このプロトコルは、成体および若年性羊卵子のガラス化のための標準的な方法を提供することを目的としている。これは、体外成熟培地の調製から温暖化後の培養までのすべてのステップを含む。卵母細胞は最小必須容積を保障するためにクライオトップを使用してMII段階でガラス化される。
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この記事について
サマリー
要約
家畜では、食肉処理場から容易に得ることができる多数の卵巣および卵母細胞のおかげで、インビトロ胚生産システムを開発し、持続させることができる。成人卵巣は常にいくつかの骨根卵胞を負担し、思春期前ドナーでは卵巣が四大葉包のピーク数を負担する4週齢で卵母細胞の最大数が利用可能である。したがって、4週齢の子羊は、成人の卵母細胞の発達能力が成人に比べて低い場合でも、良好なドナーとみなされる。
基礎研究と商業用途は、成人および前頭体ドナーの両方から得られたガラス状卵母細胞を正常に凍結保存する可能性によって後押しされるであろう。前立体ドナーから採取された卵母細胞のガラス化はまた、生成間隔を短くし、繁殖プログラムにおける遺伝的利益を増加させることも可能にする。しかし、凍結保存後の発達力の喪失は、哺乳類の卵母細胞をおそらく凍結保存するのが最も困難な細胞型の1つとなる。利用可能な凍結保存技術の中で、ガラス化は動物およびヒト卵母細胞に広く適用される。この技術の最近の進歩にもかかわらず、高濃度の凍結保護剤への暴露、ならびに冷たい傷害および浸透ストレスは依然としていくつかの構造的および分子的変化を誘発し、哺乳類卵母細胞の発達可能性を低下させる。ここでは、若年および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて述べている。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後のインキュベーション期間まで、すべての手順が含まれています。MII段階でガラス化された卵母細胞は、実際に温暖化後に受精することができるが、凍結保存手順による損傷を回復し、その発達可能性を高めるために受精前に余分な時間が必要である。したがって、温暖化後の培養条件およびタイミングは、特に卵母細胞が若年性ドナーから採取される場合、卵母細胞の発達可能性を回復するための重要なステップである。
概要
雌の配偶子の長期保存は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、元その場の野生動物種保護プログラムを通じた生物多様性の保全に寄与すること、および貯蔵された卵母細胞が体外胚生産または核移植プログラム1、2、3に組み込まれる可能性のおかげで、生体内バイオテクノロジーの研究と応用を促進するなど、幅広い用途を提供することができる。若年卵母細胞ガラス化はまた、繁殖プログラム4の生成間隔を短くすることによって遺伝的利益を増加させるだろう。卵母細胞の超急速冷却および温暖化によるガラス化は、現在、家畜卵母細胞凍結保存のための標準的なアプローチと考えられている5.反芻動物では、ガラス化の前に、卵母細胞は、通常、インビトロで成熟し、アバトワール由来卵巣から得られた卵胞から取り出した後2。成人、特に思春期前卵巣4,6は、凍結保存される卵母細胞の事実上無制限の数を実際に供給することができる。
牛では、卵子のガラス化および温暖化後、>10%の胚盤胞収量は、過去10年間にいくつかの実験室によって一般的に報告されている3。しかし、小さな反虫卵子では、卵形の卵形は、まだ若年卵母細胞と成人卵母細胞の両方について比較的新しいと考えられており、羊の卵母細胞のガラス化のための標準的な方法は、2,5に確立され続ける。最近の進歩にもかかわらず、ガラス化され、温めた卵母細胞は確かに彼らの発達の可能性7、8、9を制限するいくつかの機能的および構造的な変化を提示する。したがって、ガラス化/温めた羊の卵母細胞2では10%以上の胚盤胞発生を報告した記事はほとんどありません。上記の変更を減らすためにいくつかのアプローチが検討されている:ガラス化および解凍ソリューション10、11の組成を最適化する。異なるクライオデバイス8、12、13の使用を試してみる。そして、体外成熟(IVM)4、14、15および/または温暖化後の回復時間中に特定の治療を適用する6.
