外傷性脳損傷後の成人ラットの空間ワーキングメモリ評価のための測定基準試験

中等外傷性脳損傷(TBI)後の注意、執行機能、および特定の記憶障害などの神経障害の有病率は、50%以上である1、2、3、4、5、6、7、8。TBI は、空間的な短期、長期、およびワーキング メモリ⁹で深刻な障害を引き起こす可能性があります。これらの記憶障害はTBIのげっ歯類モデルで観察されている。げっ歯類モデルは、メモリをテストする技術の開発を可能にし、TBIがニューラルメモリシステムにおけるメモリ処理に及ぼす影響を深く調べる。

トポロジカルおよびメトリック空間情報処理に関連する 2 つのテストは、それぞれ空間ワーキング メモリ (SWM) の測定に役立ちます。トポロジーテストは、オブジェクトの周囲の環境空間または関連する接続または囲いのスペースのサイズを変更することに依存し、メトリックテストはオブジェクト^10,11の間の角度または距離の変化^を評価する。グッドリッチ・フンサカーららは、まずラット¹⁰に対するヒトトポロジカルテストを適応させ、空間情報処理¹¹における頭頂皮質(PC)と背側海馬の役割を解離するメトリックタスクを適用した。同様に、Gurkoffたちは、横流流体打楽器損傷⁹後のメトリック、トポロジカル、および時間的順序付け記憶タスクを評価した。脳の特定の領域への損傷とメトリックまたはトポロジカル記憶の障害との間には相関関係があります。メートルメモリ障害は、海馬の両側背状結節回およびコルヌアンモニス(CA)サブ領域CA3における病変に関連しており、トポロジカル記憶障害が両側頭頂皮質病変^10,12に関連することが示唆されている。

このプロトコルの目的は、測定タスクを介してラット集団の空間記憶障害を評価することです。この方法は、脳損傷後のSWMのメカニズムを調査するのに適した代替手段であり、その利点は、実装の相対的な容易さ、高感度、再現性の低コスト、動的観察の可能性、および低ストレス環境を含む。Barnes迷路^13、14、モリス水ナビゲーションタスク^{15、16、17、}または空間迷路タスク^18、19のような他の行動タスクと比較して^、このメトリックテストはそれほど複雑ではありません。実装の容易さのために、メトリックテストは、より短く、より少ないストレスのトレーニング期間を必要とし、わずか2日間^9:習慣のための1日とタスクのための1日で行われます。また、提案されたテストは、新規物体認識(NOR)タスクなどの他の低ストレステストよりも実行が容易であり、また、慣例²⁰の余分な日を必要としない。

本論文は、脳損傷後のSWMを評価するための簡単なモデルを提供する。ポストTBI SWMのこの評価は、その病態生理学のより包括的な調査に役立つ可能性があります。

実験は、ヘルシンキと東京宣言の勧告と欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われた。実験は、ネゲブのベングリオン大学の動物ケア委員会によって承認されました.プロトコルのタイムラインを 図 1に示します。

1. 手術手順と流体パーカッションTBI

1. 1°Cの22±の室温、湿度40%~60%、12~12時間の明暗サイクルで収容されたオスとメスの成人スプレイグ・ドーリーラットを選択します。
2. チャウと水 アドリビタムとして食品を提供します。朝の時間、すなわち6:00 a.mと12:00 p.mの間で実験を行います。
3. 実験開始前に、コントロール群とTBI群の両方に対してベースライン神経学的評価を行う(下記のセクション2を参照)。
4. 吸入4%イオブルランを吸入して誘導し、麻酔の維持のために1.5%でラットを麻酔する。刺激物に反応してペダル反射や動きをテストすることで、ラットが固定されていることを確認します。
   注:麻酔には連続的なイオブルラン投与システムを使用してください。無菌状態ですべての手順を実行します。
5. 前述の^21,22と同様に、パラサジタル流体打楽器を行^う。
6. 皮下に0.2mLの0.5%ブピバカインを、切開前の前切開部位に沿って注入する。ラットを回復室に駆け付け、神経学的(例えば、麻痺)、呼吸(例えば、呼吸停止)および心血管状態(例えば、軟部組織灌流の減少、瞳孔の色の変化、および徐脈)を24時間監視し続ける。麻酔から出現する前に、術後鎮痛として0.01-0.05mg/kg筋肉内ブプレノルフィンを投与する。少なくとも48時間の6〜12時間ごとに用量を繰り返す。

2. 神経学的重症度スコア(NSS)の評価

注:神経学的欠陥の評価は、NSSを使用して行われ、前に説明した^23、24を使用して採点されました。運動機能と動作の変化の最大スコアは24ポイントです。スコア 0 は、神経学的状態がそのままであり、24 は、前に説明した²⁴のように、重度の神経機能機能障害を示します。

