遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

Summary

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。

Abstract

樹状樹木をパターン化するメカニズムを発見するには、開発中に樹状突起を視覚化、画像化、解析する方法が必要です。マウス網膜は、ニューロンの形態形成および接続性の細胞型特異的メカニズムの調査のための強力なモデルシステムである。網膜サブタイプの組織と構成は明確に定義されており、遺伝的ツールは開発中に特定のタイプにアクセスするために利用可能です。多くの網膜細胞タイプはまた、樹状突起および/または軸索を狭い層に拘束し、タイムラプスイメージングを容易にする。マウス網膜外植体培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージングには適しているが、樹状突起ダイナミクスを時間的および構造的分解能でイメージングするために最適化された方法は欠けている。ここで提示されるのは、Cre-Loxシステムによってマークされた特定の網膜集団の発達をまばらに標識し、画像化する方法です。ここで用いた市販のアデノ随伴ウイルス(AAV)は、膜標的蛍光タンパク質をCre依存的に発現させた。新生児マウスにおけるAAVの眼内送達は、注射後4〜5日(dpi)までに標的細胞型の蛍光標識を生じる。膜蛍光シグナルは共焦点イメージングによって検出可能であり、微細な分岐構造およびダイナミクスを分解する。2~4時間にわたる高品質のビデオは、酸素化人工脳脊髄液(aCSF)を灌流した画像網膜フラットマウントから取得されます。また、デコンボリューションと3次元(3D)ドリフト補正のための画像後処理パイプラインも提供されます。このプロトコルは、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉し、神経突起形態形成を制御する新規因子を同定するために使用することができる。網膜で学んだ多くの発達戦略は、中枢神経系の他の場所にある神経回路の形成を理解するのに適切であろう。

Introduction

網膜ニューロンの樹状突起は、神経回路内での機能に影響を与える複雑でありながら特異的なパターンを形成する。脊椎動物の網膜では、多様なタイプの網膜神経節細胞(RGC)とアマクリン細胞介在ニューロンが、樹木の大きさ、位置、枝長、密度が異なる独自の樹状突起形態を持っています¹。出生後の発達中、RGCとアマクリン細胞は、熱狂的な樹状突起を内側プレキシフォーム層(IPL)と呼ばれるニューロピルに拡張し、そこでバイポーラ細胞入力を受け取り、光受容体シグナルを伝達します²。ヒナまたはゼブラフィッシュの幼虫における蛍光標識網膜集団のタイムラプス画像化によってキャプチャされるように、樹状突起形態形成は非常に動的である^3,4,5。数日のうちに、樹状樹木はIPLの狭いサブレイヤーに拡大、改造、および影響し、そこで選択されたパートナーとシナプスします。樹木は、枝の追加、後退、および安定化の相対的な速度の変化を伴う、発達にわたって異なる構造ダイナミクスを示す。アマクリンおよびRGC樹状突起はまた、タイプ特異的樹木化を反映する可能性のある異なる外生およびリモデリング挙動を示す。しかし、これらの研究は、広範なアマクリンまたはRGC集団を追跡し、形態学の1つの側面にすぎない層状標的化に焦点を当てた。

網膜サブタイプ全体で観察された広大な形態学的多様性を生み出すメカニズムは、ほとんど理解されていない。このグループの目的は、マウスにおける定義された網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスおよび樹木リモデリングを捕捉する方法を開発することであった。樹状突起パターニングの細胞型特異的メカニズムを同定するには、目的の細胞の樹状突起挙動を視覚化および測定する方法が必要である。マウス網膜の有機型培養は、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を用いた生細胞イメージング研究によく適している。発達中の網膜は解剖され、平坦な外植体に装着され、記録チャンバーで数時間画像化することも、回路への影響が限定的な状態で数日間にわたって培養することもできます^6,7。生きた網膜ニューロンは、電極による色素充填、エレクトロポレーション、親油性色素でコーティングされた粒子のバイオリスト送達、蛍光タンパク質をコードするプラスミド(例えば、Gene Gun)、ならびに遺伝的にコードされた細胞標識7、8、9、10を含む様々な技術によって標識することができる⁷、^8、9、10.しかし、これらのアプローチは、特定の網膜サブタイプの樹状突起ダイナミクスを画像化するのに非効率的である。例えば、色素充填法はスループットが低く、目的の細胞を確実に標的とするために電気生理学装置と追加の遺伝子標識が必要です。さらに、ソーマの強い蛍光シグナルは、近くの樹状突起を不明瞭にする可能性があります。

