCT化合物の漏れを避けるために脳の周りにアルミホイルリングを置き、次に脳が水没するまでリングをOCT化合物で満たします。OCTコンパウンドの包埋が固まると、切片化の準備が整います。
7. 切片の厚さを20μmに設定します。チャンバー温度を-21°Cに、試料ヘッド温度を-19°Cに設定します。 脳を吻側端から尾側端まで切片にします。
8. スライドガラスにPBSを塗ります。スライドガラスをポリリジンで事前にコーティングして、切片が剥がれるのを防ぎます。セクションをスライドにアタッチします。セクションが折りたたまれている場合は、柔らかいブラシを使用してPBSでセクションを広げます。
9. 切片を室温で一晩乾燥させ、-20°Cで保存します。 切片は、Aβ染色前に最大1ヶ月間-20°Cに保持することができます。

3. Aβ染色の手順

1. 切片を室温で温め、スライド表面を乾燥させ、疎水性ペンを使用して抗体インキュベーション用の切片の周りに円を描きます。
2. スライドをPBSに浸し、30 mLのプラスチック染色ボックスに入れてOCTコンパウンドを洗い流します。少なくとも20mLのPBSを使用してください。.
3. 凍結切片用の1x抗原賦活化溶液100 μLをスライド上に加えます。室温で5分間インキュベートします。
4. 回収溶液を少なくとも20mLの室温のPBSで3回(各5分間)洗浄します。
5. 希釈した一次抗体(6E10)を切片に添加し、湿った暗色のボックスで4°Cで16-24時間インキュベートします(一次抗体希釈溶液:1% BSA、0.3% Triton X-100、0.01% アジ化ナトリウム含有PBS、1:500希釈)。BSAはブロッキング剤として機能します。
6. 切片をPBSで3回、毎回5分間洗浄します。
   注意: 暗い場所で手順3.7、3.8、および3.9を実行します。
7. 切片を二次抗体溶液(ヤギ抗マウスIgG(H+L)Alexa Flour 594、PBS 1:200で希釈)の切片を室温で1時間、湿った暗い箱でインキュベートします。
8. 二次抗体を少なくとも20 mLのPBSで切片から3回、毎回5分間洗い流します。
   注意: セクションの剥がれを防ぐために、洗浄中にPBSをセクションに注がないでください。セクションを濡らしておきます。
9. 切片の周りの液体を吸収し、各切片に封入剤を滴下します。気泡を避けるために、セクションをカバーガラスで密封します。
10. 染色した切片を蛍光顕微鏡で観察します。導出を避けるために、イメージングパラメータを一定に保ちます。滑り台は4°Cの暗所に保管してください。染色は時間とともに消えるため、1週間以内に切片を分析してください。

4. ImageJによるAβ蓄積のイメージングと定量

1. デジタルカメラとイメージングソフトウェアに接続された蛍光顕微鏡で画像をキャプチャします。Image Pro Plusソフトウェアを使用し、イメージングパラメータを次のように設定しました:Exp Pvw:450 ms、Exp Acq:450 ms;Pvw:1 × 1、Acq:1 × 1;Pvw解像度:幅 1 × 高さ 1、解像度 1 (調整解像度): 幅 1 × 高さ 1;キャプチャ深度:8ビットモノラル。ゲイン:Pvw:13、Acq:13、Gamma:Pvw:1、Acq:1、Offse:Pvw:-700、Acq:-700。
2. ImageJ Fiji 2.0.0 (https://imagej.net/Fiji) で、[プラグイン] |ステッチ |メニューにMosaicJ 。次に、[ ファイル] |[画像シーケンスを開く] をクリックして、ステッチする画像を開きます(図1A)。
3. 選択したすべての画像が下部に表示されます。画像を手動でステッチした後、[ ファイル] |モザイクを作成します (図1B、C、D)。
4. 画像を選択 |調整 |明るさ/コントラスト...、画像の明るさとコントラストを調整します(図3A)。その後、画像を保存できます(図1E)。
5. Aβの蓄積を定量化するには、 File |開ける。。。 メニューにあります(図2A)。
6. 画像を選択 |タイプ |8ビット:画像を8ビットに調整します。次に、ポリゴン選択を使用してカウントする領域を選択します(図2B)。
7. 画像を選択 |調整 |[Threshold] は、シグナルの適切なしきい値を選択します。しきい値は、スクロールバーをドラッグして調整するか、テキストボックス内で直接数値を変更できます(最大:255、最小:0)。セクション内のすべてのAβ信号が赤くなった場合、しきい値は測定に適しています(図2C)。[暗い背景]ボックスがオンになっていることを確認します。
8. [ 分析] |測定を設定... をクリックして、結果に表示されるパラメータを選択します。 [Integrated density ] と [Limit to Threshold ] が選択されていることを確認します。 積分密度 (全強度)が測定のターゲットです(図2D)。
9. [ 分析] | 結果を得るために測定します。結果が表示され、統計分析の準備が整います(図2E)。

