げっ歯類とヒト脳組織におけるアクチン重合状態評価のための時間効率の高い蛍光分光法ベースアッセイ

細胞骨格タンパク質アクチンは、構造的なサポート、細胞輸送、細胞運動性および分裂を含む複数の細胞機能に関与している。アクチンは、単量体球状アクチン(G-アクチン)と重合糸状アクチン(F-アクチン)の2つの形態で平衡状態で発生する。アクチンの重合状態の急速な変化(G-とF-の間の相互変換)は、迅速なフィラメントアセンブリと分解をもたらし、細胞生理学におけるその調節の役割の根本となる。アクチンは神経細胞骨格構造の主要な構成要素を形成し、広範囲の神経機能^1,2に影響を及ぼす。注目すべきは、アクチン細胞骨格はシナプス末端の構造プラットフォームの不可欠な部分を形成する。このように、シナプス形態形成および生理学の主要な決定要因であり、シナプス^3、4、5のサイズ、数および形態の制御において基本的な役割を果たしている。特に、動的アクチン重合脱重は、記憶および学習プロセスの基礎となるシナプス可塑性に関連するシナプスリモデリングの重要な決定要因である。実際、シナプス前(例えば、神経伝達物質放出^{6、7、8、9、10)}およびポストナプティック機能(可塑性関連動的リモデリング11、12、13、14など)の両方が^、アクチン細胞骨格の重合状態の動的変化に大きく依存する。

生理学的条件下では、F-アクチンレベルは、翻訳後修飾^4、15、16だけでなく^、アクチン結合タンパク質(AMP)4、17を含むマルチモーダル経路を介して動的^かつ緊密に調節される。AMPは、複数のレベルでアクチンダイナミクスに影響を与えることができ(例えば、重合の発芽または抑制、フィラメント分岐の誘導、フィラメントの小片への切断、脱重化の促進、脱重化からの保護など)、様々な細胞外および細胞内信号^18、19、20に敏感な厳格な調節制御の下にある。複数のレベルでのこのような調節チェックは、シナプス細胞骨格におけるアクチンダイナミクスの厳格な調節を指示し、基底および活動誘発状態の両方で神経生理学の前および後のナプティックな側面を微調整する。

神経生理学におけるアクチンの重要な役割を考えると、神経変性、心理疾患、神経発達疾患^{3、21、22、23、24、25、26、27}を含む神経疾患の広い範囲に関連する重要な病原性事象として^、アクチンダイナミクスの変化の証拠を提供したいくつかの研究が驚くべきことではない。しかし、神経生理学や病態生理学におけるアクチンの重要な役割を指摘する豊富な研究データにもかかわらず、アクチンダイナミクス、特にシナプス細胞骨格の理解には依然として大きなギャップが残っています。より多くの研究は、病理学的条件下での神経アクチンとその変化のより良い理解を持っている必要があります。.この文脈における主な焦点領域の1つは、アクチン重合状態の評価である。ウエスタンブロッティングベースの商用キット(G-アクチン/F-アクチン in vivoアッセイ生化学キット;細胞骨格SKU BK037^28,29)及びF-アクチンレベル⁶の評価のための自家製アッセイ。しかし、これらはF-アクチンとG-アクチンの生化学的分離を必要とし、その後の定量化は免疫ブロッティングプロトコルに基づいているため、時間がかかる可能性があります。我々は、F-アクチンの基底レベルの両方を評価するために使用できる修飾を用いて、以前の研究³⁰から適応した蛍光分光法ベースのアッセイと、その組立分解の動的変化を報告する。特に、1 mLキュベットに適したサンプルを必要とするオリジナルのプロトコルを、現在の96ウェルプレート形式に効率的に変更しました。したがって、改質されたプロトコルは、アッセイに必要な組織/サンプル量を大幅に減少させました。また、このプロトコルは、脳組織の均質化だけでなく、単離シナプス末端(シナプトソームおよびシナプトニューロソーム)などの細胞内分画にも適しているという証拠を提供する。最後に、このアッセイは、解剖されたばかりのげっ歯類の脳組織と長期保存された死後のヒト脳サンプルに使用することができる。注意すべきは、アッセイは神経細胞の文脈において提示されるが、それらに関連する他の細胞型および生理学的プロセスに好適に拡張することができる。

実験動物のケアと使用における倫理に関するオタゴ大学委員会の規則に従って、すべての実験的手続きが行われました(倫理議定書第1項。AUP95/18およびAUP80/17)およびニュージーランド議会。ヒト脳組織は、スペイン・バルセロナの病院クリニックIDIBAPSバイオバンクの神経組織銀行から得られた。すべての組織収集プロトコルは、病院クリニック、バルセロナの倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントは、家族から得られました。