ここでは、若年性および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後の培養期間まで、すべての手順が含まれています。
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プロトコル
動物の議定書および実施された手順は、欧州連合指令86/609/ECおよび欧州共同体委員会の勧告2007/526/ECに従って、サッサリ大学で施行されている倫理指針に従っています。
1. 卵母細胞操作用メディアの準備
- 0.1 g/L ペニシリンおよび 0.1 g/L ストレプトマイシン (PBS) で Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩を補って、採取した卵巣の輸送のための培地を準備します。
- ペニシリンを添加したミリQ水1 Lで粉末に9.5 gの組織培養培地(TCM)199を希釈して卵母細胞の採取と成熟のための培地を準備する(0.1%)とストレプトマイシン (0.1%).
- 希釈後、100mLの培地を濾過し、1週間使用するストック成熟培地(SMM)として4°Cで保管します。
- 残りの900 mLを25 mM HEPES、0.36 g/L重炭酸塩、0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)(pH 7.3、オスモラリティ290 mOsm/kg)で補って回収培地(CM)を調製します。
- 成熟培地に0.021 g/L重炭酸塩、10%熱処理されたエラスヒツジ血清、1 IU/mL FSH、1 IU/mL LH、100 μLのシステアミン、8 mg/mLのピルビン酸を加えて調製します。
注:10 mLの体積の成熟培地は、使用前に少なくとも4時間(空気中の5%CO2で39°Cで最大加湿雰囲気で)標準的な条件でインキュベートする必要があります。 - インビトロ成熟後の卵母細胞の操作のために塩基培地(BM)を準備し、CA++およびMg++を含まないPBSで成り、20%の胎児子牛血清(FCS)を補う。
2. 卵母細胞のコレクションと成熟
- 若年期(30-40日、体重6〜10kg)および成人卵巣から卵母細胞を回復する。
- 採取した卵巣を商業食肉処理場から27°CのPBSで1〜2時間以内に実験室に輸送する。
- PBS新鮮な培地で洗浄した後、マイクロブレードを使用してCMで卵巣をスライスし、卵胞含有量を放出する。
- 60倍の倍率で実体顕微鏡検査の下で、4-10層の顆粒球細胞、均一な細胞質を有する卵子、細胞質中の脂質滴の均質な分布、および外径約90μm(平均)を有するものを選択して、インビトロ成熟のためのcumulus-oocyte複合体(COC)を選択する。
- 選択したCOCsをCMで3回洗浄し、最後に成熟培地で移送します。
注意:若年卵子の場合、ガラス化後の生存率を向上させるために、100 μM トレハロースで成熟培地を補います。 - インビトロ成熟のために、300 μLのミネラルオイルで覆われた4ウェルペトリ皿で600 μLの成熟培地で30-35 COCを移し、39°Cで空気中5%CO2で22(成卵母細胞)/24(若い卵子)hでインキュベートします。
- インビトロ成熟後、穏やかにピペット処理することにより、cumulus細胞の脱ヌードCOC。60倍の倍率で実体顕微鏡で検査した後、第1極体の押出を示すものだけを選択し、したがって、形相II(MII)段階でガラス化を行う。
3. 精液の収集、凍結および解凍の手順
- ラムエクステンダー(200 mM Tris;70 mMクエン酸;55 mMフルクトース;pH 7.2、オスモラリティ300 mOsm/kg)で構成される精液凍結保存用の塩基培地を卵黄20%(v/v)で補う準備を行います。
- 羊の繁殖期(10月~11月)のみ、精液を回収してください。
- 人工膣による射精を成人のラム(2〜5歳)から取得し、屋外環境で維持し、ライブ体重維持配給を与える。ラムは別々のペンで隔離されますが、互いに視覚的に接触します。
- 各雄から少なくとも8つの射精を得るために、繁殖期中に週に1回精液採取を繰り返す。
- 採取後5分以内に環境温度で実験室に精液サンプルを輸送し、すぐに処理します。2~3個のラムの射精をプールし、精子濃度分光度測定を評価する。