バイオリスティック遺伝子送達法は、数十個の細胞を同時に標識することができるが、高圧粒子送達および単離された網膜の一晩インキュベーションを含むステップは、細胞生理機能および樹状突起伸長を損なう可能性がある。本稿では、以下の実験基準により、初期の樹状突起ダイナミクスを細胞型と構造分解能で捉えるために、最近の遺伝的ツールを利用できることを提案している。まず、発達中の樹木園を支配する微細な枝および糸状体を解くために、この方法は、樹木全体のプロセスを満たす明るく蛍光タンパク質でニューロンを標識すべきである。蛍光標識は、イメージング期間中のフォトブリーチングのために退色してはならない。様々な蛍光タンパク質変異体が生成され、輝度と光安定性に基づいて、in vivo/ex vivoイメージング¹¹への適合性について比較されています。第二に、蛍光タンパク質(XFP)は、狭い発生窓が見逃されないように、樹状突起形態形成の初期段階によって十分に高いレベルで発現されなければならない。マウス網膜の静的な時点の分析では、樹状突起の発生は出生後最初の週に起こり、外生、リモデリング、および安定化の段階を含む10,12,13,14,15。第3に、この方法は、選択的標識、または関心のあるニューロン亜集団の標識化の確率の増加につながるはずである。第四に、標的亜集団の標識は、ニューロンアーバー全体を同定および追跡できるように、十分に疎でなければならない。RGCおよびアマクリンサブタイプは、成熟した形態学的特徴およびIPL層別化パターン16,17,18,19,20によって区別することができるが、課題は未成熟構造に基づいて開発中にサブタイプを同定することである。この作業は、発生中に特定の網膜細胞型を標識するためのトランスジェニックツールの拡大によって促進される。

蛍光タンパク質またはCreの細胞的および時間的発現が遺伝子調節要素によって決定されるトランスジェニックおよびノックインマウス系統は、網膜細胞型を研究するために広く使用されている13,21,22,23。樹状突起発生のサブタイプ特異的パターンに関する主要な観察は、静的な時点におけるトランスジェニックマウス網膜の研究から来ている^10,14,24,25。特にCre-Loxシステムは、さまざまなリコンビナーゼ依存性レポーター、センサー、および光遺伝学的アクチベーターを使用して、サブタイプの絶妙な遺伝子操作およびモニタリングを可能にします。これらのツールは、網膜回路アセンブリの根底にあるサブタイプ特異的分子プログラムと機能特性の発見をもたらしました^{26,27,28,29,30}。しかし、マウス網膜におけるサブタイプ特異的樹状突起ダイナミクスの研究にはまだ活用されていない。低密度標識は、Creマウス系統とエレクトロポレーションまたは組換えAAVによって導入された導入遺伝子を組み合わせることによって達成することができる。利用可能な場合、タモキシフェン誘導性クレラインまたは交差遺伝子戦略も使用することができる。最後に、細胞は低侵襲の方法で標識され、組織を損なわないように、または樹状突起形態形成に必要な細胞機能を妨げないように、取得パラメータを使用して画像化されるべきである。

ここでは、生きたマウス網膜外植体における樹状突起ダイナミクスを調べるために、トランスジェニックツールおよび共焦点顕微鏡法を適用する方法を提示する。Creトランスジェニックマウス系統は、Cre組換え時に蛍光タンパク質を発現するAAVベクターと組み合わされており、これにより、目的の網膜細胞のまばらな標識が可能になる。市販のAAVは硝子体内注射によって新生児網膜に送達される。この論文は、AAVが4dpiで有意に高い細胞型特異的蛍光発現を産生し、出生後の時点へのアクセスを可能にすることを実証する。このアプローチを説明するために、コリン作動性「スターバースト」アマクリンインターニューロンを、出生後早期網膜で活性であるコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)-内部リボソーム侵入部位(IRES)-Cre導入遺伝子を発現する新生児マウスにおいてBrainbow AAVを送達することによって標識した^31,32。スターバーストアマクリン細胞は、クラスター化されたプロトカドヘリンによって媒介される樹状突起自己回避によって形作られたステレオタイプ化された放射状のアーバー形態を発達させる^33,34。本論文は、Brainbow ^AAVs31に用いられているように、ファルネシル化を受けるCAAXモチーフを添加することにより、原形質膜にXFPsによってスターバースト樹状突起と糸状体形成の分解能が有意に向上することを示している。最後に、デンドライト再構成および形態測定定量化に適した高品質の画像を生成するタイムラプスイメージングおよび後処理プロトコルが決定された。このプロトコルは、樹状突起の形態形成を制御する因子を同定し、無傷の網膜におけるいくつかの細胞挙動を捕捉するために使用することができる。