1. バッファーおよび試薬の調製

1. 脳組織の均質化とシナプス末端の濃縮された分率の調製のために、次のバッファーを準備します。
   ホモジナイゼーションバッファー: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M スクロースを補った
   リサスペンションバッファー:5 mMトリス、pH 7.4 0.32 Mスクロースを補充
   洗浄バッファー: 5 mM トリス、pH 8.1
   1.2 Mスクロース
   1.0 M スクロース
   0.85 Mスクロース
2. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の自家製または商業的なミックスを追加します。
   注:完全なプロテアーゼ阻害剤ミックス(10 mLバッファーあたり1錠)とホスファターゼ阻害剤カクテルIV(1:100;ボリューム:ボリューム)のEDTAフリーバージョンを使用しています。
3. 以下のバッファーと試薬を準備して、ファロイジンの固定、透過性、結合を行います。
   クレブスバッファー: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl_2,2 mM CaCl_2,0.1 mM KH₂PO_4,5 mM NaHCO_3,10 mM グルコース, 20 mM HEPES, pH 7.4
   1 M KCl
   25% グルタルアルデヒド (ストック溶液)
   0.1 % トリトン X-100 および 1 mg/mL NaBH₄を含むクレブス バッファー
   400x アレクサフルオール 647 ファロイジンイン DMSO
   0.32 Mスクロースを含むクレブスバッファー
   50 μM ラトランクリン A イン DMSO (ストックソリューション)
   1 M KCl (ストックソリューション)
   注意:ファロイジンは有毒(LD₅₀ = 2mg / kg)であり、注意して取り扱う必要があります。グルタルアルデヒドの吸入は有毒であり、それはフームフードで処理する必要があります。
4. 長期保存のために-20 °Cで4°CおよびファロイドンおよびラトランクリンAで緩衝液を貯えてください。
   メモ: バッファの長期保存はお勧めしません。プロトコルはここで一時停止することができます。

2. 脳組織均質化

1. 陶芸器-エルベジェム ガラス管および氷上の害虫の均質化バッファーの10体積で凍結保存または分解されたばかりのラットの脳組織を均質化する。
   注:最適な均質化は、脳組織のために手で15〜20ストロークの害虫によって達成される。正常な均質化はガラス管を通る懸濁液の滑らかな流れによって確認することができる。プロトコルはここで一時停止することができます。
2. ブラッドフォードアッセイ³¹を用いてホモジネート中のタンパク質濃度を決定する。
   注:タンパク質推定のための代替自家製または商業アッセイも使用することができます。
3. 50 μLの体積で2-3 mgタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内の均質化サンプルを希釈します。
   注:いくつかの実験では、37°Cで2μMラトランクリンAまたはDMSO(コントロール)を1時間インキュベートします。このために、ホモジナートは48 μLのクレブスバッファに再懸濁され、2 μLの50 μMラトランクリンAまたは2 μLのDMSOが加えられました。さらに免疫ブロッティングのために、少量のサンプル(10 μg)をインキュベーション後に回収する。
4. ホモジネートサンプル(セクション5)を固定します。

