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方法論記事

ヒト骨格筋微小組織における骨格筋の健康の機能指標の評価

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DOI:

10.3791/62307

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2021年2月18日

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1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

この記事について

サマリー

本稿は、収縮力やカルシウム処理分析を含む機能の機能アッセイにおいて、3Dヒト骨格筋微小組織および低侵襲下流部のアレイを生成するための詳細なプロトコルを記述する。

要約

骨格筋の3次元(3D)インビトロモデルは、骨格筋の改革と機能を実験的操作に適したスケーラブルな形式で研究する機会を得て、生物医学研究における貴重な進歩です。3D筋肉培養システムは、科学者がヒト細胞の文脈で骨格筋ex vivoを研究することを可能にするので望ましい。3D in vitroモデルは、成人骨格筋のネイティブ組織構造の側面を密接に模倣する。しかし、彼らの普遍的なアプリケーションは、製造が簡単で、コストとユーザーフレンドリーで、比較的大量のヒト骨格筋組織を生み出すプラットフォームの可用性によって制限されています。さらに、骨格筋は、多くの疾患状態において時間の経過とともに損なわれる重要な機能的役割を担うため、微小組織研究のための実験的プラットフォームは、低侵襲性カルシウム過渡性および収縮力測定をプラットフォーム内で直接行うことができる場合に最も実用的である。このプロトコルでは、'MyoTACTIC'として知られている96ウェルプラットフォームの製造、および3Dヒト骨格筋微小組織(hMMT)の大量生産について説明する。また、経時的に各細組織の骨格筋力やカルシウムの取り扱いの繰り返し測定を可能にする電気刺激の低侵襲適用方法が報告されている。

概要

骨格筋は、人体で最も豊富な組織の一つであり、移動、熱恒常性および代謝などの主要な身体機能をサポートしています1.歴史的に、動物モデルおよび2次元(2D)細胞培養システムは、生物学的プロセスおよび疾患の病態を研究し、骨格筋疾患2,3の治療における薬理学的化合物を試験するために用いられてきた。動物モデルは健康や病気における骨格筋に関する知識を大幅に改善しましたが、その翻訳的影響は高コスト、倫理的配慮、種間の違い2、4によって妨げられています。骨格筋を研究するためにヒト細胞系に目を向けると、2D細胞培養システムは単純性のために良好である。ただし、制限があります。この形式は、多くの場合、体内5,6内で自然に起こる細胞細胞および細胞外マトリックス相互作用を再現できない。ここ数年、3次元(3D)骨格筋モデルは、生理学的および病理学的に関連するプロセスex vivo7,8のモデリングを可能にすることにより、動物モデル全体および従来の2D培養系に代わる強力な代替手段として登場してきた。実際、多くの研究は、人工的な3D培養形式1でヒト骨格筋をモデル化する戦略を報告している。これらの研究の多くのための1つの制限は、活性力が培養プラットフォームからの筋肉組織の除去と力トランスデューサーへの付着に続いて定量化され、したがって、エンドポイントアッセイ9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 、19,20,21.他の人は、活性力を測定する非侵襲的な方法を可能にする培養システムを設計しているが、すべてが高内容分子試験用途7、8、9、10、14、18、22、23、24、25、26、27、28に適しているわけではない 、29.

このプロトコルは、骨格筋(Myo)のマイクロ組織配列 deviCe forCe (MyoTACTIC) プラットフォームでヒト筋肉微小組織 (hMMT) を作製する詳細な方法を説明します。3D骨格筋マイクロティッシュ30のバルク生産をサポートする96井戸プレート装置。MyoTACTICプレートの製造方法により、96ウェルポリジメチルシロキサン(PDMS)培養プレートと、対応するすべてのウェル機能を単一の鋳造工程で生成することができ、それによって各ウェルは、微小組織形成のために比較的少数の細胞を必要とする。MyoTACTIC内に形成されたマイクロ組織は、デバイスのウェルからウェルまで再現可能な整列、線条、および多核筋管を含み、成熟時に、その場で化学的および電気的刺激に応答することができる30。本明細書において、ポリウレタン(PU)レプリカからPDMS MyoTACTIC培養プレート装置を製造する技術、hMMTを作製するヒト不死化ヒト前駆細胞を導入するための最適化された方法、及び、工学的hMMT力生成およびカルシウム処理特性の機能評価について概説及び議論する。

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プロトコル

1. PDMS ミオタクティクプレート製作

注:PDMS MyoTACTICプレートの製造には、前に説明した30のように製造することができるPU負の金型が必要です。MyoTACTICプレートデザイン用のコンピュータ支援設計(CAD)SolidWorksファイルは、GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file)で利用可能になりました。