Protocol

注:このプロトコルは2日間にわたり、実験日間のウイルス形質導入の最小期間は4〜5日間です(図1A)。動物実験は、病気の子供のための病院(トロント、カナダ)の動物サービス実験所動物の使用およびケア委員会によって承認されたプロトコルに基づいて、研究および実験動物ケアにおける動物の使用に関するカナダ動物ケアガイドライン評議会に従って行われます。

1. 新生児AAV注射およびイメージング実験のための準備

1. Creマウスラインを選択して、目的の網膜細胞集団にラベルを付けます。AAV注射時のCreリコンビナーゼ発現は、Creトランスジェニックレポーターとの交配またはCre抗体による免疫染色によって確認する。
2. トランスジェニックCreマウス(8〜16週齢)を繁殖させ、Cre陽性新生児動物を作製した。
   注:このデモンストレーションでは、ChAT-IRES-Creノックインマウスを使用して、コリン作動性スターバーストアマクリン細胞を標的とした。
3. 蛍光タンパク質をコードするリコンビナーゼ依存性AAVウイルスを取得する。微細プロセスの最適な標識のために、原形質膜を標的とする修飾XFPを発現するベクターを選択する。
   注:この研究では、多色ラベリングのオプションを提供するBrainbowウイルス(BBV)、AAV-EF1a-BbTagBY、AAV9-EF1a-BbChT(材料表を参照)を使用しました(図1B)。ファルネシル化増強黄色蛍光タンパク質(eYFP)および単量体チェリー(mCherry)発現は、ライブイメージングにおいて最も強い蛍光シグナルを産生した。単一のBBVを使用して個々の樹木を画像化し、BBVの共注入を使用して、より多くの細胞または隣接する樹木を別個の蛍光色素で標識することができます。複数の蛍光タンパク質を使用する場合は、発光スペクトルの重複を最小限に抑えてください(図1C)。顕微鏡集録パラメータを調整して、個別のXFP信号をキャプチャする必要があります。
4. 凍結/融解サイクルを避けるために、使い捨てストック用の個々の低結合チューブに約3〜5μLのAAVアリコートを調製します。-80°Cで保存してください。
5. マイクロピペットプーラーを使用して、非常に細かい先端を持つホウケイ酸ガラスマイクロピペットを準備します。
   メモ: プーラーの設定は、使用するフィラメントとプーラーによって異なります。最終的な先端のサイズと形状については、 図2A を参照してください。典型的な液滴直径は600μmである。
6. マイクロインジェクションシステムおよび関連するチューブを入手します。マイクロインジェクタを加圧エアポートに接続します。

図1:実験の概要 。(A)このプロトコルは、実験期間が2日間に及び、実験日の間に最低4~5日間の感染期間を設けています。眼内注射は、出生後3日目より齢でない新生児マウスに対して行われる。その後、網膜を解剖し、フラットマウントし、ライブイメージングして、所望の発達窓をキャプチャします。標識された細胞は、樹状突起形態に対する長期AAV発現の明らかな影響がないため、ウイルス発現に必要な4〜5日後いつでも画像化することができる。(b)Cre依存性Brainbow AAVベクター(BBV)を、^Cre31を発現する動物に注射する。この研究では、ChAT-Creノックインマウスを用いて、スターバーストアマクリン細胞におけるCre組換えを駆動した。2つのBBVは、修飾されたeYFPまたはtagBFP、またはmCherryおよびmTFPをコードし、膜局在化のために順次ファルネシル化された CAAX モチーフで終了する。ロックスのサイトは三角形で描かれています。ベクターは、Cre組換えに依存する確率的および組み合わせ的様式でいずれかのファルネシル化XFPを発現する。 EF1α プロモーターには、伸長因子1α遺伝子由来の調節エレメントが含まれる。Wはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント由来のエレメントを示し、pAはポリアデニル化配列を示す。(c)mCherryおよびeYFPの励起スペクトルおよび発光スペクトルを、本研究で画像化したBBV蛍光団。複数の蛍光タンパク質をライブイメージングする場合、発光スペクトルを別々のチャネルに適切に分離するように検出パラメータを配置する必要があります。略語: AAV = アデノ随伴ウイルス;BBV = Brainbow AAV;ChAT = コリンアセチルトランスフェラーゼ;iRES = 内部リボソーム侵入部位;eYFP = 増強黄色蛍光タンパク質;iTR = 反転端子リピート;tagBP = タグブルー蛍光タンパク質;mCherry = 単量体チェリー;mTFP = 青緑色蛍光タンパク質;XFP = 任意の蛍光タンパク質;EF1α= 伸び係数 1 アルファ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 新生児マウスにおけるAAVの硝子体内注射

