遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります¹。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱²として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます³。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)⁴を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです⁵が、ベージュ色の細胞は^WAT6内に分散しています。

エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています⁷。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています⁸。UCP1::Creライン⁹など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しい^BA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される¹¹;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。

最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)¹²に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はフリーメーソン医学研究施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。UCP1::Cre⁹ およびRosa 26^tdTomatoes マウス系統¹³ が以前に報告された。すべてのマウスを12時間の明暗サイクルで室温に保ちました。

1.溶液と褐色脂肪組織(BAT)の準備

1. 消化液と分離液を15 mL遠沈管で調製します。
2. 10 mLのBAT消化溶液:10 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、3.5 mg / mLのディスパーゼII、1 mg / mLのコラゲナーゼII、および10 mM CaCl₂ を加えてBAT消化溶液を作ります。
3. 10 mLの12%ヨージキサノール溶液(分離溶液):1 mLの10x PBS、2 mLの60%ヨージキサノール、0.01 mLの1 M MgCl 2、0.025 mLの1 M KCl、0.1 mLの0.2 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)および6.865 mLのddH₂ Oを混合して、12%のヨージキサノールを得る。
4. 1匹の成体マウスをCO₂ 過剰摂取で安楽死させる。簡単に説明すると、マウスケージを1分当たり10〜30%ケージ容積の変位率で100%_CO2 で満たす。 5分後、目に見えて呼吸がないことを確認して死亡を確認する。
5. 動物を解剖し、肩甲骨間BATを収集します。実体顕微鏡でWATと筋肉層を取り除きます。
6. 十分な消化を行うには、各BATローブを~3 mm³ の部分にカットし、金属攪拌子と5 mL消化溶液を入れた清潔な50 mLフラスコに入れます。消化を開始する前に、BATと消化バッファーを含むフラスコを氷上に1時間置きます。
   注:次の手順では、褐色脂肪細胞の分離に約80 mg BATを使用しました。

2. BAの分離手順

1. インキュベーターに封入されたマグネチックスターラーにフラスコを置きます。攪拌速度をそれぞれ60rpmに、インキュベーターの温度を35°Cに設定する。消化は約30分間続きます。消化中にBATスライスがスターラーバーの周りに塊を形成する場合は、1 mLピペットチップを使用して凝集組織を破壊します。
2. 清潔な50 mL遠心チューブの上に70 μmのストレーナーフィルターを置きます。約4 mLの細胞懸濁液をストレーナーに通してピペットで入れます。4 mLの12%ヨージキサノール溶液でストレーナーを洗浄します。ピペットを上下に動かして、細胞とヨージキサノール溶液を混合します。細胞混合物を2本の透明な5 mLポリスチレン試験管に移します。
   注:消化の終わりには、消化溶液は濁っているはずで、十分な消化を示しています。毎回新鮮な消化液を使用してください。調製したら、消化溶液は2時間以内に使用する必要があります。
3. 消化が十分でない場合は、手順2.2と2.3をもう一度繰り返します。
4. 分離溶液とBAが入った透明なポリスチレンチューブを氷上に1時間放置します。BAは上部にレイヤーを形成します。
5. 顕微鏡検査のために20 μLの単離されたBAを取り出します。

3. BAからのRNAおよびタンパク質の単離

1. BA層を2本の1.7 mLマイクロ遠心チューブにピペットで入れ、RNAとタンパク質を分離します。BAs層を乱すことなく、過剰なヨージキサノール溶液を慎重に除去します。
2. 1 mLのトリゾールを加えて、RNA、DNA、タンパク質を同時に細胞溶液に分離します。細胞を溶解するのに十分に混合する。
3. 200 μLのクロロホルムを加えて相を分離します。
4. チューブを9,981 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
5. 遠心分離後、RNA単離には水相を使用します。本研究では、逆転写には全RNAを用い、リアルタイムPCRを用いて定量RT-PCRを実施した。プライマー配列は 材料表に記載されています。
6. 300 μLの有機相を2 mLの微量遠心チューブに移します。
7. 有機相に、2.5容量の100%エタノールとボルテックスを10秒間加えます。
8. 200 μLの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、10秒間ボルテックスします。
9. 600μLの二重蒸留水とボルテックスを10秒間加えます。
10. 混合溶液を室温で10分間放置する。
11. 9,981 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 このステップで、フェーズが分離されます。タンパク質相は中間層に局在する。
12. 一番上の水溶液を取り除きます。残りの溶液に1 mLの100%エタノールを加えます。
13. 10分間遠心分離、9,981 x g、4°C。 遠心分離後、タンパク質ペレットが形成されます。上澄み液を捨てる。
14. ペレットを1mLの100%エタノールで洗浄する。
15. 10分間遠心分離、9981 x g、4°C。 ペレットを保存し、上清を廃棄する。
16. ペレットを室温で10分間風乾します。
17. ウェットペレットの重量を測定します。20 μL/mgペレットの比率で1%SDS溶液を追加します。
18. チューブを加熱シェーカーに入れてペレットを溶解します。温度を55°C、速度を11 x gに設定します。タンパク質ペレットを完全に溶解するのに通常5〜10分かかります。
    注:溶解タンパク質の濃度は、BCAアッセイ¹⁴によって測定することができる。