  1. シリコンエラストマーキットの成分を用いたモノマーと硬化剤の比率を1:15で使い捨てプラスチックカップに110gのPDMSポリマー溶液を用意する。完全に混合し、均質になるまで5 mL使い捨て血清ピペットを使用して2〜3分間ポリマー溶液を攪拌します。
    注意:皮膚や目とのPDMSポリマー溶液接触を避けてください。吸入を避けてください。液体PDMS混合物を扱う場合は必ずラボコートと使い捨て手袋を着用し、特定の安全プロトコルについては安全データシート(SDS)を参照してください。
    注:PDMSポリマー溶液流出の場合には、使い捨てカバーで機器表面(例えば、スケール、ベンチトップなど)を保護します。
  2. 室温で混合液を脱気し、カップをベンチトップ真空チャンバー内に設置し、30分間の標準デューティドライ真空ポンプに接続し、またはすべての気泡が除去されるまでを行う。脱気を助けるために5-10分ごとに真空を破ります。空の50 mLシリンジバレルを使用して空気を吸い込み、必要に応じてポリマー混合物の表面に残っている気泡を吹き飛ばします。
    メモ:6.35 mm IDチューブは、P1250ピペットチップをバレルに接続して、気流の速度と精度を向上させるために使用できます。
  3. PDMSポリマー溶液が脱気中に、乾いたペーパータオルで端と表面を静かに拭いてPU陰性モールドに付着したPDMSの残った部分を取り除きます。施設圧縮空気を使用し、70~100 kPag に設定して、残りの微粒子を除去します。
    注:PU陰性カビをシール可能なビニール袋に入れ、実験室の交通から保護された引き出しの中に保管することによって、損傷や粒子状の蓄積から保護してください。
  4. 使い捨て可能なカバーで保護されている化学フードにPU型を入れます。金型を~75°で水平に立て、離型剤の均一な層で活性面をスプレーします。金型を上から下にスプレーし、左から右にスプレーし、金型から缶を15〜20cm保持し、流体を前後に掃引する動きを使用します。金型を180°回転させ、スプレーを繰り返し、PU金型を化学フードに10〜15分間置いて乾燥させます。
    注意: リリース剤が化学発煙フード内で使用されていることを確認し、皮膚や目との接触を避け、特定の安全プロトコルについては安全データシート(SDS)を参照してください。
    注:薄膜は活性面を完全に覆う必要がありますが、次のステップでは過剰なコーティングをPDMSに移すことができるため、hMMTシードに悪影響を与える可能性があります。表面は触れるが濡れていないに滑らかな感じがする必要があります。
  5. PDMSの100gをPU金型に均等に注ぎ、回転ベーン真空ポンプに接続された真空チャンバー内に配置します。PDMS充填金型を約45分間脱気し、最初の20分間は5〜10分ごとに真空シールを破ってプロセスを加速します。PDMS混合物が全ての気泡を完全に無効にするまで真空チャンバー内に残す。
    注:ロータリーベーン真空ポンプは、低真空を達成し、このステップに必要な時間を短縮するために使用されます。PDMS充填型の脱気は、ベンチトップ真空チャンバーと標準デューティドライ真空ポンプを使用して行うことができますが、すべての気泡の混合物をボイドする時間は長くなります。必須なのは、PDMSポリマー溶液からすべての気泡の除去であり、特にhMMTアンカーポストになる予定の領域において。この領域の気泡は、アンカーポスト破損、培養井戸の損失をもたらし、ひいては小さなPDMSが金型にくさび状に残る結果となる。
  6. 脱気PDMS充填PU金型を65°Cのオーブンに移し、一晩インキュベートして液体ゴムを硬化させます。
  7. 硬化したPDMS陽性プレートをオーブンから取り出し、室温でプレートを少なくとも30分間冷却します。
  8. ブレードレスメスで、PDMSとモールドの壁の間でハンドルの背面を実行することで、硬化したPDMSをPU金型から静かに取り外します。上端に沿って開始し、金型のベースに押し下げてこの部分を取り外す前に、4つの側面をすべて分離します。このステップは、ハンドルの背面がPDMSとPU金型の4つの壁すべてとの間でスムーズに動作する場合に完了します。
    注意:PU金型を割ったり、PDMSを引き裂いたりするのを防ぐために、ブレードレスメスでゆっくりと慎重に作業してください。このステップは15-20分かかります。
  9. 一方の端から始めて、ブレードレスメスを使用してPDMSの端を持ち上げ、硬化したPDMS培養プレートとPU金型の間で指を動かします。次に、両手を使用して、プレートの下に指をさらに押し、PUモールドからゆっくりと剥がします。
    メモ:ゆっくりと作業し、均等にプレートを剥がすために両手を使用しています。曲げを最小限に抑え、アンカーポスト破損の可能性を低減します。このステップは5-10分かかります。
  10. 単一のエッジカミソリの刃を使用して、組織の播種を目的としてプレートを6±2 MyoTACTICウェル(図1)のグループに切断します。完全なMyoTACTICプレート、またはプレート部分を計器滅菌袋に入れ、120°Cおよび100-140 kPagで25分のドライサイクル(滅菌時間20分、乾燥時間5分)のオートクレーブに入れます。