1. 氷の上でAAVアリコートを解凍する。滅菌生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水を使用して〜1:4のAAV希釈液を調製する。マイクロピペットが壊れ、新しいピペットを充填する必要がある場合に備えて、動物あたり約0.5 μL(1眼あたり約0.25 μL)のAAV希釈液を準備します。残りの希釈されていないAAVを4°Cで保存し、2週間以内に使用する。
   注:この実験では、供給者AAV濃度は、1013ゲノム含量(GC)/mL×〜¹ 〜2であり、4×^1012GC /mLの最終濃度に希釈した。ウイルス濃度を最適化して、所望の標識密度を得る。
2. 注射を視覚化するには、AAV 希釈液 15 μL ごとに約 1 μL の 0.02% ファストグリーン FCF 色素溶液を加え、溶液を青色に着色します。
3. ダムと新生児のごみ(出生後(P)0.5-3)を入れたマウスケージをマイクロインジェクション装置を備えた処置室に移す。母親のストレスと子犬の拒絶を最小限に抑えるために、巣と寝具で動物を同じケージに入れてください。
4. 注射領域を70%エタノールで滅菌し、ベンチ表面に滅菌おむつパッドを置きます。低体温誘発麻酔からの回復のための暖かいプラットフォーム(例えば、加熱パッド)を準備する。
5. マイクロシリンジを用いてAAV希釈液でマイクロピペットをバックフィルする。実体顕微鏡下で、マイクロピペットチップを30G針で破り、チップのシールを解除します。
   メモ: 図2A は、密封されたチップ(上部)と非シール(中央)の両方のバックフィルチップを示しています。
6. 氷の上に1〜2匹の動物を置くことによって低体温症によって新生児マウスを麻酔する。ラテックス手袋の上に動物を置き、氷との直接接触から皮膚を保護します。足のピンチに反応して動物が動かなくなったら(約2分)、動物を実体顕微鏡の下に置きます。必要に応じて、タトゥーインクと30G針でタトゥー足パッドを入れ、DNA分離のために尾の切り抜きを収集し、ジェノタイピングによって動物を識別します。
   注:麻酔の深さの適切なモニタリングは、手順全体を通して行われなければなりません。
7. 目の上に覆っている皮膚を70%エタノールで拭きます。30G針を使用して、融合したまぶたを開きます(図2B)。指で軽く圧力をかけて目を開き、角膜と強膜の接合部の角膜に小さな穴を開けます(図2C)。
8. ガラス製マイクロピペットを穴に挿入し、マイクロインジェクターフットペダルを2~4回押して、AAVを硝子体内空間に注入します。マイクロピペットをゆっくりと取り出し、瞳孔を通る青色色素を可視化することによってAAV注入を確認した(図2D)。
   メモ:噴出圧力が6~8psi、パルス時間が600~800msの場合、直径600μmの液滴が吐出されます(図2A、下段)。1眼あたり約0.23〜0.45μLのAAV溶液を注射する。眼の外側の青色の溶液は、AAVが眼内に注入されなかったことを示す。注射部位から漏れ出した青色の溶液は、AAVが漏れ出し、トランスフェクション効率が低下している可能性があることを示しています。
9. まぶたを優しく押して再密封し、子犬を加熱したパッドの上に置きます。動物がピンクがかった色を回復し、反応したら、それらを静かに収容ケージに戻します。
   注:子犬の再温が急速すぎるのを避けるために、適切な予防措置が取られていることを確認してください。
10. ごみの中の残りの動物に対して注射手順を繰り返します。網膜をイメージングする前に、ウイルスの形質導入に最低4〜5日かかります。

(A)バックフィルドマイクロピペットは、密封時(上)および先端が密封解除された後(下、左)のピペットチップの形状を示す。6-8psiのピコ注入圧力と600-800msのパルス時間は、直径600μmの液滴を生成する(下、右)。スケールバー = 1 mm.(B) 16倍の倍率で麻酔したP0子犬。融合したまぶたの接合部(白色)は、鋭い30G針を使用してスリットオープンされています。スケールバー = 2 mm. (C) 眼に加えられた軽い圧力は角膜を露出させる。スケール バー = 2 mm。ズームされたセクション(赤)は、30G針で作成された角膜 - 強膜接合部(黄色)の小さな穴を示しています。スケールバー = 0.5 mm. (D) 注射後のピペットチップの離脱(左)。AAV溶液中の高速緑色染料は、注射前の明るい瞳孔色(右)と比較して、瞳孔(中央)を通って青灰色として現れる。スケールバー= 1mm(E)4日後、まぶたが治癒し、融合して閉じた(左)。スケール バー = 2 mm。除核すると、治癒した注射部位が見える(黄色)。スケール バー = 1 mm。角膜と強膜の境界における注射部位の位置に注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. イメージング実験のための網膜解剖