- プール後、4%グリセロールを添加した精液凍結保存用のベース培地で最大400 x 106 精子/mLの射精を希釈する。その後、希釈した精液を2時間にわたって4°Cに冷却し、凍結する前に20分間平衡化します。
- 乾燥氷の上にペレット状(0.25 mL)の精液サンプルを凍結し、液体窒素に突っ込みます。
- 解凍の場合は、ペレットを殺菌ガラスハヤブサに入れ、39°Cで20sの水浴に突き刺します。
4. 体外受精と胚培養
- 合成排卵液(SOF)の体質のための在庫を準備します。
- ストックAを準備:ミリQ水の99.4 mL。NaClの6.29 g;0.534 g の KCl;0.161 g の KH2PO4;0.182 MgSO4 ·7H2Oのg;そして0.6mLの乳酸ナトリウム。4°Cで最大3ヶ月間保管してください。
- ストックBを準備:ミリク水の10 mL。0.210 グラムの NaHCO3;フェノールレッドの2-3グラム。4°Cで1ヶ月保存してください。
- ストックCを準備:ミリク水の10 mL。そして0.051gのピルビン酸ナトリウム。4°Cで1ヶ月保存してください。
- ストックDを準備:ミリク水の10 mL。CaCl2 2H 2 O. 1 ヶ月間 4 °C で保管する 0.262 g.
- 7.630 mLのミリQ水、1 mLのストックA、1 mLのストックB、0.07mLのストックC、0.7 mLのストックDからなるSOFの10 mLを準備します。
- 体外受精(IVF)培地を準備する:SOFは2%熱処理されたエストロスヒツジ血清、10 μg/mLヘパリンおよび1 μg/mL低酸素(浸透圧280-290 mOsm/kg)を補充した。
注:10 mLの体積のIVF培地は、使用前に少なくとも4時間前に(5%CO2、5%O2および90%N2の39°Cで最大加湿雰囲気で)標準的な条件でインキュベートする必要があります。
- 凍結/解凍した精液アリコートを、1.5mL以下の加温IVF培地の殺菌ガラス円錐管に移し、空気中5%CO2 の加湿雰囲気で39°Cで15分間インキュベートします。
- インキュベーション後、運動精子は液体カラムの素端部に向かって泳ぐ。最上層を収集し、精子の運動性評価のために観察します。
注:精子の運動性パラメータは、精子トラックの重複を避けるために取得した25フレーム、最小コントラスト10、平均パス30μm/秒の最小速度、および80%の直流性>進行運動性の設定を用いて、コンピュータ支援精子分析(CASA)システムを使用して評価する必要があります。このシステムはラム精子の評価のための特定のセットアップを有する。各サンプルに対して、精子懸濁液の5μLサブサンプルは、10 μmの深さの予め温めた分析チャンバにロードされます。精子の運動量は、位相コントラスト顕微鏡を用いて40倍で37°Cで評価され、サブサンプル当たり最低500個の精子を少なくとも4つの異なる顕微鏡分野で分析する必要があります。総運動量および進行性の運動性精子の割合を評価した。IVFの場合、進行性の運動精子の割合は30%≥すべきである。 - 希釈スイムアップ由来のモチル精子を1 x 106 精子/mL最終濃度で、4ウェルペトリ皿でミネラルオイルで覆われたIVF培地の300 μLのMII卵母細胞と共インキュベートする。
- 22時間後、ミネラルオイルの下で報告 された排卵濃度で0.4%のウシ血清アルブミンと必須および非必須アミノ酸を補充したSOFを含む4ウェルペトリ皿の推定ザイゴットを移し、胚盤胞期までの標準的な条件下でそれらを培養する。
- 22-、26-および32-hポスト授精で、60倍の拡大率を有する実体顕微鏡下での検査によって、2つの異なるブラストメアを示す切断卵母細胞の数を記録する。
- 培養の5日目から9日目まで毎日胚を観察し、新たに形成された胚盤胞は60倍の倍率で実体顕微鏡で検査によって記録されるべきである。
5. 卵母細胞のガラス化と温暖化
注:デバイスクライオトップ17を使用して最小必須ボリューム(MEV)の方法に従ってガラス化を行います。
- BMで2分間38.5°Cで5つの卵母細胞のグループを平衡化する。BMの使用は低カルシウム濃度を保証する([Ca2++]2.2 mg/dL)10.