3. 隔離された神経終末の準備

1. シナプトソームの調製
   注: シナプトソーム用の代替プロトコル^32,33も使用できます。
   1. 遠心分離機脳は、4°Cで10分間1,200xgでホモゲネートする。
   2. 粗核分画であるペレットを捨てる。
   3. さらに遠心分離機(S1)をステップ3.1で得た12,000xgで4°Cで15分間用いた。
   4. 上清(S2)を除去し、これは可溶性の細胞分画である。
   5. ステップ3.1.3で得られたペレット(P2)を再懸濁し、リサスペンション緩衝液中の粗シナプトソーム分画である。
      注:再懸濁液の量は、開始組織の量と得られるペレットの量に依存します。例えば、150〜300mgの脳組織で始まる場合、得られたペレットを200μLの再懸濁液バッファーに再懸濁させることができる。
   6. 0.85-1.0-1.2 Mショ糖の等しい量で作られた不連続なスクロース勾配に再懸濁された粗シナプトソームをロードします。
      注:我々は通常、スクロース溶液のそれぞれ1 mLを使用します (150-300 mgの組織のために).これは、より大きな組織量に応じて変更することができます。不連続勾配は、超遠心チューブの内壁に押し付けられた25Gシリンジとショ糖層の優しい層を使用して作ることができます。
   7. 遠心分離機は4°Cで2時間85,000xgで。
      注:遠心分離の高速のため、加熱を減らすために真空を作成することができる超遠心分離機が必要です。
   8. 200 μL のピペットチップを使用して、1.0 M と 1.2 M のスクロースの間のインターフェイスでシナプトソーム分画を収集します。
   9. シナプトソーム分率を氷冷洗浄バッファーで18,000 x gで10分間4°Cで10分間洗浄します。
      注:洗浄のために、1.0および1.2 Mのスクロースの界面で得られたシナプトソーム分画を新鮮な1.5mLチューブに集め、等量の洗浄バッファーを加え、培地から高いショ糖の除去を確実にする。
   10. シナプトソームペレットを、氷冷均質化バッファーで12,000 gで4°Cで10分間再度洗浄します。
   11. シナプトソームを氷上の均質化バッファーに再懸濁します。
       注: プロトコルはここで一時停止することができます。
   12. ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
   13. 50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度でクレブスバッファー内のシナプトソームを再中断する (シナプトソームが KCl によって脱分極化する場合は 47.5 μL; セクション 4 を参照)。
       注意:再懸濁のために、シナプトソーム分画は、最初に4°Cで5分間12,000 x gで紡球され、上清(緩衝液)が除去されます。シナプトソームペレットは、200 μL ピペットチップを使用して穏やかなピペッティングを行い、クレブスバッファーに再懸濁します。
   14. 脱分極を進めます(セクション4)。
2. シナプトニューロソームの調製
   注:シナプトニューロソーム用の代替プロトコル^34、35も使用できます。
   1. 1 mL シリンジを使用して、フィルターホルダーに 100 μm の細孔径のあらかじめ湿ったネットフィルターを通して脳ホモジネートを通過させます。
      注:すべてのフィルタの事前湿潤は、サンプルの損失を避けるために重要であり、均質化バッファを使用して行う必要があります。このために、ホモジナイゼーションバッファーは、バッファーが流出するまで1 mLシリンジを使用してフィルタホルダ内のフィルタを通過する。
   2. 氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F1)を集める。
   3. F1 分数に対して手順 (ステップ 3.2.1 および 3.2.2) を繰り返して、2 番目の濾過液 (F2) を取得します。
   4. 5 μmの細孔サイズのネットフィルターを通してF2の濾液を渡す。
   5. 氷の上に冷やされた1.5 mLチューブに濾液(F3)を集める。
   6. 遠心分離機はF3を1,500 x gで4°Cで10分間濾液する。
   7. 50 μLの体積で2〜3mgのタンパク質/mLの濃度で氷上のクレブスバッファー中のペレット(シナプトニューロソーム)を再懸濁する(シナプトソームがKClによって脱分極される場合は47.5 μL;セクション4参照)。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。
   8. ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質濃度を推定します。
   9. 脱分極を進めます(セクション4)。

4. 分離シナプス末端のKCl媒介脱分極化

1. シナプトソーム/シナプトニューロソームを37°Cで5〜10分間平衡化する。
2. 37 °Cで30 sの細胞外K⁺ を50mMに増加させ、それぞれの非刺激制御セットに等量のクレブスバッファーを加えるためにKClを加えることによってシナプトソーム/シナプトニューロソームを刺激する。
   注:例えば、クレブスバッファの47.5 μLに再中断されたシナプトソームに1 M KClの2.5 μLを追加します。各非刺激制御シナプトソームに2.5μLのクレブスバッファーを加えます。多数のサンプルが関与する実験では、脱分極時間が30sを超えないように、一度に2個以下のサンプルを使用して進めます。
3. グルタルアルデヒド(セクション5)を添加して刺激を終了する。

5. 試料の固定とファロイジン染色

1. 室温で2〜3分間の最終濃度2.5%にホモゲネート/シナプトソーム/シナプトニューロソームサンプルにグルタルアルデヒドを加えます。
   注:50μLサンプル(ホモジネート/シナプトソーム/シナプトニューロソーム)中のグルタルアルデヒドの最終濃度が2.5%になるように、25%グルタルアルデヒド溶液の6 μLを添加しました。固定は重要であり、速く、グルタルアルデヒドを添加した直後に、サンプルは激しく渦を流す必要があります。
2. サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。
3. 上清を取り除く。
   注:グルタルアルデヒドが有毒であるため、ヒュームフードに上清を捨てます。
4. 0.1%トリトンX-100と1 mg/mL NaHB₄ を含むクレブスバッファーの100 μLで室温で2〜3分間再懸濁してペレットを透過させます。
5. サンプルを20,000 x gで5分間沈めます。
6. パーメビル化バッファーを取り外します。
7. ペレットを200 μLのクレブスバッファーで200 μLで洗浄し、20,000 x g で 5 分間遠心分離します。
8. クレブスバッファーの100 μLで1x Alexa Fluor 647ファロビン(500 μUに対応)でペレットを再中断して、室温で暗く10分間染色します。
   注:他の種類の蛍光ファロイジンアナログは市販されており、アッセイ用に交換することができます。ファロイジンの濃度およびインキュベーションの総サンプル量は、検査対象の組織/サンプルの量と種類に応じて変更する必要があり、それに応じて最適な条件を標準化する必要があります。
9. 5分間20,000 x gで染色したサンプルを遠心分離します。
10. 非結合ファロイジン(上清)を取り除きます。
11. 200μLのクレブスバッファーでサンプルを20,000 x gで5分間遠心して洗浄します。
12. 0.32 Mショ糖を含むクレブスバッファの200 μLで再中断します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