1. 網膜aCSF(119 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.3 mM MgCl2·6H2O、2.5 mM _CaCl2·2H2O、1 mM NaH2PO4、11 mM グルコース、および20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES遊離酸)³⁵を調製する。必要に応じて、10倍の溶液を準備して凍結する。解凍し、必要に応じて1xに希釈します。
2. 網膜aCSFをカルボゲン(95%_O2、5%_CO2)で最低15分間バブリングして酸素化します。pHを7.4に調整します。使用時まで密閉容器に保管し、aCSFが酸素化されたままであることを確認する。
   注:網膜は高濃度の_O2を必要とします。実験全体を通してaCSFを酸素化しておくことが重要です。
3. 直径60mmのペトリ皿をアイストレイに埋め込み(実験用プラスチック、例えばピペットボックスの蓋からアイストレイを作ります)、実体顕微鏡の下に置きます。ペトリ皿に酸素化網膜aCSFを充填する。
4. マウスP9以下を断頭により安楽死させる。イソフルラン誘導によってマウスP10およびそれより古いマウスを安楽死させ、または動物プロトコールの下で承認された代替方法、続いて断頭する。
5. まぶたが密閉されている場合は、まぶたのフラップを切って目を露出させます。鉗子を使用して眼を摘出し、ステップ3.3から冷たい網膜aCSFに移します。
6. 網膜カップを解剖するには、実体顕微鏡(倍率25倍)下で、デュモン#5鉗子を用いて視神経を挟持して眼を安定させた(図3A)。
7. 角膜中央に30G針で穴をあけ、マイクロハサミの先端を穴に差し込み、穴から角膜の端まで切開します。この手順を繰り返して、基本方向に 4 つのスライスを作成し、4 つの「フラップ」を作成します (図 3A)。
8. デュモン #5 鉗子を 2 つ使用して、隣接する 2 つのフラップをつかんで引き離し、強膜を網膜からそっと剥がします。残りの角膜フラップで繰り返し、強膜を網膜から取り除きます(図3B)。
9. 鉗子を使用して網膜カップからレンズを取り外します。マイクロハサミでは、網膜の端から視神経に向かって4つの橈骨切開を行い、4つの等しい花弁を作成します(図3B)。第2の目に対して手順3.4~3.7を繰り返します。

4. 網膜フラットマウント製剤

1. 取り付け用の灰色の混合セルロースエステル(MCE)メンブレンフィルターディスクを準備します。大口径MCEメンブレンフィルターを使用する場合は、円盤を四分円(直径約1cm)に切断します。MCEディスクを大きな白いろ紙の中央に置きます(図3D)。
   メモ: MCE フィルターは、直径 1 cm のディスクでも入手可能です。MCEフィルターディスクは、1〜2個の網膜に収まるほどの大きさでなければならないが、イメージングチャンバに収まるほど小さくなければならない。MCE膜は静電荷を保持するため、MCE膜の接触と取り扱いを最小限に抑えます。
2. 2つのサイズ3/0ペイントブラシを使用して網膜を処理し、網膜神経節細胞側を下にして1つの網膜カップをペイントブラシに反転させます。網膜をaCSFから静かに持ち上げ、水張力が網膜を引き裂かないようにします(図3C)。
3. 網膜でペイントブラシを保持したまま、トランスファーピペットを使用して、MCEろ紙の中央にaCSFの液滴を置きます(図3C、右)。表面張力によって生成されたaCSFの液滴に網膜を浮かべる。ペイントブラシを使用して、網膜RGC側を液滴内で上向きに配置し、4つの花びらを広げます。
4. 配置したら、ペイントブラシと白いろ紙の間に水橋を作り、液滴の表面張力を壊します。
   注:aCSFが吸い込まれると、網膜はMCEろ紙に付着します(図3D、E)。フラットマウント網膜は、MCEディスクを鉗子でつかむことで処理できます。aCSF液滴が水架橋を形成する前に素早く吸い取られる場合、これはMCE膜が荷電していないことを示している可能性がある。新鮮なMCE膜を使用し、網膜をイメージングチャンバに移動する直前に網膜を解剖して平らに装着することにより、摘出からイメージングまでの時間を最小限に抑えます。