- 7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)と7.5%(v/v)エチレングリコール(EG)を含む平衡溶液への3分の露出で卵母細胞を脱水します。
- 卵母細胞を16.5%(v/v)DMSO、16.5%(v/v)EG、0.5 Mトレハロース(BM)を含むガラス化溶液に移し、クライオトップ装置にロードし、30s以内の液体窒素に直接突っ込みます。
- 生物学的温度に温めるには、液体窒素から38.5°Cで1分間BMの1.25Mトレハロースの200μL滴に各ガラス化装置の含有量を移し、穏やかに攪拌して混合を容易にします。
- 細胞内凍結保護剤の除去を促進するために、卵母細胞を減少するトレハロース溶液(0.5 M、0.25 M、0.125 Mトレハロース(BM中0.5M、0.125 Mトレハロース)を30秒に30秒に段階的に移し、BMで38.5°Cで10分間平衡化する。
6. 卵母細胞の品質の評価後温暖化
- 加温後、38.5°Cで空気中5%CO2でCa++およびMg++プラス20%FCS(BM)を使用せずにPBSで6時間の卵母細胞をインキュベートする。
注:ガラス化後に生物学的および構造的特徴を回復させる卵母細胞能力は、使用済み卵母細胞の種およびクラスに関連しています。 - 凍結保存損傷を回復する卵母細胞能力は時間依存性であるため、体外培養の異なる時点(0時間、2時間、4時間、6時間)で卵母細胞の品質を評価し、卵母細胞受精に最適なタイムウィンドウを定義する。
注:大人の羊の卵母細胞では、最適な時間は4時間の温暖化後です。思春期前の卵母細胞にとって、最適な時間は2時間の温暖化後である。
7. 卵母細胞生存率評価
- 温暖化直後および温暖化後培養の各時点について、100倍の倍率で反転した顕微鏡を用いて、形態学的に卵母細胞を評価する。
注:かすかな細胞質、損傷の透明帯および/または膜のような構造的変化を有する卵母細胞は退化として分類されるべきである。 - 二重微分蛍光染色を使用して膜完全性評価を検証します。
- ヨウ化プロピジウム(PI;10 μg/mL)とヘヒスト33342(10μg/mL)を含むBMの2mLで卵母細胞を38.5°Cで空気中5%CO2 で5分間インキュベートします。
- フレッシュBMで3回洗浄した後、350nmの励起フィルターと460nmのエミッションを用いて蛍光顕微鏡下で卵母細胞を観察し、535nmの励起フィルターとPI用617nmの放出を観察します。
注:無傷の膜を有する卵母細胞は、Hoechst 33342で着色されたDNAの青色蛍光によって認識することができる。損傷した膜を有する卵母細胞は、PIによるDNA染色による赤色蛍光を示す。
8. 共焦点レーザー走査顕微鏡によるミトコンドリア活性とROS細胞内レベルの評価
- ミトトラッカーレッドCM-H2XRos(MT-レッド)プローブを準備します。
- 1バイアル(50μg)の含有量を1 mLのDMSOで希釈し、1mM溶液を得る。希釈したバイアルを液体窒素に入れておいてください。
- 溶液をDMSOで1mM希釈して100μMのストック溶液を得て、暗闇の中で-80°Cに保存します。
- 2′,7'ジクロロジヒドロフルオレスセインジアセインジアセテート(H2DCF-DA)プローブを準備します。
- H2DCF-DAを0.1%ポリビニルピロリドン(PVA)/PBSで希釈し、最初の100 mM溶液を得る。溶液を暗闇の中で-80°Cに保つ。
- 1番目の溶液を0.1%PVA/PBSで希釈し、100 μMのストック溶液を得ます。暗闇の中で-20°Cに保管してください。
- 取り付け培地(MM)を準備する:10 mLのMMに対して、5mLのグリセロール、5 mLのPBS、250mgのアジドナトリウムを加えます。使用するまで-20°Cで保管してください。
- 卵母細胞をBMで38.5 °Cで30分間インキュベートし、500 nM MT-Red(ストック溶液:DMSOで100 μM)
- MT-Redプローブでインキュベーションした後、卵母細胞をBMで3回洗浄し、5μM H2DCF-DA(ストック溶液:BMで100μM)を含む同じ培地で20分間インキュベートします。