6. 蛍光分析と光散乱

1. 黒い96ウェルの版でアレクサのFluor 647ファロジン染色されたサンプルを分配する。
2. 室温でプレートリーダーで645nmの励起波長と発光波長670nmの蛍光強度を測定します。
3. 200 μL ピペットチップを使用して、黒色の 96 ウェルプレートから透明な 96 ウェルプレートにサンプルを移します。
4. 540 nmで光散乱を測定し、固定、透過、染色の前のステップで発生した損失を修正します。
   注: 染色されたサンプルに保持される生物材料の変動は、少量の開始物質の場合より顕著である可能性があります(説明を参照)。
5. 異なる濃度(0.05x、0.1x、0.25x、0.35x、0.75x、0.5xおよび1x)の異なる濃度のクレブスバッファーにAlexa Fluor 647ファロイジンのセットを標準として含める。
   注:これはオプションのステップであり、特にF-アクチンレベルが相対的な方法で発現されている場合(セクション7)のアッセイの結果には影響しません。プロトコルはここで一時停止することができます。

7. データ分析

1. 試料中のF-アクチンの量は、結合ファロイジンの蛍光強度に直接比例する。タグ付きファロイジン標準の直線曲線から計算されたファロイジン結合の単位の絶対換算での発現。
   注: 例として、図 2A-B、3A、4A-B および補助図 2を参照してください。
2. コントロールサンプルの一部としてF-アクチンレベルを発現する。
   注: 例として、 図 5A-Bを参照してください。

F-アクチンレベル評価のためのアッセイの直線性
まず、Alexa Fluor 647ファロイジンの蛍光の線形上昇に対する標準曲線を確認し、実験の各セットについて繰り返し行った(図1)。アッセイの線形範囲を調べるため、げっ歯類とは異なる量の脳均質(図2Aおよび2B)および事後ヒト被験者(図3Aおよび3B)が処理された。アッセイは、保持された標識ファロイジンの量によって評価されるタンパク質の50〜200 μgの範囲で線形であることが判明した。540nmでの光散乱は、異なる量のサンプルを確認するために使用した(図2Cおよび図3C)。

ラトランクリン、アクチン脱重化剤は、標識されたファロイジンの結合を減少させる
ラトランクリンAはアクチンフィラメントを脱重し、F-アクチン36、37、38、39のレベルを低下させると知られている。齧歯類またはヒトの脳組織のいずれかからホモジネートを、アクチンフィラメントを脱重合するために37°Cで1時間、2μMラトランクリンAでインキュベートした。各未処理対照セットを、37°Cで1時間の同じ持続時間でDMSOでインキュベートした。 このアッセイは、対照サンプル中の95.7±6.6(平均±SEM)から、げっ歯類脳ホモジエートのラトランクリンA処理サンプル中の結合ファロイジンの72.0±3.2μU(平均±SEM)までのF-アクチンレベルの損失を強く測定した(図4A)。標識されたファロイジンの保持における同様の減少(83.7±3.9から66.9±4.2μU)も、ヒト脳組織からの均質化がラトランクリンA治療を受けた場合にも観察された(図4B)。注目すべきは、免疫ブロッティングによって評価される全アクチンレベルは、ラットンクリンAを用いてラット(補助図1A-B)およびヒト(補足図1C-D)脳ホモジネートでの治療で変化しなかった。

単離シナプス末端の脱分極はアクチン重合とフィラメント形成を刺激する
単離されたシナプス末端のエキサンビボ脱分極化は、アクチン重合6、30、40の急速な刺激をもたらすことが示されており、この現象は本明細書で報告されるアッセイのさらなる確認として使用された。シナプス末端で濃縮された生化学的分画は、2つの異なる方法で調製された。「シナプトソーム」41、42、43、44を得る勾配ベースの超遠心分離法と、逐次濾過ベースのプロトコルを得て、「シナプトニューロソーム」43、45、46を得る。後者の収量が高いため、組織量がしばしば制限されているヒト死後の脳組織に使用しました。一方、ラットの脳組織実験には、シナプス断片41の濃縮度が高いシナプトソームを使用することを好んだ。