図3:網膜解剖と混合セルロースエステルフィルター膜への平らな取り付け(A)左、デュモン#5鉗子で視神経をつかむことによって除核された眼が安定する(左)。角膜の中央に30Gの針(中央)を使って小さな穴を開けます。微小解剖ハサミは、角膜を4つの等しいフラップに切断するために使用されます(右)。スケールバー = 1 mm. (B) デュモン#5鉗子2本で強膜を剥がし(左)、レンズを取り外した状態で網膜を解剖(中央)。網膜の途中で4つの等しい切り込みを持つ網膜(右)。スケールバー = 1 mm. (C) 2 本の細いペイントブラシによる網膜の取り扱い (サイズ 3/0、左)。網膜神経節細胞を斜めにして絵筆(中央)にひっくり返し、aCSFから持ち上げて、水の張力が網膜を引き裂かないようにしました(右)。スケールバー=2mm(D)白色のろ紙上に置かれた灰色のMCEメンブレンディスク(左)。MCE ディスク上の aCSF の液滴 (右)。スケールバー = 1 cm. (E) 網膜を液滴に浮かべて位置決めした後、白いろ紙でウォーターブリッジを作成してaCSFを吸い取り、網膜を荷電したMCE紙の上に引っ張ります(左)。スケールバー = 1 cm。MCE膜のズーム画像(赤色)は、網膜神経節細胞を側面上にして取り付けられた2つの網膜を示す(右)。スケール バー = 2 mm。1つの網膜は白で輪郭を描いています。略語:MCE=混合セルロースエステル;aCSF = 人工脳脊髄液。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5. 生きた全マウント網膜製剤のタイムラプス共焦点イメージング

1. 図4に示すように、直立共焦点顕微鏡用のライブイメージングインキュベーションチャンバーを組み立てます。
   メモ:反転共焦点システムの場合、フラットマウントはRGC側を下にしてインキュベーションチャンバのガラス底カバースリップに直接配置されます。網膜がカバースリップと接触すると、それらは動くことができません。
2. チャンバーを酸素化aCSFで満たし、ポンプと温度コントローラ(温度32-34°C、流量1mL/min)をオンにします。温度が34°C以上に上昇しないようにしてください。
3. 網膜フラットマウントを灌流チャンバに移すには、ポンプを停止し、チャンバ内にあるaCSFを取り外します。網膜フラットマウントを備えたMCEディスクを(空の)インキュベーションチャンバに入れます。
4. サンプルウェイトをフラットマウントに置きます。表面張力を壊すために重量を予め濡らしてください。チャンバーに加温したaCSFを補充し、約1mL/minでaCSFを循環させる。
5. 25倍の水浸漬対物レンズ(開口数0.95)でノーズピースをイメージングチャンバに入れます。エピ蛍光光を用いて目的の標識細胞をスクリーニングする(図4C)。
6. イメージングボリュームを調整して、目的の樹状突起をキャプチャします。
   注:この研究は、1フレームあたり1024 x 1024ピクセル、zステップ1μm、および各zスタック間のフレームレート2分で完全な樹状樹木をキャプチャしました。最終的な画像サイズは、約100 μm x 100 μm x 20 μmです。
7. レーザー出力を最適な設定に調整するには、過飽和ピクセルと過飽和ピクセルの両方を識別するルックアップテーブルを使用します。スキャン中は、ピクセルが過飽和にならないように(つまり、255以上の強度で)レーザー出力を調整します。必要な限り、または蛍光シグナルの有意かつ検出可能な減少およびノイズの増加があるまで(典型的には2〜4時間)画像化を継続する。
   注:ピクセルがフルダイナミックレンジに分布している場合、デコンボリューションアルゴリズムが最適に機能するため、レーザー出力を下げることをお勧めします。ピクセル強度は 254 を超えてはなりません。神経突起の実証分析により、170未満のピクセル値がデコンボリューションに理想的であることが明らかになった。ライン平均化(2-3)を伴う高速スキャン速度(400~600Hz)は、同じ合計ピクセル・ドウェル時間の単一で低速なスキャンよりも好ましい。長時間のイメージングの領域はしばしば光漂白剤であるが、他の外植部切片は生存可能なままである。フラットマウント内の複数の領域を、それぞれ2〜4時間、合計インキュベーション時間で6時間で画像化することができます。6時間を超えるイメージングセッションは体系的にテストされていません。神経突起の劣化およびブレビングは、外植生存率が低下している徴候である。
8. イメージング後、網膜フラットマウントとメンブレンフィルターを冷たい4%パラホルムアルデヒドで4°Cで1〜2時間固定します。 さらなる分析のために免疫組織化学によって固定網膜中の蛍光標識を増幅する。
   メモ: 反転コンフォカルを使用する場合、画像後の固定は不可能です。網膜は、組織を破壊することなく除去することはできません。