- プローブに曝した後、BMで卵母細胞を洗浄し、2.5%グルタルアルデヒド/PBSで少なくとも15分間固定します。
- 固定後、卵母細胞をBMで3回洗浄し、サンプルの圧縮を避けるためにワックスクッションを使用して1 mg /mL Hoechst 33342で4μLのMMドロップでガラススライドに取り付けます。
- スライドは、評価まで暗闇の中で4°Cで保存します。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡で免疫標識切片の分析を行います。顕微鏡は40/60xのオイルの目的を使用して、Ar/He/Neレーザーが装備されている。連続的な励起によってセクションを分析する。
- ミトコンドリア評価では、MT-Red(露光:579 nm;放出:599nm)を検出するために、多光子レーザーでサンプルを観察してください。
- 488 nmのアルゴンイオンレーザー線とB-2 Aフィルタ(495nm露光および519nm放射)を用いてジクロロフルオレセイン(DCF)18を指摘する。
- 個々の卵母細胞において、赤道面19でMT-赤およびDCF蛍光強度を測定する。
- すべての画像取得中に一定の値で蛍光強度に関連するパラメータを維持します (レーザーエネルギー 26%, シーケンシャル設定 1: PMT1 ゲイン 649-PMT2 ゲイン 482;シーケンシャルセッティング2:PMT1ゲイン625-PMT2ゲイン589;オフセット 0;ピンホールサイズ:68)。
- Leica LAS AF Lite画像解析ソフトウェアパッケージを用いて蛍光強度の定量的分析を行い、20によって標準化された手順に従う。
- 赤道平面に到達するまで、Z軸上を移動して、一度画像をキャプチャします。
- 各写真について、グレースケールに変換し、チャンネル1(Hoechst青に関連)をオフにします。次に、meiotic スピンドルの周囲にある外接領域に、関心領域 (ROI) を手動で描画します。
注:ソフトウェアは、自動的にチャンネル2(FITC)のピクセル平均値を読み取り、そこから背景の値を差し引くことができます。 - ピクセルの平均値を記録し、統計分析のために送信します。
9. 統計分析
- 次の違いを分析する:若年対成卵母細胞の生存率、対照およびトレハロース処理の若年卵母細胞における生存率および発達能力、生存率およびパルテノ遺伝学的活性化率および異なるカルシウム濃度培地で生き生きとした成卵細胞の発生能力、受精率および胚産生は低カルシウム濃度または高カルシウム濃度で生分解される カイ二乗試験を用いた成人と若年のガラス化卵母細胞間の温暖化後培養とパルテノジェネティック活性化率の異なる時点。
- リヴェンの試験による均質分散の分析後、ANOVAによる温暖化後培養の異なる時点におけるミトコンドリア活性およびROS細胞内卵母細胞における異なる時点におけるガラス化成卵母細胞における切断率および胚出力を分析する。グループ間とグループ間の違いを強調するために、ポストホックテストTukeyの検定を使用します。
- 統計ソフトウェアプログラムを使用して統計分析を実行し、P < 0.05 の確率を最小の有意水準と考えます。すべての結果は、S.E.M±平均で表されます。
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結果
若年性ドナーからの卵母細胞の凍結耐性は、成人の卵子に比べて低い。最初に観察された効果は、成体卵母細胞と比較して温暖化後生存率が低い(図1A;χ2試験P<0.001)。若年卵母細胞は、温暖化後の膜完全性の低下を示した(図1B)。成熟培地におけるトレハロースの使用は、この糖が若年卵母細胞の凍結傷害を減少させるかどうかを検証することを意図していた。データは、卵母細胞がトレハロース補充で24時間熟成したことを示している23は、非治療群と比較してガラス化/温暖化後の生存率が高いことを示した(表1:85.7%対75.3%それぞれ;χ2試験P<0.05)。トレハロース補充は、確かに温暖化後のより高い膜完全性と関連していた (図 2A).したがって、若年卵母細胞のインビトロ成熟時にトレハロースを使用すると、ガラス化後の生存率が増加した(85...