2. ヒト不死化前駆細胞の培養

注:このプロトコルで使用される不死化筋芽細胞は、ミオロジー研究所(パリ、フランス)31から得られました。

  1. 液体窒素デュワーから1つのバイアルを得て、37°Cの水浴でバイアルを素早く解凍します(1分未満)。細胞は、90%の胎児ウシ血清(FBS)と10%ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる凍結培地1mLあたり7.5 x 105 細胞の密度で凍結されます。
  2. 89%DMEM 1x、10%FBS、1%ペン/ストレップからなる9mLの事前温め洗浄媒体を含む15mLの円錐形チューブにバイアルの内容物を静かに移し、DMSOを希釈します。15 mL円錐形チューブを400 x g で10分間回転させ、細胞ペレットを避けるように気をつけてメディアを吸引します。
  3. 骨格筋細胞増殖培地を含む84%骨格筋細胞基底培地からなる1mLの成長培地でペレットを再懸濁し、15%FBSおよび1%のペン/ストレップを使用し、29 mLの成長培地を有する50mL円錐形チューブに移します。
  4. 約2.5 x105細胞を含む培地10mLを100mm×20mmの細胞培養皿に移す。残りの20mLの細胞溶液でこのステップを繰り返します。その後、細胞培養皿を加湿培養インキュベーターに37°Cおよび5%CO2に設定して移送する。
  5. 1 日おきにカルチャ メディアを更新します。〜70%〜80%の合流度(通常4〜5日間)を達成するまで細胞を培養し、その時点で細胞を播種に調製する。各 hMMT を生成するには、1.5 x 105 個 のセルが必要です。したがって、必要な数の細胞を達成するために必要に応じて細胞を通過させる。
    注:不死化した筋芽前駆細胞株は、細胞をMyoTACTICウェルに播種したり、細胞を通過させたり、冷凍庫のストックを準備したりする前に、80%の合流を超えてはならない。80%の合流率を超えた細胞から作られたhMMTは、しばしば収縮期成熟に達しない。過渡手順は、手順 3 で後述する方法と同じです。