図4:生細胞イメージングインキュベーションチャンバーのセットアップ。(A)加熱、溶液、およびイメージングコンポーネントを示すライブイメージングインキュベーション装置。デュアルヒーターには、加熱されたインキュベーションチャンバープラットフォーム(青色のコネクタ電極を備えた背面円)とインラインソリューションヒーターが含まれています。(b)4Aの模式図。MCE膜上の網膜フラットマウント(赤色)(灰色)をインキュベーションチャンバに配置する。インライン溶液ヒーターは、溶液ポンプ(4Aに描かれていない)に接続されています。イメージングチャンバの寸法は、浸漬対物鼻のための良好な作業領域を可能にする。(c)0.23-0.45 μLの4 × ¹⁰¹² GC/mLのAAV希釈液を注射した網膜外植体の25x図;スケールバー = 100 μm。細胞の緻密な標識は、しばしば視神経頭を囲む(破線、右下)。スケールバー = 50 μm。略語:MCE=混合セルロースエステル;GC = ゲノムコピー;mCherry = 単量体チェリー;eYFP = 増強された黄色蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. ImageJ での画像のデコンボリューションと後処理

1. 画像系列をインポートし、系列を時間で分割し、マルチカラー画像の場合は色を付けます。1 つの色のすべてのタイム ポイントが同じフォルダーに含まれていることを確認します。
   注:ImageJを使用している場合は、バイオフォーマットをインポートします(バイオフォーマットは自動的にFIJIに含まれます)。
2. ImageJプラグインの 回折PSF 3Dを使用して理論的な点像分布関数(PSF)を作成します。
   メモ:蛍光タンパク質の発光波長がPSFに影響を与えるため、各イメージングチャネルには独自のPSFが必要です。
3. プラグインの使用 |マクロの|実行して、指定されたマクロ (補足ファイル 1) を使用して、すべてのタイムポイントに対してバッチ並列反復デコンボリューションを実行します。
   注: このマクロは、ウィーナー フィルターの事前調整済みランドウェーバー (WPL) 反復アルゴリズムを 25 回繰り返して実行します。各カラーチャンネルは別々にデコンボリューションする必要があります。
4. カラーチャンネルをマージし、すべてのタイムポイントをハイパースタックにコンパイルします(画像|ハイパースタックの|スタックからハイパースタックへ)。プラグインを使用して3Dドリフト を修正する |参加登録|3Dドリフトを修正します。
5. イメージを通常のスタックに戻す (イメージ |ハイパースタックの|ハイパースタックからスタックへ)、およびタイムポイントを分割します (画像|スタック|ツールの|スタックスプリッタ)。バッチ処理を使用して、すべての時点の最大投影法を作成する (プロセス |バッチ|マクロ|run("Z Project...", "projection=[Max Intensity]");
6. タイムラプス画像シーケンスの読み込み (ファイル|インポート|画像シーケンス)。従来のImageJツールを使用して、デコンボリングおよび後処理された2次元(2D)ビデオの望ましい分析を行います。
   注: 4 次元 (3D + 時間) のデコンボリューションおよびドリフト補正されたビデオは、ハイパースタックとして表示できます。前の手順を省略して、3D タイムポイントを維持します。

Results

上記のプロトコルを使用して、スターバースト細胞樹状突起を発達させる高解像度の3Dビデオを取得し、デコンボリングし、3Dドリフトについて補正した。Z平面最大投影は、解析用の2Dビデオを作成するために作成されました(補足ビデオ1、 図5A)。各時点の3Dデコンボリューションは、微細な糸状突起の分解能を増加させた(図5B、C)。微細な糸状突起は、網膜樹状突起³⁶ を発達させる特徴であり、画像化中に見えるはずである。AAVトランスフェクションは、細胞標識密度および蛍光強度に変動性をもたらす。したがって、標識された組織をスクリーニングして、イメージングおよび高品質のビデオを生成するための高い蛍光シグナルを有する細胞を選択する。薄暗い標識された細胞を検出するためにレーザー出力を上げることは、急速なフォトブリーチングをもたらし、信号と比較して高いノイズをもたらす可能性があるため、推奨されません。十分に明るい細胞は5dp...