褐色脂肪細胞単離のための肩甲間BATの調製
褐色脂肪細胞(BA)の単離プロセスを 図1Aに示します。BATおよび消化/分離溶液の調製から単離されたBAの取得までのプロセス全体には、約4時間かかります。

成体マウスでは、肩甲骨間領域に豊富なBATが存在する。この肩甲骨間BAT(iBAT)は、筋肉層とWATで覆われています(図1B)。消化手順を開始する前に、筋肉層とWATを除去して、きれいなiBATを生成する必要があります(図1C)。公開されているBA分離プロトコルでは、ミンチBATがBA分離12に使用されました。この研究では、3 mm3 サイズのBATを消化すると(図1D)、ミンチBATよりも多くのBAが得られました。

3%BSA溶液による非BAからのBAの分離
iBAT消化後、解離したBAを消化生成物中の非BAと混合した。BAには脂肪滴が含まれているため、その密度は非BAよりも低くなります。ただし、BAの密度は、通常のPBSソリューションの上部に効率的に浮かぶほど低くはありません。3%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSは、BAを非BAから分離するために使用されており、この研究で正常に繰り返されました(図2A)。

Rosa 26 tdTomatoはレポーターマウス株であり、Creを介した組換えに続いて強力なtdTom(tdTom )蛍光タンパク質を発現する13。Ucp1::Creトランスジェニックマウスは、BAs9においてCreリコンビナーゼを発現する。Ucp1::CreマウスラインをRosa 26 tdTomマウスと交配し、tdTom でBAを遺伝的に標識した(図2B)。BA単離手順を検証するために、Ucp1::Cre;tdTom/+マウスからのiBATを解離させた。BSA溶液の最上層で濃縮された細胞のほとんどはラズベリー型であり、多房性脂肪滴を含んでいた。さらに、これらのラズベリー形状細胞のほとんどはtdTom陽性であり(図2C)、褐色脂肪細胞であることが確認された。

6%ヨージキサノール溶液による非BAからのBAの分離
3%BSA分離溶液はBAを濃縮した。これらの単離されたBAが遺伝子およびタンパク質発現解析に使用できるかどうかは不明であった。次に、濃縮BAからRNAとタンパク質を抽出しました。RNA抽出は、標準的なRNA単離手順に従って正常に実施されました。しかし、グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム法(GTPC法)としても知られる標準的なTrizolタンパク質分離プロトコルはうまく機能せず、面倒でタンパク質収量が非常に低かった。そのため、Trizol溶解BAからタンパク質を抽出するために、改良されたタンパク質単離法を採用しました。

この改良されたGTPCプロトコルでは、エタノール、ブロモクロロプロパン、および水が有機相15からタンパク質を抽出するために使用された。エタノール、ブロモクロロプロパンおよび水を有機相に添加した後、および遠心分離後、水相と有機相との間にタンパク質ペレットが形成された(図3A)。次いで、タンパク質ペレットを100%エタノールで洗浄し、1%SDSに溶解した。この改良されたGTPC法は、iBATおよびBSA溶液濃縮BAからタンパク質を抽出するために使用されました。BATタンパク質ペレットは1%SDSに容易に溶解したが、単離されたBAsタンパク質ペレットの大部分は溶解しなかった。その後、溶解したタンパク質をSDS-PAGEゲルで調べた。クーマシーブルー染色SDS-PAGEゲル(図3B)に示すように、単離されたBAには60 kDa付近の巨大なタンパク質バンドが存在しましたが、BATサンプルには存在しませんでした。BSAの分子量は66 kDaであり、BA分離溶液中に豊富なBSAが存在するため、この優勢なタンパク質バンドはBSAである必要があります。これらのデータは、BAs分離溶液からのBSAがタンパク質抽出を妨げることを示唆しています。

ヨージキサノールは、細胞17およびアデノ随伴ウイルス(AAV)精製18に広く使用されている非イオン性および等浸透圧勾配培地16である。タンパク質発現研究のBSA干渉を回避するために、新しいBA分離溶液のBSAの代わりにヨージキサノールを使用しました。3%BSA溶液の密度は1.03であり、これは6%ヨージキサノールと同様である。6%ヨージキサノール溶液では、BAは30〜60分で上部に浮遊しました(図3C)。この溶液で単離されたBAは、典型的なラズベリーの形状を示し、多房性脂肪滴を含んでいました(図3D)。これらの単離されたBAから抽出されたタンパク質は、SDS-PAGEゲル中でうまく分離された(図3E)。