3. ミオタクティクで設計されたhMMTをシードする

  1. hMMT播種のためのミオタックティク培養井戸および試薬の調製
    注: このプロトコルは、6 hMMT を生成するための特定の詳細を提供します。
    1. 細胞播種の2〜3時間前に、6ウェルMyoTACTICプレート部分を10cm細胞培養皿に入れる。各ウェルに100 μLの5%プルロニックF-127溶液を加えて、それぞれのミオタクティブ培養を適切に準備します。10cmの培養皿に蓋をして、10cm皿と蓋の間のスペースを密封するためにパラフィンを塗布し、その後、MyoTACTIC部分を含む10cmプレートをプレートスピナーアダプターを装着した遠心分離機に入れます。
      注:遠心板のスピナーアダプターが利用できない場合、p20ピペットチップを使用して慎重にポストの後ろから泡を除去し、培養表面全体が均等にコーティングされるようにすることができます。
    2. 遠心分離機 1,550 x g 1 分間、特にポストの後ろにある文化ウェル内のすべての泡を除去します。細胞が播種のために調製されるまで4°Cで4°CでPlonic F-127溶液を含むミオタクティク板部分を含む10cmの細胞培養皿を保管する。
      メモ:プロロニックF-127コーティングは、24時間までわずか2時間で塗布することができます。例えば、井戸は翌日に使用するために一日の終わりにPluronic F-127溶液で充填することができます。hMMTリモデリングに悪影響を及ぼし、契約期に達する健全な組織を形成することができないため、24時間を超えないでください。
    3. 培養フード内の氷上に、50μL基膜抽出液アリコート1個と10μLトロンビンアリコート(100個のU/mLストック溶液)をゆっくりと解凍します。
      注:基基膜抽出アリコートを再凍結しないでください。彼らは単一の使用です。トロンビンアリコートは再利用可能であり、従って、使用後5回まで再凍結する。
    4. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ中の粉末フィブリノーゲンの重量を約7mg、次いで細胞培養フードに移します。水(または生理食液)に0.9%(wt/vol)NaCl溶液の700 μLを加えて、10 mg/mL最終濃度溶液に到達します。ボルテックスフィブリノーゲンを溶解させないでください、代わりに37°Cの細胞培養インキュベーターに3〜5分間チューブを入れる。
    5. チューブを取り外して軽くフリックし、溶解した溶液をベンチトップのミニ遠心分離機(マイクロフュージ)にパルス回転させ、培養フードに戻します。0.22 μmのシリンジフィルターを装備した1 mLシリンジを使用してフィブリノーゲン溶液をフィルターします。溶存したフィブリノーゲン溶液を、基膜抽出物およびトロンビンアリコートと一緒に氷に移す。
    6. 最後に、組織の播種後に培養井戸に導入されるhMMT播種培地を準備する。この培地には、20%FBS、1%P/S、3%6アミノカプロン酸を添加した骨格筋細胞基底培地が含まれています(ACA;1.5 mg/mL最終濃度は50mg/mLストック溶液から希釈することによって達成され、%はv/vとして表されます)。使用前に37°Cでメディアを事前に温めてください。
  2. hMMT播種のための細胞の調製。
    1. 培養インキュベーターから細胞培養プレートを回収する。各プレートから培地を吸引し、次いで、各培養プレートに5mLのD-PBSを加えてD-PBSで細胞を1回洗浄した。次にD-PBSを吸引し、各培養皿に0.25%トリプシン-EDTAの1mLを加えて細胞を取り外す。細胞培養インキュベーターに3分間入れる。
    2. 培養皿に3 mL洗浄媒体(1x DMEM + 10% FBS + 1%ペン/ストレップの89%)を加えてトリプシンを停止します。細胞溶液を適当な大きさの円錐形チューブに移し、その後、400xgで遠心分離して細胞を10分間ペレットする。細胞ペレットを避けるために注意を払ってメディアを吸引します。次いで、細胞ペレットを洗浄媒体の1mLに再懸濁する。
    3. ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、明視野顕微鏡下で青色の染料を試量します。
      細胞の複数のプレートを使用する場合、この細胞懸濁液は非常に濃縮されます。必要に応じてカウントする前に希釈細胞懸濁液。
    4. 各組織は細胞外マトリックス(ECM)混合物の15 μLに再懸濁した150,000個の細胞を必要とするため、6組織に対しては90μLのECM混合物中の900,000個の細胞が必要です。気泡形成またはピペット損失による調製プロセス中に生じる細胞-ECM溶液損失を考慮して、余分な細胞-ECM混合物(すなわち、8組織、またはECMの120μLの1,200,000細胞)を調製する。1,200,000個の細胞を含む細胞懸濁液の体積を新しい円錐形チューブに移します。洗浄媒体で体積を10mLに上げ、400 x g で10分間回転させます。
    5. 細胞が回転している間、次のレシピを使用して1.5 mLマイクロ遠心チューブに150 μL ECM混合物を調製します。まず60 μLのDMEM(40%体積)を加え、フィブリノーゲン10 mg/mL溶液(40%の体積)を60 μL加え、最後に30 μLの原膜抽出物(20%体積)を加えます。使用するまで氷の上にECM混合物を保存します。
      注:基底膜抽出物を含む溶液を使用する場合は、常に-20°Cで予冷したチップを使用してください。ECM混合物は、フィブリノーゲンの4mg / mLを含みます。