1. ラットの中心に置かれたときに円(直径50cm)を残すことができない状態をテストします。このタスクを 3 回実行し、各セッションを 30 分、60 分、および 60 分以上のセッションで実行します。
   注:尾でネズミを拾う場合は、尾のベースを保持します。
2. 正しい反射の損失のためにラットをテストします。
   1. 動物を背中に置いて、研究者の手のひらに置きます。動物が自分自身を右にすることができる場合は1のスコアを与えます²⁵ (すべての4つの足の上に立っています).
3. ラットの片麻痺をテストし、強制的な位置決めに抵抗するラットの能力が不足している。
4. 後肢の反射曲げをテストするために、その尾でラットを上げます。
5. まっすぐ歩く能力をテストするために床にラットを置きます。
6. 3 つの反射的な動作のテストを実行します: ピナ反射、角膜反射、および驚くべき反射。
   1. ピナ反射については、前述の²⁵のように耳の引き込みをテストするために軽い触覚刺激を行う。
   2. 角膜反射をテストするために、眼に軽くソフトスティックを塗布する際の瞬き応答を監視し、トリプルアイブリンク(3)に0(応答なし)のスケールで測定し、前述の²⁵を説明した。
   3. 驚きの反射の場合は、ワイヤーケージの上部にペンをドラッグし、前に説明した²⁵のように、0(応答なし)から3(1cmジャンプ以上)のスケールで応答を記録します。
7. 求める行動とプロストレーションの喪失(ウィスカーの移動、スニッフィング、または新しい環境に移された後の実行)に基づいてラットをグレードする^24.
8. 左と右の前肢、次に左右の後肢の配置のための四肢反射をテストします。
9. ビームバランシングタスクを使用して、幅1.5cmのビームで機能を分析します。20 秒、40 秒、60 秒以上続くセッションのテストを実行します。
10. ビームウォーキングテストは、幅8.5cm、幅5cm、幅2.5cmの3つのビームで行います。

3. メトリック タスクの準備

1. 備品
   1. 直径200cm、厚さ1cmの黒い円形のプラットフォームをテーブルの上に置きます。テーブルの高さは床の上に80センチメートルでなければなりません。
   2. 2つの異なるオブジェクトを、68cm離れた円形プラットフォームの中央に設置します。
      注:この実験では、2つのガラス瓶がオブジェクトに使用され、1つの丸いボトルは高さ13.5cm、もう1つは高さ20cmのファセットボトルでした。安定性を確保するためにボトルに水を入れます。
   3. カメラを準備し、データのキャプチャ、保存、および処理に必要なコンピュータ ソフトウェアをインストールします。床から290cmの高さでカメラを取り付けます。
      メモ:プラットフォームとカメラの間の距離は、カメラの仕様によって異なります。カメラフレームは、テストが行われているアリーナの領域全体をカバーする必要があります。プラットフォームとカメラの間の実験の距離は210cmでした。
2. 慣れ
   1. タスクの前日に、ビデオ録画なしでアリーナに置くことによって、10分間新しい環境にラットを習慣化します。
      注: 同じ日に神経学的なタスクとメトリックタスクを実行しないでください。
      注: 赤いライト領域でメトリック テストを実行します。

4. メトリックタスクの実行

注: メトリック タスクは、1) 習慣 (15 分) と 2) テスト (5 分) の 2 つの期間で構成されます。

1. 居住期間
   1. 2つの異なるオブジェクトを、68cm離れた円形プラットフォームの中央に配置します。
   2. ラットをプラットフォームの端に配置し、15 分間、オブジェクトから等距離に配置し、ビデオを記録します。
   3. プラットホームからラットを取り出し、5分間、個々のケージに入れます。
   4. 5%-10%アルコールでプラットフォームをきれいにしてください。
      注:通気の良い場所でプラットフォームをきれいにするために最大70%のアルコールを使用することができます。
2. テスト期間
   1. オブジェクト間の距離を34cmに減らします。
   2. 5分間プラットフォーム上にラットを置き、ビデオでラットの探査活動を記録します。
   3. 5%-10%アルコールでプラットフォームをきれいにしてください。

5. データ分析

注: データ解析は、動物の活動と動きを自動的に記録する動物行動調査用に特別に設計されたビデオ追跡ソフトウェアによって実行されます ( 資料表を参照)。このソフトウェアは、モビリティ、アクティビティ、探索的動作など、さまざまな動作変数を自動化します。