Discussion

このビデオは、既存の遺伝的ツールを利用して、共焦点ライブイメージングで網膜ニューロンを発達させる樹状突起ダイナミクスを画像化する実験パイプラインを示しています。また、膜標的蛍光タンパク質をコードするCre依存性AAVの新生児マウスへの眼内注射も実証されている。遺伝的に標的化された集団の単一細胞は、早くも4〜5dpiと明るく標識されている。網膜フラットマウントは、生細胞共焦点イメージングを実行するための標準的なイメージングチャンバー用に準備された。このメソッドは、単一セルとその微細な投影の高解像度タイムラプスビデオを生成します。小さな投影は、ImageJ、Vaa3D、ShuTuなどのオープンソースソフトウェア、およびImarisおよびMBF Bioscienceから入手可能なライセンスソフトウェアを通じて利用可能なデコンボリューションおよび後処理アルゴリズムを使用して解決および定量化されます。このパイプラインはモジュール式であるため、各プロトコルセクションは研究の目的に合わせて変更できます。これらのモジュラー要素は以下で議論され、1)クレライン選択、2)蛍光タンパク質およびウイルス構築物の選択、3)遺伝子送達方法、および4)イメージング法...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene ウイルス調製 #45185-AAV9
Addgene ウイルス調製 #45186-AAV9
解剖 tools
セルロース濾紙	Whatman	1001-070
Dumont #5 fine forceps	FST	11252-20	網膜マイクロダイセクションには 2 つの Dumont #5 鉗子が必要です
デュモン鉗子	VWR82027-426
ファインハサミ	FST14058-09
混合セルロースエステル膜(MCE)フィルターペーパー、親水性、0.45µm孔径	ミリポア	HABG01 300
ペトリ皿、50 × 15 mm	VWR	470313-352
ポリエチレン製使い捨て転写ピペット	VWR	470225-034
丸型先端ペイントブラシ、サイズ3/0	従来の画材店		網膜フラットマウントには、2つのサイズ3/0ペイントブラシ(またはそれ以下)が必要です
外科用ハサミ	FST	14007-14
Vannas スプリングはさみ - 2.5 mm カッティングエッジ	FST	15000-08
ライブイメージングインキュベーションシステム
Chamber ポリエチレンチューブ、PE-160 10'	ワーナーインスツルメンツ	64-0755
デュアルチャネルヒーターコントローラー、モデル TC-344C	ワーナーインスツルメンツ	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR ディッピング対物レンズ	ライカ	15506374
ヒーターコントローラーケーブル	ワーナーインスツルメンツ	CC-28
スライスサポート付き大型バスインキュベーションチャンバー	ワーナーインスツルメンツ	RC-27L
MPII ミニ蠕動ポンプ	ハーバード装置	70-2027
PM-6D マグネチックヒーテッドプラットフォーム(インキュベーションチャンバーヒーター)	ワーナーインスツルメンツ	PM-6D
ポンプヘッドチューブピースMPIIミニ蠕動ポンプ	ド装置	55-4148
サンプルアンカー(ハープ)	ワーナーインスツルメンツ	64-0260	サンプルアンカーは、インキュベーションチャンバーと互換性がなければなりません
ロフロインラインソリューションヒーター	ワーナーインスツルメンツ	SF-28
<ストロング>新生児注射
10 & マイクロ;L マイクロリットル シリンジ シリーズ 700、取り外し可能な針	Hamilton Company	80314
30 G 皮下注射針 (0.5 インチ)	BD PrecisionGlide	305106
4 インチ 薄肉ガラス キャピラリー、フィラメントなし (外径 1.0 mm /0.75 mm)	WPIワールド精密機器	TW100-4
エタノール 99.8% (再蒸留水 [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	ペン ベクター コア	AV-9-PV2453	Addgene プラスミド #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmid #45186
ChAT-IRES-Cre ノックイントランスジェニックマウスライン	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Dye content ≥85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
フレーミング/ブラウン マイクロピペット プーラー、モデル P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
グリーン タトゥー ペースト	ケッチャム MFG Co	329A
リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています	Sigma-Aldrich	806552
空気圧 PicoPump	WPI ワールド プレシジョン インスツルメンツ	PV-820
Oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF) 試薬
塩化カルシウム二水和物(CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
カルボゲン (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102	サプライヤーは地域によって異なる場合があります
D-(+)-グルコース	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES、遊離酸	バイオ塩基性	HB0264
塩酸溶液、1 N	Sigma-Aldrich	H9892
マグネシウム六水和物(MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670
pHテストストリップ(6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
カリウム(KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
ナトリウム(NaCl)	Bio Basic	DB0483
ナトリウム一塩基性(NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	オープンソース