軟部組織再生を誘発する体外衝撃波療法の標準化されたマウスモデル

サマリー

この記事では、衝撃波治療による組織再生の標準化されたマウスモデルについて説明します。

要約

衝撃波療法(SWT)は、いくつかの異なる組織で有望な再生効果を示しています。しかし、その根底にある分子メカニズムはよくわかっていません。血管新生は、新しい血管形成のプロセスであり、最近発見されたSWTの効果と同様に、より柔らかい組織での再生の主要な推進力です。SWTの力学的刺激がどのように血管新生と再生を誘導し、どの経路が関与しているかは完全には理解されていません。SWTの臨床使用をさらに改善し、機械的刺激が組織や組織の再生にどのように影響するかについての貴重な情報を得るためには、SWTの標準化されたモデルが必要です。ここでは、後肢虚血モデルを利用した、衝撃波治療による再生の標準化され、実装が容易なマウスモデルについて説明します。

概要

衝撃波療法(SWT)は、体外適用により腎臓結石を崩壊させる手段として、臨床診療に初めて導入されました。1990年代には、反復砕石術後のX線記録における腸骨稜の肥厚が偶然発見され、^SWT1の骨形態形成効果が明らかになった。これにより、整形外科での使用における新しいアプリケーションが急増しました。SWTは、それにより、長骨非癒合、外側上顆炎、およびアキレス腱炎2,3,4,5の治療選択肢として認められるようになりました。最近の証拠は、整形外科を超えて、より柔らかい組織や創傷治癒障害に再び器具の範囲を広げています^6,7。ここでは、^{脳卒中8,9,10}などの勃起不全や痙縮などの不均一な状態の集合体におけるSWTの有効性が研究で示される可能性があります。

しかし、SWTの根底にある分子メカニズムはまだ完全には理解されておらず、さらなる研究が必要です。心血管疾患に焦点を当てて、私たちの以前の研究は、心筋梗塞のマウスモデルにおけるSWTの有望な効果を示しています。これにより、血管新生が^SWT11後の心筋再生の中核的なドライバーとして発見されました。

血管新生は、既存の血管の発芽と分裂を通じて新しい血管が発達することを意味します。損傷の場合、これらの新しい血管は、損傷した領域への血流の回復を促進し、それによって再生^{を促進します12}。

したがって、血管新生は組織再生の特徴であり、より柔らかい組織におけるSWTの影響を説明する可能性があります。しかし、再生は、多数のインダクタとエフェクタのメカニズムを持つ複雑なプロセスです。単離された細胞培養環境でそれらを調査することもできますが、動物モデルはこれらの複雑なプロセスをエミュレートするのに最適です。後肢虚血は、 in vivo¹³ で血管新生と再生を調査するための確立されたモデルです。SWTの再生効果に関するさらなる研究を支援するために、後肢虚血におけるSWTの実行可能で標準化されたマウスモデルをここに提示します。

プロトコル

この実験は、インスブルック医科大学の動物施設管理・使用委員会とオーストリア科学省(BMWF-66.011/0110-V/3b/2019)によって承認されました。

1. 麻酔の導入と操作のセットアップ

1. 動物の処置に適した環境を準備します:機器の滅菌、表面の消毒、使い捨てマスク、隔離ガウン、手袋の使用。
2. 18〜12週齢のマウス(実験環境によって異なります)を、イソフルラン気化器に取り付けられたチャンバーで4%で鎮静させます。
3. 深い痛みを認識するための指標として、ペダルまたは耳介反射による十分な鎮静を確認します。
4. 動物が十分に鎮静されたら、イソフルランの流れを止め、承認された動物の世話と使用プロトコルに従って鎮痛薬と麻酔薬を投与します。例:麻酔薬として塩酸ケタミン(80 mg / kg体重)を鎮痛薬として塩酸キシラジン(5 mg / kg体重)腹腔内。
   注:動物を麻酔室に入れる前に、腹腔内薬で注射器を準備してください。
5. ペダル離脱反射を評価して、注射の5分後に麻酔の深さを調べます。
6. 角膜の損傷を避けるために、目の軟膏(例:.、0.5 gのレチノールパルミタット)。.
7. 手術部位、特に左後肢と鼠径部の内およびその付近の毛を取り除きます。脱毛クリームは、皮膚の損傷を避けるために、カミソリやトリマーの代わりに使用できます。
8. 粘着テープを使用して、動物を手足を伸ばした仰臥位で加熱プレートに固定します。
9. 手術部位を10%ポビドンヨードまたは同様の消毒剤で消毒し、清掃します。滅菌フィールドドレープを使用してください。