1. ビデオファイルを分析する前に、ソフトウェアハードウェアキーを挿入します。ビデオトラッキングソフトウェアを起動し、プリセット テンプレートを開きます。
2. [設定]セクションで、次の設定を確認します。
   注: この実験では、探査領域のパラメータは対象のオブジェクトの周囲に 6 cm として定義されます。ラットがこの領域に入った時間を測定した。
3. 設定を確認した後、複製して名前を変更します。
4. プログラムの一般的な画面で、マウスを右クリックして 背景 をつかむ。
5. 背景画像のビデオファイルを選択します。 [参照 ] メニューで、ビデオ ファイルの場所を選択します。
6. 画像をキャプチャし、調査対象の領域とゾーンにマークを付け、画像をキャリブレーションして解析します。 [試用制御 ] と [ 設定の検出] でも同じ手順を実行します。
7. 一般メニューで[ トライアルリスト ]を選択し、分析用のビデオファイルのリストをダウンロードします。
8. ビデオを追加し、必要な設定で場所を指定します。
9. [取得] と [試用開始] を選択します ( 図 2b,cを参照)。すべてのデータを Excel ファイルとしてエクスポートします ( 図 2dを参照)。
   注: 習慣とテスト期間のすべての計算を実行します。メトリック・タスク評価は、高度なテンプレートで準備されます。

グループ間の比較の重要性は、マン・ホイットニー検定を用いて決定した。結果の統計的有意性はP<0.05で考慮され、統計的に高い関連性はP<0.01で測定された。

この結果は、介入前とTBIの28日後のすべてのグループ間でNSSに違いは見られない。各群は12匹の雌または12匹の雄のラットで構成された。TBI の後に 48 時間取得された NSS スコアを 表 1に示します。傷害後28日目に有意な神経学的欠損を示したTBI群のラットは、実験から除外された。データはカウントとして測定され、中央値±範囲として表示されます。

シャム作動対照群は、研究の初日(NSS-0)の後、48時間で神経学的欠陥を示さなかった。TBI後48時間の神経学的欠損は、オスの恥ずべきラット(5.5(4-7)対よりも雄のTBIラットにとって有意に大きかった。 0(0-0), U = 0, p < 0.01, r = -0.89), および雌の TBI ラットの場合 (4.5(3.25-6) 対 0(0-0), U = 0, p < 0.01, r = -0.91) マン・ホイットニー検定(表1)に従って。

マン・ホイットニーのテストでは、メートル法タスク中の物体探査時間は、オスのTBIラット対オスのシャム操作ラット(130%±44.3%対1978%±59.2%)、U=0=0、p<0.01、r= -0.85(図3a,bを参照)が有意に短い。データは、ベースラインポイントの%で表される秒として測定され、SEMベースライン±平均として提示され、慣用期間の最初の5分の間に探査の時間として測定されます。残りの3つのタイムポイント(5-10分、10-15分、20-25分)をベースラインの割合として計算しました。

Mann-Whitneyのテストでは、メートル法タスク中の物体探査時間は、メスのTBIラット対雌のシャム操作ラット(±43.5%対2160%±43.6%)、U= 0、p<0.01、r = -0.85(図4a,bを参照)で有意に短いことがわかりました。データは、ベースラインポイントの% で表される秒として測定され、SEM. ベースライン±平均として表示され、慣用期間中の探索時間として測定されます。

男性と女性のグループの間に有意差は見つからなかった。

図1: タイムラインを使用したプロトコルの概略図 この図は、プロトコルのタイムラインを示しています。異なる時期のラット群には、シャム作動対照群およびTBI群が含まれ、損傷後-1時間、48時間、および28日後にNSSスコアによって評価された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2: 代表的なデータ分析 ビデオトラッキングソフトウェアの画面キャプチャ (A) 試用制御設定 (B) トライアルリストと (C) 取得、 および Excel (D) にエクスポートされたサンプルデータ 。詳細については、テキストとビデオを参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: 雄ラットのメトリックタスクメートル法タスク中の物体探査時間は、オスのTBIラットとオスのシャム作動ラットに対して有意に短かった(図3a,bを参照して、異なるy軸スケールのデータを示す)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4: 雌ラットのメトリックタスクメートル法タスク中のオブジェクト探査時間は、雌のTBIラットと雌のシャム作動ラットに対して有意に短かった(図4a、bを参照して、異なるy軸スケールのデータを示す)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:神経学的性能の決定 TBI後の48時間の神経学的欠損は、オスの恥手術ラットおよび雌のTBIラットよりもオスのTBIラットに対して、雌の恥を手術したラットよりも有意に大きかった。

著者らは開示するものは何もない。