シナプトソームまたはシナプトニューロソームの脱分極化とアクチン重合の刺激は、細胞外K+50mMの短い(30秒)バースト増加によって達成された。KCl暴露は、それぞれの模擬刺激対照と比較してげっ歯類の脳シナプトソームでほぼ40%増加したファロイジン結合をもたらした(図5A;補足図2Aも参照)。小さい(約20%)しかし、KClで治療されたヒトシナプトニューロソームにおいても一貫した増加が認められた(図5B;補足図2Aも参照)。これらの実験は、孤立したシナプス末端を含む脳組織サンプル中のF-アクチンレベルの変化を決定する際のアッセイの堅牢性を検証する。

図 1.アレクサ蛍光647ファロイジンの蛍光の標準曲線. 標識ファロイジンの異なる量(25-500 μU)の蛍光発光の直線性は、645nmの励起および670nmの発光で蛍光分光法によって確認された(R2=0.9942)。データは SEM (n=3) ±平均として表されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.ラットの脳組織から全細胞のホモジナートに結合するファロイジンの直線性. (A)異なる量のホモジナート(50〜300 μgタンパク質)に対するファロイジンの結合を評価した。(B)結合は50〜200μgタンパク質の範囲で線形であった(R2=0.9602)。(C)540nmでの散乱は、異なる量のサンプルを確認するために使用された(R2= 0.8319)。データは SEM ±平均値として表されます (n=4)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.死後のヒト脳組織から全細胞均質に結合するファロイジン。 (A)ホモジナートの範囲内のファロイジン保持(50〜300μgタンパク質)を評価した。(B)ファロイジン結合は50〜200μgタンパク質の範囲で線形であることが判明した(R2=0.8832)。(C)540nmでの散乱は、サンプルの変動量を確認した(R2 = 0.9730)。データは SEM ±平均値として表されます (n=4)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.F-アクチンレベルに対するラトランクリンAの影響 アクチン脱重化剤ラトランクリンA(2μM、2μM)による脳ホモジネートの治療 37°Cで1h)は、げっ歯類の標識ファロイジンの両方の保持によって評価されるそれぞれの模擬処理対照サンプルと比較してアクチンフィラメントの量が有意に減少した(p= 0.0034;ペア化された二尾の学生のt-test) (A)および死後の人間組織(p = 0.0011;データは SEM ±平均として表されます (n=6 ペア)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.分離シナプス末端におけるF-アクチン量に対するKCl媒介脱分極の影響 (A) ラット脳からのシナプトソームのインキュベーション 37°C刺激アクチン重合で30 sの30 mM KClを用いて、その結果、ファロイジン結合の増加(p = 0.0014;ペアの二尾学生の t-test)(B) 死後のヒト脳組織からのシナプトニューロソーム分画においても小さな増加が認められた(p = 0.014;ペアの両手学生の t-test)。データは SEM ±平均として表されます (n=6 ペア)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補助図 1.ラトランクリンAの全アクチンレベルへの影響 脳ホモジナートは、ラトランクリンA(2μM、37°Cで1時間)またはDMSOの等体積(37°Cで1h)でインキュベートした。1サンプル当たり10μgのタンパク質(ラトランクリンA処理およびDMSO mock処理コントロール)を、固定前に採取した。全アクチンレベルを免疫ブロット法で評価した。代表的なブロットはラット(A)およびヒト(C)脳ホモジナートに示されている。ラトランクリンAは、ラット(B;p=0.40;ペアの二尾学生のt-test)と人間(D;p = 0.42;ペアの二尾学生のt-test)脳ホモジネートの両方の総アクチンレベルを変更しなかった。データは SEM ±平均値として表されます (n=3 ペア)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補助図 2.ラットシナプトソームおよびヒトシナプトニューロソームにおけるF-アクチンレベルに対するKCl媒介脱分極の影響 (A) ラット脳からのシナプトソームのインキュベーションを50 mM KCl(37°Cで30 s)刺激し、その結果、ファロイジン結合の増加(p = 0.0019;ペアの二尾学生の t-test)。(B) ファロイジン保持の増加は、それぞれの非刺激対照と比較してKClによって脱分極化したヒトシナプトニューロソーム分画においても観察された(p = 0.015;ペア化された二尾学生の t-test)。データは SEM ±平均として表されます (n=6 ペア)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。