2. 手続き

1. 10倍から20倍の倍率の顕微鏡を使用して手術を行います。
2. 手術用ハサミを使用して、膝関節の近位に皮膚を切開します(~1.5cm)。
3. 鈍い鉗子を使用して、皮膚を下の組織から優しく分離します。
4. 大腿骨血管を特定します。鉗子とハサミを使用して、動脈、静脈、神経を慎重に分離します。
5. 鼠径靭帯のレベルで近位から始めて、動脈が最適に表示されるまで周囲の結合組織を慎重に取り除きます。遠位端点として、伏在動脈と膝窩動脈に分岐する動脈が見えるはずです。
6. 7-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、鼠径靭帯のレベルで近位大腿動脈を結紮します。
7. 7-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、伏在動脈と膝窩動脈への分岐に近接する大腿動脈の遠位端を閉塞します。
8. ジアテルミーを使用して、遠位結び目と近位結び目の間の大腿動脈セグメントを切除します。
   注:大腿動脈を手術用ハサミで切開することも可能です。しかし、ジアテルミーを使用すると、結び目が失敗した場合に備えて、縫合糸に加えて血管を閉塞します。
9. 大腿動脈が安全に閉塞し、手術現場で出血が見られないことを確認してください。
   注:SWT適用中の創傷の超音波ゲル除染を避けるために、皮膚縫合糸間の距離を狭くすることをお勧めします。
10. 5-0の非吸収性ナイロン縫合糸とシングルノットを使用して、皮膚切開部を縫合します。
11. 手術部位を綿棒で消毒します。

3.衝撃波治療アプリケーション

1. 皮膚の切開が完全に閉じていることを確認してください。
2. 衝撃波装置での治療パラメータを定義します。この実験設定では、3Hzの周波数で0.1mJ/^mm2 のエネルギー流束密度を合計300インパルス使用しました。
   注:エネルギーレベルは、焦点を絞った体外衝撃波治療を利用した以前の結果¹⁴ から採用されました。
3. 適切なカップリングのために、大腿部の内側の治療領域に超音波ゲルを塗布します。
4. ジェル内に気泡が溜まっていないことを確認してください。
   注:十分なゲルとの適切な結合は、適切なSWTアプリケーションにとって不可欠です。ゲル内の小さな気泡は衝撃波を吸収し、その効果を低下させます。
5. フットスイッチを切り替えながら、アプリケーターを太ももの上にゆっくりと動かして、300インパルスを適用します。
   注:手術直後にSWTを適用しない場合は、治療前に脱毛して再成長した毛による衝撃波エネルギー吸収の可能性を避けてください。
6. 治療後は、大腿部の冷えを防ぐために、残っている超音波ゲルを拭き取ってください。
7. 低体温症を避けるために、動物を暖房ランプにさらされた回復ケージに移します。
8. 目が覚めるまで動物を注意深く監視し、適切な鎮痛のために0.05 mg / kg体重のブプレノルフィンを皮下投与します。.
9. 外科的切開が完全に治癒するまで、動物の健康と幸福を毎日監視します。
   注:治療は1回のセッションに限定することも、複数回繰り返すこともできます。この例では、1 つのアプリケーションが実行されました。

4. 血流測定

1. 手術直後から、手術後の実験環境により様々なタイミングで血流測定を行います。
2. イソフルラン気化器に取り付けられたチャンバーで動物を4%で鎮静させます。
3. 動物が鎮静されたら、イソフルランの流れを止め、麻酔薬と鎮痛薬を投与します。承認された動物の世話と使用のプロトコルに従って、塩酸ケタミン(80 mg / kg体重)と塩酸キシラジン(5 mg / kg体重)を腹腔内に適用します。.
4. ペダル離脱反射を評価して、注射の5分後に麻酔の深さを調べます。
5. 目の軟膏(例:.、0.5 gのレチノールパルミタット)角膜の損傷を避けるために。.
6. 粘着テープを使用して、動物を手足を伸ばした仰臥位で加熱プレートに固定します。
7. 両後肢の毛を丁寧に取り除きます。
8. レーザードップラーによる四肢灌流の測定は、メーカーの指示に従って行います。
   注: 虚血性四肢と非虚血性四肢の血流の比率を主要パラメータとして使用する必要があります。

結果

このプロトコルを利用すると、SWT介入後に後肢灌流の有意差を観察および監視できます。代表的な画像は、SWTで治療された肢 (図1B) と未治療の対照肢 (図1A)に顕著な違いがあることを示しています。ここでは、灌流はサーマルフレアリングによって描かれ、冷たい色は低い灌流を表し、暖かい色は高い灌流を表します。レーザードップラー測定値の定量化は、手術後4週間で灌流の有意な増加を示しています。 (図1C)、SWT処理動物では、それに伴う壊死が少なくなります (図1D)。壊死は、前述のように評価されました¹⁶。

ディスカッション

衝撃波治療は、いくつかの軟部組織再生環境で有望な結果を示しています。しかし、これらの再生能力をさらに強化、改善、または分離するためには、まずSWTによる再生の基本を分子レベルで明らかにする必要があります。組織再生は複雑で、自然免疫と獲得免疫、炎症、細胞周期の進行、アポトーシス、細胞分化、血管新生など、多くの生物学的プロセスを含む^17,18。SWTの単離されたメカニズムは、ウォーターバスアプリケーションを利用してin vitroで研究できますが、in vivo再生を包括的にエミュレートするには不十分です。したがって、SWTによって活性化される経路の正確な調査は、in vivoでのみ達成できます。

後肢虚血マウスモデルは確立されており、実装が容易です。さらに、組織再生を調査するための他の外科的手段と比較して、死亡率が低く、重症度が低いことが示されてい...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% ポビドン
5-0 ナイロン縫合糸	Ethicon Inc.
7-0シルク縫合糸	Ethicon Inc.
焼灼	マーティン	ME-102
脱毛クリーム	ニベア
ガーゼ	ガジン
加熱プレート
ケタミン塩酸塩			麻酔
レーザードップラー	ムーア器具
手術器具	細かいScience Tools
キシラジン塩酸塩			麻酔