6%ヨージキサノール溶液がBAと非BAを効率的に分離するかどうかを確認するために、tdTomでBAを遺伝的に標識し、透明な6%ヨージキサノール溶液に存在する細胞を調べました。BAを非BAから分離した後(ステップ2.4)、BAs層の下の6%ヨージキサノール溶液をPBSで6倍希釈し、次いで600 x g で5分間遠心分離した。遠心分離後、底部に小さな赤血球ペレットが形成され、これは間質血管画分細胞である可能性があります。図 3に示すように、BAs層由来の細胞はtdTom陽性細胞であった(図3F)。しかしながら、ペレットから回収された細胞はtdTom陰性であった(図3G)。さらに、tdTom陰性細胞には明らかな脂肪滴は見られませんでした。これらのデータは、私たちの新しいプロトコルがBAを非脂肪細胞から効率的に分離できることを示唆しています。

まとめると、これらのデータは、3%BSA溶液でBAを単離すると、生化学研究のフォローアップが妨げられることを示し、BAの単離には6%ヨージキサノール溶液が3%BSA溶液よりも優れていることを示唆しています。

単離されたBAによる遺伝子およびタンパク質発現解析。
この新しいBA単離手順を分子レベルで検証するために、BATと単離されたBAの間で3つの遺伝子( Ucp1、 Pdgfa、およびPdgfra )の発現を比較しました。BATにおいて、 Pdgfra は内皮細胞および間質細胞で発現し、PDGFRα陽性細胞は推定前駆細胞である10。 Ucp1とPdgfa のmRNAレベルは、BATよりも単離されたBAで有意に高かった(図4A、B)。それどころか、 Pdgfra のmRNAはBATでのみ検出されました(図4B)。

PPARγは脂肪組織の発達を制御する転写因子であり、UCP1はミトコンドリアタンパク質であり、PDGFRαは膜受容体タンパク質である。これらの3つのタンパク質は、異なる細胞コンパートメントに分布するタンパク質を表します。トリゾール溶解BAおよびBATから抽出したタンパク質がタンパク質発現解析に適しているかどうかを試験するために、ウェスタンブロットを実施しました。UCP1とPPARγはBAとBATの両方で検出され(図4C、D)、トリゾール溶解BAまたはBATから単離された総タンパク質がウェスタンブロットに適していることが確認されました。さらに、qRT-PCRの結果と一致して、UCP1タンパク質はBAで富化されました(図4C)。一方、PDGFRαはBATでのみ検出され、純粋なBAでは検出されませんでした(図4D)。要約すると、これらのデータは、当社の新しいBA単離法が効率的であることを示しており、この方法で濃縮されたBAが遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できることを示唆しています。

図1:褐色脂肪細胞単離のためのiBATの調製 。 (a)褐色脂肪細胞単離手順のワークフロー。(B)BAT、WATおよび筋肉層を含む肩甲骨間組織の腹側図。(C)肩甲骨間バット(iBAT)。iBATに隣接する筋肉層とWATを除去しました。(D)褐色脂肪細胞単離に用いたiBAT片の代表的な画像。B-D、スケールバー= 5 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:消化液からの褐色脂肪細胞の分離 。 (A)分離前後の解離した褐色脂肪細胞の画像。3%BSA溶液を使用して、褐色脂肪細胞を非褐色脂肪細胞から分離した。スケールバー= 1 cm。 (B)tdTomatoes蛍光タンパク質による褐色脂肪細胞の遺伝子標識の模式図。(C)単離された褐色脂肪細胞の画像。DIC、微分干渉コントラスト。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:溶解した褐色脂肪細胞からの総タンパク質の抽出 。 (a)有機相からのタンパク質相の分離。(B)SDS-PAGEゲルのクーマシー染色。総タンパク質は、BATまたは3%BSA溶液から精製褐色脂肪細胞から抽出した。BSAタンパク質バンドは矢印で示した。(c)6%ヨージキサノール溶液の上に形成された褐色脂肪細胞層。スケールバー= 1cm。 (D)6%ヨージキサノール溶液で単離した褐色脂肪細胞。褐色脂肪細胞は黄色の矢印で示された。スケールバー= 50μm。 (E)SDS-PAGEゲルのクーマシー染色。総タンパク質は、BATまたは6%ヨージキサノール溶液濃縮BAから抽出した。(F)tdTom標識褐色脂肪細胞の画像。(g)BAs層以下のヨージキサノール溶液から回収した細胞の画像。FおよびG、スケールバー= 50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:単離された褐色脂肪細胞の遺伝子およびタンパク質発現解析。 ヨージキサノール法で単離した褐色脂肪細胞を、これらの遺伝子およびタンパク質発現研究に使用しました。(A,B)遺伝子発現のqRT-PCR測定。mRNAレベルは36B4に標準化した。N = 3。スチューデントt検定、*、P<0.01;**, P<0.01.(C)PPARγおよびUCP1のウエスタンブロッティング。(エ)PDGFRαのウェスタンブロッティング。CおよびDは、ポンソーS染色膜をローディングコントロールとして用いた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

何一つ