  3. hMMTs をシードする
    1. 細胞を紡ぎ下ろした円錐管を回収し、細胞ペレットを避けるように気をつけてメディアを吸引する。手袋をした指でチューブの端を激しくフリックしてペレットを取り出し、ペレットが細胞スラリーとして現れるまでフリックを続けます。
      注:セル-ECM懸濁液が所望の希釈状態であることを確認するために、できるだけ多くの洗浄媒体を吸引することが重要です。必要に応じて、残りの洗浄媒体を除去するためにピペットを使用します。
    2. 120 μLのECM溶液を細胞ペレットを含むチューブに移します。ピペットを上下にして、ECM内の細胞を完全に再懸濁させて単一の細胞懸濁液を生成する。ピペットはゆっくりと慎重に気泡を導入しないように、作業量を減らします。その後、使用するまで氷の上にセル-ECM溶液を置きます。
    3. 4 °C冷蔵庫からPluronic F-127被覆ミオタクティブ井戸を含むMyoTACTICプレート部分を取り出し、細胞培養フードの中のアイスパックの上にMyoTACTIC井戸を含む10cm皿を置きます。
    4. 各ウェルからプルロニックF-127溶液を吸引します。PDMSは多孔質であり、特にプレートが遠心分離機で回転した場合、プルロニックF-127溶液を浸します。残留Pluronic F-127溶液を放出し、井戸を5分間座らせてから再び吸引させることで、ウェルの底に落ち着きます。
      注:P1250チップが最後に取り付けられたパスツールピペットを使用し、Pluronic F-127ソリューションを吸引する際にはp1250チップの上にp200チップを使用してください。これにより、ポスト構造の偶発的な吸引を防ぐために精度が向上します。プルロニックF-127コーティングを破壊し、hMMT自己組織化プロセスを妨げるので、ピペットでウェルの底部にある楕円形のプールの形をしたセルシード領域を削らないようにしてください。適切な技術は、プルロニックF-127溶液を吸引しながら、ちょうど楕円形プールの上にピペットの先端をホバリングすることです。
    5. ピペット細胞-ECM懸濁液は、チューブの底部に沈んだ可能性のある細胞を慎重に再懸濁させる。その後、105 μLのセル-ECM懸濁液を、新鮮な冷蔵1.5 mLチューブに移します。チューブを上に近づけて、溶液が温まるのを防ぎます。
    6. 100 U/mLトロンビンストック溶液の0.84 μLを105 μLのセルECMサスペンションに加え、0.2 U/mgのフィブリノーゲンの最終濃度に到達します。ピペットは、泡の導入を避けながら、迅速、慎重、そして完全に混合する。
      注:トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリン血栓への急速な転換を開始します。したがって、トロンビン添加時に組織を播種する時間は限られている。細胞-ECM混合物が培養井戸に移される前に早期凝固を避けるために、トロンビンを加える前にp20ピペットを15 μLにセットしてください。プリチルドチップを使用するか、ピペットチップを氷冷DMEMに数秒浸してから、セル-ECM混合物の15 μLを各ウェルに集めて転送します。一度に6 hMMT以下が播種されないような細胞-ECM混合物アリコートを調製するのがベストプラクティスです。
    7. 組織をシードするには、各個体ウェルに15μLの細胞-ECM混合物(すなわち150,000個の細胞)を加えます。慎重に楕円形プールの中心にセルECM混合物を追加し、ウェルの底部にピペットチップを押すことを避けます。その後、2つの軽い動きで、ウェル内の各ポストの後ろに細胞懸濁液を広げる。表面がセルECM懸濁液で均等にコーティングされたら、次の井戸に進みます。
      注:すべての組織が播種される前に、チューブ内の細胞-ECM混合物の早期ゲル化を避けるために効率的に作業してください。ウェルをシードする場合、気泡がhMMTの改造を妨げ、hMMTが使用できなくなるため、気泡の移動を避けることは非常に重要です。
    8. 10cmの培養プレートに蓋を入れ、播種したウェルを入れ、約5分間37°Cの組織培養インキュベーターに移します。
      注:ゲル重合プロセスの確認として、残余セル-ECM混合物を含むマイクロ遠心チューブをインキュベーターに入れます。
    9. 細胞-ECM混合物が重合した後、各MyoTACTICウェルに200 μLの温め込みhMMTシード媒体を加えます。10cm皿の蓋を交換し、10cm皿内のMyoTACTICプレート部分をインキュベーターに戻します。この時間は、Day -2 と呼ばれます。次のステップまで組織を邪魔しないでください。
  4. hMMT を区別する
    1. 2日間のインキュベーションの後、ピペットを使用してhMMTシード培地を慎重に取り出し、2%の馬血清、1%のペン/ストレップ、4%ACA(すなわち、50mg/mLのストック濃度から2mg/mL最終濃度)および10μg/mを含む200μLの前温化分化培地に置き換えます。この時点は、差別化の 0 日目と呼ばれます。
    2. その後1日おきに、培地の半分を12日目の分化まで、培養の最終日まで、新鮮な分化媒体と交換する(図2a)。
      注:原発性ヒト筋芽細胞を用いてhMMTを製造するためのプロトコルの詳細は、他の場所で公開されています30.細胞生存率ポストシードに懸念がある場合は、カルセインとヨウ化プロピジウムでhMMTをインキュベートして生存率を定量化する。