結果

上述の免疫蛍光染色法を用いて、異なる年齢の5×FADマウスにおけるAβ蓄積の沈着を調査しました。 図3 は、当社のプロトコルを使用した典型的な結果と最適でない結果を示しています。5ヶ月および8ヶ月のヘテロ接合体5×FADトランスジェニックマウスおよび4ヶ月から6ヶ月の野生型コントロールの脳切片を6E10抗体で染色し、蛍光顕微鏡で検出した。 図3A は、マウス脳の矢状切片のプラーク中のAβの蓄積を示しています。それらは主に皮質と海馬に沈着し、海馬の亜疎に最も高い密度があり、これは以前の研究^{と一致しています10}。画像が示すように、5×FADマウスでは、抗体によってAβの蓄積が明確に検出されました。積分密度 (積分密度 = 面積 × 平均。積分密度:この領域の蛍光強度の合計。平均:特定の領域の平均蛍光強度。面積:8m 5×FADマウスにおけるAβ蓄積の正の蛍光シグナルの面積)は、5m 5×FADマウスよりも有意に高かった(不対応学生のt検定、p = 0.0071)ことから、Aβ...

ディスカッション

6E10抗体を用いた免疫蛍光染色は、脳内のAβ蓄積を特異的に検出することができ、Image Jで容易に定量化することができます。注目に値するのは、このプロトコルのいくつかの重要なステップが結果に影響を与える可能性があることです。

図3Cに示されているスライスの剥がれや破損を防ぐために、いくつかの重要なポイントに注意する必要があります。灌流は、低酸素症によって引き起こされる不可逆的な病態生理学的影響のため、横隔膜を切開した後、急速に進行する必要があります。.これらの影響は、結果に大きく影響する可能性があります¹¹。凍結切片の前に、脳組織を適切に固定し、脱水する必要があります。クライオスタットの温度(チャンバー-21°C、試料ヘッド-19°C)を適切に設定し、カッティングブレードとアンチロールプレートの状況を確認する必要があります。カッティングブレードやアンチロールプレートにほこりや霜が付着しておらず、正しく配置...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔
注射器	KLMEDICAL		1 mL
ペントバルビタルナトリウム	Sigma-Aldrich	P3761	生理食塩水中 1% i.p. 注射
用<ストロング>開胸術:
アイリス-ファイン ストレート アイリスはさみ (~11.5 cm)	RWD	S12010-11
シャープカーブ手術用ハサミ(11.5cm)	RWD	S14016-11
ストレート解剖鉗子(~10.5cm)	RWD	F12010-10
Perfusion
遠心チューブ(5mL)	バイオシャープ
注射器	KLMEDICAL		20mL
パラホルムアルデヒド	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) 粉末	Vicmed	VC2001P	脱イオン水を加えて溶液
<強>固定、脱水、凍結切片を作る接着
顕微鏡スライド	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
Microtome Cryostat	LEICA	CM1950
最適な切断温度化合物(OCT)	Sakura Finetek	4583
ショ糖	VETEC	V900116
<強>免疫蛍光染色
蛍光顕微鏡	OLYMPUS	IX-81
ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 594	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	メディア サイバネティクス		サイフェクティフィック グラフ作成およびデータ分析ソフトウェア
免疫組織化学ウェットボックス (黒)	Sinylab	カスタマイズ	300 mm × 100 mm × 38 mm, 溝深さ 27 mm、標準スライド 10 枚を収納可能
ピペット	Thermo Scientific
ピペットチップ	Well-offer
プラスチック染色ボックス	Sinylab	カスタマイズ	30 mL、5つの標準スライドを含む
研究室		一次抗体希釈バッファー	1% BSA 1g、0.3% Triton X-100 300ul、0.01% アジ化ナトリウム 10mg 100ml PBS
精製抗ベータアミロイド、1-16 抗体 (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
冷凍用クイック抗原賦活化溶液セクション	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		医療用マッピングソフトウェア
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		科学グラフ作成およびデータ分析ソフトウェア