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ディスカッション
家畜における卵母細胞凍結保存は、女性の遺伝資源の長期的な保存だけでなく、胚性バイオテクノロジーの開発を進めることができる。したがって、卵母細胞ガラス化のための標準的な方法の開発は、家畜と研究部門の両方に有利であろう。このプロトコルでは、成虫の羊卵子ガラス化のための完全な方法が提示され、若年卵母細胞のための効率的なガラス化システムの開発のための固体の出発点を表すことができる。
提案された方法の主な利点の1つは、卵母細胞コレクション、体外成熟、ガラス化、および温暖化からのすべてのステップが含まれていることである。さらに、卵母細胞が受精前のガラス化処置中に被った損害から回復することを可能にする温暖化後培養期間が含まれる。受精のための最適な時間は、凍結保存、初期卵母細胞の品質、患者の年齢、および種の方法に従って調整されるべきであり、時間回復と卵母細胞老化25、26の両方の側面を考慮することが不可欠である。したがって、温暖化後の培養期間の選択は困難であり、卵母細胞ガラス化プロ...
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
謝辞
著者たちはこの作品に対する具体的な資金を受け取っていなかった。マリア・グラツィア・カッパイ教授とヴァレリア・パシウ博士は、ビデオナレーションとビデオ制作中にラボを設置したことで感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2′,7′-ジクロロフルオレシンジアセテート | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| アルブミンウシ画分 V、プロテアーゼフリー | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| ビスベンズイミド H 33342 三塩酸塩 (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| 塩化カルシウム (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| クエン酸 | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| 共焦点レーザー走査型顕微鏡 | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| クライオトップ 北里 | メディカルバイオロジカルテクノロジー | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) フルクトース | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)トレハロース脱水 | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 卵黄 | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| エチレングリコール(EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| グルタミン酸 | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| グルタルアルデヒド | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| ヘパリン | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| ハイポウタリン | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| 倒立顕微鏡 | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-アルギニン | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-アスパラギン | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-アスパラギン酸 | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-システイン | シグマ・アルドリッチ | C7352 | |
| L-シスチン | シグマ・アルドリッチ | C8786 | |
| L-グルタミン | シグマ・アルドリッチ | G3126 | |
| LH | シグマ・アルドリッチ | L6420 | |
| L-ヒスチジン | シグマ・アルドリッチ | H9511 | |
| L-イソロイシン | シグマ・アルドリッチ | I7383 | |
| L-ロイシン | シグマ・アルドリッチ | L1512 | |
| L-リジン | シグマ・アルドリッチ | L1137 | |
| L-メチオニン | シグマ・アルドリッチ | M2893 | |
| L-オルニチン | シグマ・アルドリッチ | O6503 | |
| L-フェニルアラニン | シグマ・アルドリッチ | P5030 | |
| L-プロリン | シグマ・アルドリッチ | P4655 | |
| L-セリン | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-チロシン | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-バリン | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| 塩化マグネシウム七水和物 (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.バイオシグマS.r.l. | ||
| ミディアム 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| 鉱物油 | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| 新生子牛血清熱不活化(FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| ペニシリンGナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| フェノールレッド | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| ポリビニルアルコール (87-90% 加水分解、平均分子重量 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| 塩化カリウム (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ヨウ化プロピジウム | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 羊血清 | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| 重炭酸ナトリウム (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| dl-乳酸ナトリウム溶液シロップ | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| ピルビン酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 精子クラス分析装置 | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| 統計ソフトウェア Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| 実体顕微鏡 | Olimpus | SZ61 | |
| ストレプトマイシン硫酸塩 | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| タウリン | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
参考文献
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