4. hMMTによるポスト偏向の電気的刺激と解析

  1. 反転した顕微鏡に透明な底ガラスまたはプラスチック製のステージマウントを設置し、顕微鏡カメラマウントを使用してスマートフォンカメラを顕微鏡接眼に取り付けます。10倍倍率での位相コントラスト顕微鏡が用いられる(図3a)。
    注:10倍の倍率の目的を備えた反転位相コントラスト顕微鏡は適切です。PDMS井戸の構造は10 cm皿から取除かれ、明確な底の段階の台紙に直接置かれ、したがって、空気に開く。70%エタノールですべての表面と機器を殺菌し、実験中にエリア内のトラフィックを最小限に抑えます。
  2. 電気刺激電極を準備するために、スズコーティング銅線の30cmをカットする。次に、25G正規のベベル針のハブから、上半分の周りにワイヤーの約10cmをしっかりと包み、約20cmの余分なワイヤーを残します。2本目の針を繰り返し、ハブを各針から切り落とします。
    注:ワイヤは、それが移動しないことを確認するために針の周りにしっかりとする必要があり、これは電界の生成を妨げる可能性がありますので、電極のワイヤラップ部分は、PDMSに触れてはいけません。
  3. 波形発生器の出力チャンネルにBNCをワニのクリップコネクタケーブルに接続し、20%デューティサイクル、5 V振幅(電界強度10V/cm)で四角パルスのチャンネルを設定します。周波数は、ツイッチと破傷風の収縮のために、それぞれ0.5 Hzと20 Hzの間で変化します。
    注: 波形発生器の設定には、実験固有の最適化が必要な場合があります
  4. hMMTを含むMyoTACTICプレート部分を顕微鏡ステージに配置し、各電極ベベル端を楕円形プールの各ポストの真後ろにあるPDMSにそっと挿入します。余分なワイヤーの20cmのセクションを慎重にテープで顕微鏡ステージに入れ、針が垂直に保たれ、各ワイヤの〜10cmが接続のために自由なままになるようにします(図3a)。
    注意:電極の両端に素指を置かないでください。PDMSへの挿入時に電極に軽圧を加えるために、シンブルが人差し指に装着されていることを確認します。
  5. 電極に最も近いポストエッジに焦点を当てるように、2つのポストのいずれかに顕微鏡の視野を集中させます。その後、スマートフォンのカメラフォーカスを投稿の最も明確な領域にロックします。これは、記録が分析を妨げる間に焦点を合わせると、ダウンストリーム解析にとって重要です。
  6. テーピングされたワイヤのフリーエンドを、ワニクランプを介して波形発生器に接続します(図3a)。
  7. スマートフォンのカメラでビデオ録画を開始し、チャンネル出力をオンにして刺激を開始します。hMMTに3つのけいれんと3つの破傷風収縮を受け、けいれんと破傷風刺激シリーズの間に2分の休息を与える。
  8. チャンネル出力をオフにし、スズコーティングされた銅線からワニクリップを取り外し、テープをワイヤから取り外し、各電極を70%エタノールで拭いてから、後続のhMMTウェルに挿入します。すべての hMMT に対して、ステップ 4.5 から手順を繰り返します。
    注:hMMTがインキュベーターの外で過ごす時間を制限するには、一度に3つ以下の組織を刺激します。MyoTACTICプレート部分内の追加のhMMTが分析されない場合は、プレートを10分間インキュベーターに戻してhMMTを37°Cに戻します。
  9. hMMT フォース生成を計算するためにポスト偏向を分析するには、GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC) で使用可能になったカスタム スクリプトを使用します。README.md の指示に従ってスクリプトをセットアップして起動し、各投稿追跡ビデオを開いて力分析を実行します。
  10. ポストディスプレイに対して追跡するポスト エッジに沿った関心領域(ROI)を選択します。 Enter キーを押して ROI を確認し、 もう 一度 Enter キーを押してスクリプトを実行します (補足ビデオ 1)。
    メモ: 大きな偏向により、トラッカーが失敗します。収縮中にトラッカーが失敗した場合、ROI サイズを大きくしてトラッキングの感度を低下させますが、大きなたわみの追跡を許可することができます。コードには 3 つのサイズが用意されており、スクリプトコメントを調整することで調整できます。
  11. スクリプトは、2 つの入力要件で終了します。まず、y と入力して、ビデオに複数の収縮が含まれていることを確認します。次に、結果を にエクスポートする場合はy (yes) またはn (いいえ) と入力します。CSVファイル(補足ビデオ1)。
  12. ポスト偏向結果が、収縮ごとにピクセル単位で変位として報告されることを確認します。顕微鏡 10x 倍率設定のピクセルを μm 値に変換します。次に、MyoTACTIC製造30で用いるPDMSの1:15硬化剤に相当する2.36μN/μmの力変位変換係数を掛けて、ポスト変位数を絶対収縮力(μN)に変換する。

5. 電気刺激によるカルシウム過渡解析

注:カルシウム処理実験では、不死化筋芽細胞は、前述の11,12に記載されているようにMHCK7-GCAMP6レポーターと安定して伝達された。トランスデューセド細胞は、正の集団を得るためにGFPのためにFACSを選別し、次いでhMMTを製造するために使用した。Flua-2 AMやIndo-1などの比メトリック色素を使用するなどのカルシウムイメージングの代替方法や、カルシウム指標の蛍光寿命イメージング(Fluo-4またはオレゴングリーンBAPTA1など)は、当社のシステムに適している可能性があります。

