我々は、明視野顕微鏡法および細胞追跡を用いて、百ミクロンからミリメートルサイズの細胞集団の運動性および挙動の特性評価のためのプロトコルを提示する。このアッセイは、 ステンター・コエルルスが 失われた口腔装置を再生する際に、4つの行動的に異なる段階を経て遷移することを明らかにする。
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この記事について
サマリー
要約
Stentor coeruleus は、単細胞再生の研究のためのよく知られているモデル生物である。個々の細胞のトランスクリプトーム解析により、再生プロセス全体を通して段階的に差次的に調節される何百もの遺伝子(多くは口腔装置(OA)と関連していない)が明らかになった。新しいOAの成長に向けた細胞資源のこの全身的な再編成と動員は、異なる遺伝子発現の段階に対応する動きと行動の観察可能な変化をもたらすという仮説が立てられた。しかし、 S. coeruleus の形態学的複雑さは、統計と時間スケールを捉えるためのアッセイの開発を必要とした。カスタムスクリプトを使用して短いビデオのセルを追跡し、統計は大規模な人口(N〜100)にわたってコンパイルされました。OAが失われると、 S. coeruleus は最初に指向性運動の能力を失う。その後、〜4時間から始まり、〜8時間まで速度の大幅な低下を示す。このアッセイは、運動性表現型のスクリーニングに有用なツールを提供し、他の生物の調査に適合させることができる。
概要
Stentor coeruleus(Stentor)は、その大きなサイズ、いくつかの顕微外科的技術に耐える能力、および実験室環境での培養の容易さのために単細胞再生を研究するために使用されているよく知られているモデル生物である1,2,3。初期の再生研究は、Stentorの最大かつ最も形態学的に異なる特徴であるOAに焦点を当てており、これは化学ショック4,5,6で完全に放出される。失われたOAのDe novo置換は、新しい膜帯(8つの形態学的段階にわたって機能的なOAを形成する前に細胞の前部に向かって徐々にシフトする繊毛の配列)の出現から始まる3。これらの段階は、温度に関係なく順次観察されており、ほぼすべての研究に普遍的な基準点を提供しています5。
ステンター再生の機構的分析には、再生のタイミングを測定するためのツールが必要であ....
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プロトコル
注:約100の S. coeruleus 細胞の集団を、以前に公開されたJoVEプロトコル8に従って培養した。
1. サンプル調製
- 厚さ250μmのシリコーンスペーサーシート(材料表)を顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さく切ります。5/16インチの穴を開けて、円形の井戸を作ります。良好なシールを確保するために、隣接する井戸の間に十分なスペースを残すように注意してください。
注:隣接する井戸間の3mmのスペースで十分であることが判明しました。練習すると、1つのサンプルスライドに10個のウェルを置くことができます。 - 細胞を10%スクロースまたは2%尿素中で2分間インキュベートすることによって、OAの再生を開始する(図1A)。その後、新鮮な培地8で3回洗浄する。各ウェルに約10 個のステンター を静かにピペットで入れる。サンプル量とウェル量をできるだけ近づけるように注意してください。
注:ここで使用したウェル寸法については、12.5 μLのサンプルを各ウェルにピペットで固定しました。 - 片方の端からウェルの上にカバーガラス( 材料表を参照)を静....
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結果
このアッセイの目的は、大きな(N〜100)再生ステンター集団内の細胞からの移動パターンの漸進的な変化および移動速度の段階的増加を定量化することである。結果の解釈を支援するために、このプロトコルに含まれるカスタムコードは、ビデオデータのセット内のすべての細胞移動トレースのオーバーレイ(図1C-Fおよび図S1)と、再生開始からの時間ごとの水泳速度のプロット(図2C)の2種類のプロットを生成します。正常に再生しているStentorの集団は、無方向水泳から有向遊泳への着実な移行を示すはずです(図1G)。各細胞は、約8時間にわたるOA再生プロセス中にこの遷移を完全に受けますが、傾向を明確にするためには、個人間のばらつきを集計して大きな集団の動きを見る必要があります。
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ディスカッション
現在、多くの粒子および細胞追跡アルゴリズムが存在し、一部は完全に無料です。コストと使いやすさは、多くの場合、妥協を必要とするトレードオフです。さらに、既存の細胞追跡プログラムの多くは、水泳中に回転し、突然の方向転換を受ける可能性がある Stentorの高速水泳運動ではなく、組織培養細胞のゆっくりとした這う動きを追跡するように設計されています。これらのオプションの多くをテストした後、ここで紹介するプロトコルは、低コストの機器と単一の科学ソフトウェアパッケージ(材料表)のみを使用して、データ収集からデータ視覚化までをワンストップソリューションにすることを目的としています。これは、学生が自分の質問をし、短期間で定量的な結果に到達する障壁を下げるため、必要な機器のほとんどがすでに利用可能な教育機関や生物物理学教育ラボの研究室にとって特に興味深いものです。
この原稿で提示された方法は、百ミクロンからミリメートルサイズのスケールの生物集団の運動性を定量的に特徴付けるように適応させることができる。より小さな生物またはより大きな生物への適用は、ビ.......
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開示事項
著者らには開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、海洋生物学研究所ホイットマン・アーリーキャリア・フェローシップ(JYS)によって部分的に支援されました。Evan Burns、Mit Patel、Melanie Melo、Skylar Widmanが予備的な分析とコードテストの一部を支援してくれたことに感謝します。マーク・スラボドニックの議論と提案に感謝します。WFMは、NIH助成金R35 GM130327からの支援を認めています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 厚さ0.25mmのシリコンシート | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | ディスカッションで述べたように、1枚のスライドにセットするサンプルウェルの数が少ない場合は、より小さなカバーグラスを使用することができます。 |
| CCDカメラ | 使用しました Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT株 | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
参考文献
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate....
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再版と許可