  1. ステップ4で前述したように、顕微鏡ステージと刺激装置(電極、波形発生器など)を設置します。この実験では、4 倍の倍率を使用します。
    注意:暗い部屋とCCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡が必要です。
  2. 顕微鏡イメージングソフトウェアを起動し 、FITCフィルタチャンネル (青色光)を選択し、 ムービー記録機能を選択します。露出が 500 ミリ秒、解像度は 680 x 510 (ビニング 2x2) で設定します。
    注: イメージング ソフトウェアは、ユーザーが手動で設定する場合や、露出を設定する場合があります。刺激前にhMMTが露出を避けるように注意してください。安静時には、自然蛍光を伴う暗い組織の輪郭/影は正常であり、透明な組織画像は露出を超えている(補足ビデオ2)。実験内のすべての hMMT に対して、露出が一貫していることを確認します。
  3. 顕微鏡シャッターを閉じ、FITCチャンネルをオフにしてカルシウムの取り扱いを記録する準備が整います。
  4. すべての機器とソフトウェアをセットアップしたら、分析するhMMTを含むMyoTACTICプレート部分を取り出し、顕微鏡ステージに直接設定します。次に、ステップ4で前述したように電極を挿入し、接続します。
  5. 選択した hMMT の中心に視野を合わせるには、明視野を使用します。次に、ランプを消します。
  6. 顕微鏡FITCチャンネルシャッターを開き、青色のライトが点灯したことを確認し、ソフトウェアで 「ムービーレコード」 を選択します。
  7. 波形発生器の出力をオンにして、電気刺激を開始します。hMMTに8つのけいれんと8つの破傷風の収縮を受けるよう誘導する。ぴくぴくと破傷風刺激シリーズの間の残りの2分を可能にし、その間、FITCシャッターは閉じた位置にある。
    注:電気刺激の前後に10 sの自発的な活動を可能にし、計算とデータ分析の目的で最小蛍光を記録します。
  8. チャネル出力をオフにし、スズコーティングされた銅線からワニクリップを取り外し、テープをワイヤから取り外し、各電極を70%エタノールで拭いてから、後続のhMMTウェルに挿入します。すべてのhMMTに対して刺激と記録手順を繰り返します。
  9. 画像J、または代替イメージングソフトウェアで分析するためにTIFFファイル形式でムービーを保存します。
    注:hMMTがインキュベーターの外で過ごす時間を制限するには、一度に3つ以下の組織を刺激します。MyoTACTICプレート部分内の追加のhMMTが分析される場合は、hMMTが37°Cに戻るように10分間インキュベーターにデバイスを戻します。
  10. カルシウム過渡性データを分析するには、最初に ImageJ を開きます。[ 分析]、[ 計測値の設定] の順に選択し、[ グレーの平均値 ] を選択して、その他すべてのオプションを選択解除します。完了したら、カルシウム(.tiff)ビデオ(補足ビデオ2)を開きます。
  11. ポリゴン選択ツールを使用して、微小組織の境界をアウトライン化し、ROI(補足ビデオ2)としてこの領域を保存します。[ROI マネージャ] ウィンドウの [マルチメジャー ] を選択し、スライスごとに 1 行のすべてのファイル スライスの蛍光強度を測定します (補足ビデオ 2)。
  12. スライス番号(フレーム)を含むすべての測定値をスプレッドシートにコピーし、ΔF/F0 = (F即時 - F最小)/F最小 (補足ビデオ2)を使用して、各スライスの蛍光強度をファイルからの最小自発的蛍光強度と比較します。
  13. 各フレームの時間を、映画録画フレーム速度にスライス数(フレーム)を掛けて計算し、刺激に対するhMMTカルシウム過渡応答の時間に対してΔF/F0をプロットする(補足ビデオ2)。
  14. 6つの連続した収縮および平均値のそれぞれについてピークカルシウム過渡信号を選択して、各hMMTの相対的な平均ピークピーク蛍光強度変化を計算する(補足ビデオ2)。
    注: 最初のけいれん収縮から生じるデータは、常に全体解析から除外してください。hMMTカルシウム過渡解析を容易にするために、GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-)に「カルシウム処理テンプレート.xlsx」と題するスプレッドシートが提供されました。値と入力を入力する入力可能セルは、グレーでハイライト表示されます。ピーク選択数はピーク選択を支援するガイドだけであるため、ピーク選択数を調整してください(補足ビデオ2)。

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結果

本明細書で説明する方法は、PU型から96ウェルPDMSベースのミオタクティブ培養プラットフォームをキャストし、hMMT複製組織の配列を作製し、培養装置力生成およびカルシウム処理におけるhMMT関数の2つの側面を分析する方法である。図1は、hMMTシード処理前のMyoTACTIC培養井戸の調製の概略図を示す。PDMSは、広く使用されているシリコーン系ポリマーであり、複雑なデバイス32を作成するために容易に成形することができる。PDMS ベースのプロトコルは、製造された負の PU 金型30から 96 ウェルの培養装置の無制限の数をキャストするように設計されました。最終的な硬化PDMS陽性プレートは柔軟性があり、単一のエッジカミソリブレードの助けを借りて、より小さなサイズの機能的ユニットに簡単に切断することができます(図1)。これにより、ユーザーは、実験計画に固有のhMMTレプリカのニーズを満たすようにデバイスを拡張できます。これ...

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ディスカッション

本稿では、基本的な筋生物学、疾患モデリング、または候補分子検査の研究に適用できる3D hMMT培養モデルを作成し、分析する方法について説明します。MyoTACTICプラットフォームはコストに優しく、製造が容易で、骨格筋マイクロ組織を生成するために比較的少数の細胞を必要とします。MyoTACTIC培養プラットフォーム内で形成されたhMMTは、整列、多核、および線条筋のミオチューブから構成され、収縮を引き起こすカルシウム過渡を開始することによって電気刺激に応答する(図2、図3、図4)。以前の研究は、hMMTが生化学的刺激に対して同様の応答を提供し、より大きな形式の3D骨格筋モデル12、30で報告されたものと一致する成熟レベルに達することができることを示した。

MyoTACTICプレートの製造と...

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開示事項

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

謝辞

私たちは、モハマド・アフシャール、ハーベン・アブラハ、モフセン・アフシャル・バクーシュリ、およびサデグ・ダブーディがMyoTACTIC文化プラットフォームの発明に貢献し、ここに記載されている捏造および分析方法を確立してくれたことに感謝します。HLは、オルガン・オン・チップ・エンジニアリング・アンド・アントレプレナーシップ奨学金の自然科学・工学研究評議会(NSERC)トレーニング・プログラムとトロント大学ワイルドキャット大学院奨学金から資金を受け取りました。PMGは内因性修復のカナダ研究委員長であり、オンタリオ州再生医療研究所、幹細胞ネットワーク、カナダ第一研究優秀プログラムである医学によるデザインからの研究の支援を受けています。スケマティック ダイアグラムは、BioRender.com を使用して作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9% 生理食塩水、滅菌ハウスブランド101010 mL アリコートの溶液が作られ、4°Cで保存されます。C
25GニードルBD、Medstore、トロント大学2548-CABD305127
6-アミノカプロン酸、≥99%(滴定)、PowderSigma - AldrichA2504-100GA 50 mg / mL原液は、5 mgの6-アミノカプロン酸粉末を100 mLのオートクレーブ蒸留水に溶解することにより生成されます。溶液は真空ろ過され、10mLのアリコートは4°Cで保存されます。C
6.35 mm ID チューブVWR60985-528
AB1167 筋芽細胞株Institut de Myologie (パリ、フランス)
任意波形発生器RigolDG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)サーモフィッシャーサイエンティフィックA14132-0250 & micro;Lまたは100µL at -80°C
ベンチトップ真空チャンバーシグマ-AldrichD2672
BNC-アリゲータークリップケーブルAmazon
Culture PlasticsSarstedt培養プレート、血清学的ピペットなどが含まれています
ジメチルスルホキシドシグマ-AldrichD8418-250ML
DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウムなしサーモフィッシャーサイエンティフィック
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム (DMEM) (1X)Gibco11995-065これは、L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムを含む高グルコースDMEMです
胎児ウシフィッシャー10437028
フィブリノーゲン ウシシグマ - アルドリッチF8630-5G7 - 10 mg のフィブリノーゲン粉末のアリコートが作られ、-20°C で保管されています。C
Filtropur シリンジ フィルター、0.22um 細孔サイズSarstedt83.1826.001
馬血清Gibco16050-122
ヒト組換えインスリンシグマ - Aldrich91077Cストック ソリューションは 100X で、1 mg のヒト組換えインスリンを 1 mL の DMEM と 1 & micro に溶解して作られます。NaOH 10NのL。溶液をろ過し、1mLアリコートとして4°Cで保存します。C
画像取得ソフトウェアOlympuscellSens Dimension
画像処理ソフトウェア国立衛生研究所ImageJ
Isotemp OvenThermo Fisher Scientific201
顕微鏡OlympusIX83
Microscope - Camera MountLabcamfor iPhone Amazonから注文
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)Gibco15140-122
プラスチック使い捨てシリンジ、1ccBD2606-309659
プラスチック使い捨てシリンジ、50ccBD2612-309653
プルロニック F-127、粉末、バイオ試薬シグマ - AldrichP2443-250Gプルロン酸の5%ストック溶液は、5gのプルロン酸粉末を100mLの冷却オートクレーブ滅菌蒸留水に溶解することによって作られます。溶液は真空ろ過され、10mLのアリコートは4°Cで保存されます。C
ポリジメチルシロキサン (Sylgard 184 シリコーンエラストマーキット)ダウ4019862キットは、サーモフィッシャーサイエンティフィック、シグマ-アルドリッチなどでも販売されています。
ポリウレタンネガティブモールドインハウス
リリースエージェントマンリリーステクノロジー200
ロータリーベーン真空ポンプエドワーズA65401906
メスアルメディック、メドストア、トロント大学2586-M36-0100
シングルエッジカミソリブレードVWR55411-050
骨格筋細胞基礎中型プロモセルC-2326030 mL分注が生成され、4°Cで保存されます。
骨格筋細胞増殖培地(Ready-to-use)PromocellC-2306042 mLアリコートは、4°Cで生成および保存されます。
スマートフォン (iPhone)アップルSE
標準仕様 ドライ真空ポンプウェルチ2546B-01
除菌袋アライアンス211-SCM2
指ぬきイゲゲアマゾンから取り寄せた
トロンビン ヒト血漿シグマ - アルドリッチT6884-250UN100単位のトロンビンを0.1%BSA溶液1mLに溶解します。10 µLアリコートは-20°Cで調製および保管されます。
錫被覆銅線アルコB8871K48アマゾンから注文
トリパンブルーソリューション、0.4%サーモサイエンティフィ15250061
トリプシン-EDTA、0.25%サーモフィッシャーサイエンティフィック25200072
真空チャンバー2SP Bel-ArtF42027-0000
から注文 21600069血清 科学ック

参考文献

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