Method Article

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

DOI:

10.3791/62353

⸱

May 17th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Aerospace Engineering, Universidad Carlos III de Madrid (UC3M), 2Group of Optics, Photonics and Biophotonics (GOFB). Center for Biomedical Technology, Universidad Politécnica de Madrid, 3Division of Epithelial Biomedicine, CIEMAT, 4Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón

In This Article

Summary

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ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。

Abstract

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この研究は、複雑な多層組織を生成する可能性を持つ新しい、費用対効果の高い、信頼性の高いマイクロ流体プラットフォームを提示します。概念実証として、真皮(間質)および表皮(上皮)コンパートメントを含む、簡素で未分化のヒト皮膚がモデル化されている。これを達成するために、2つのチャンバーに分かれた汎用性と堅牢なビニール系デバイスが開発され、高価で特殊な機器の使用や、小型の疎水性分子およびタンパク質の吸収など、生物医学の用途に適したポリジメチルシロキサン(PDMS)に基づくマイクロ流体デバイスに存在する欠点の一部を克服しました。さらに、平行流に基づく新しい方法が開発され、真皮および表皮コンパートメントの両方の イン・ザ・ポジション 堆積が可能となる。皮膚構築物は、ヒト原発性線維芽細胞を含むフィブリンマトリックスと、上に播種された不死化角化ケラチノサイトの単層から構成され、その後、動的培養条件下で維持される。この新しいマイクロ流体プラットフォームは、ヒトの皮膚疾患をモデル化し、他の複雑な組織を生成する方法を推定する可能性を開きます。

Introduction

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近年、化粧品および医薬品1の毒性分析のためのヒト皮膚モデルの開発・生産に向けた進歩が見られている。医薬品およびスキンケア産業の研究者は、動物を使用してきました, マウスは最も一般的です, 自社製品をテストするために2,3,4,5.しかし、動物の試験製品は、ヒトにおける反応を予測するとは限らず、しばしばヒトにおける薬物不全または副作用を引き起こし、その結果経済的損失5,6に至る。英国は、1998年に化粧品検査のための動物の使用を禁止した最初の国でした。その後、2013年に、EUは動物の化粧品の試験と承認を禁止しました (EU化粧品規則第1223/2009)7.

この禁止は、米国の「人道的化粧品法」など他の国々でも検討されています。倫理的な懸念に加えて、動物と人間の皮膚の解剖学的な違いは、動物のテストに時間がかかり、高価で、しばしば効果がありません。さ....

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Protocol

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1. チップ設計とマイクロマシニングパラメータ

  1. FreeCADオープンソース設計ソフトウェアを使用してマイクロ流体チップ層を設計します。チャネルの寸法については 、表 1 を参照してください。設計に直径2.54mmの穴を4つ含めて、正しいレイヤーの重ね合わせにカスタムメイドのアライナを使用します。
長さ(μm)幅 (μm)
下室28,400800
上院31,000800

表1:デバイスの上下チャネルの寸法

  1. 厚さ95μm、粘着、透明なビニールシートを30cm x 30cmの正方形に切り、プロッタに適切に収めます。
  2. 30 cm x 30 cm のワ....

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Results

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設計されたチップは、下のチャンバからの成長促進分子の通過を可能にすることによって細胞の成長を可能にする5μmの細孔サイズPC膜によって分離された2つの流体室から構成される。上のチャンバは組織構築物を保持し、この場合、hFBを含むフィブリンヒドロゲル上のhKCsの単層である。

チャネルの高さは、各チャンネルに追加される粘着シートの数によって決まります。下の部屋は4つの層(380 μm)および10個の片面テープ層の上の1つと両面1(962 μm)で構成されています。チップの寸法は4 cm x 2 cmで、操作性を高めます。粘着性のビニールシートは装置の目視点検のための水締まりおよび透明を提供する。PDMS層は、チューブが固定された穴からの漏れを避けるために、チューブの適切なアンカーに役立ちました。

公表された文献によると、シリンジポンプを用いたマイクロ流体室への細胞含有ヒドロゲルの注射能は現在までに報告されていない。このため、フィブリンプレゲルの注射能を評価しなければならなかった。50μL/minの流れの下で、シリンジがブロックさ.......

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Discussion

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この方法を開発する動機は、皮膚疾患をモデル化し、ハイスループットプラットフォームで新しい革新的な治療法の効果を研究したいという願望でした。現在までに、この研究室は、手動で、または3Dバイオプリンティング技術の助けを借りて、繊維芽細胞を含むフィブリンゲルを細胞培養インサートプレートに播種し、その上に角化細胞を播種することによって、これらの皮膚表皮等価物を生産する。角化細胞が合流に達すると、3D培養物が空気・液体界面に曝され、ケラチノサイト分化を誘導し、成層表皮を生成し、その結果、完全に発達した脳間ヒト皮膚32、33、34となる。しかし、これらの3D培養は、臨床的には非常に関連性はあるが、高価で時間がかかり、生理学的状態を模倣しない。

ティッシュオンチップ技術は、細胞培養における生理学的状態をエミュレートするプラットフォームを提供し、したがって、毒性、有効性、および薬物候補13、14、15、.......

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Disclosures

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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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ハビエル・ロドリゲス博士、マリア・ルイサ・ロペス博士、カルロス・マテラン、フアン・フランシスコ・ロドリゲスの皆様に、ご意見、ご意見、ご意見、予備データをお願い申し上げます。また、セルヒオ・フェルランデス、ペドロ・エレーロス、ララ・ストルツェンブルクの貢献に感謝します。GFPラベル付きhFPとhKUについては、マルタ・ガルシア博士に感謝します。最後に、ギレルモ・ヴィズカイノとアンジェリカ・コラルの優れた技術支援を認めています。この作品は「プログラム・デ・アクティビダーデス・デ・I+Dアントル・グルポス・デ・インベスティガシオン・デ・ラ・コムニダード・デ・マドリード」、プロジェクトS2018/BAA-4480、バイオピエルテック-CMによって支えられた。この研究は、"プログラム・デ・エクセレンシア"、プロジェクトEPUC3M03、CAMによってもサポートされました。コンセヘリア・デ・エドゥカシオン・エ・インベスティガシオン

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アムチャフィブリンロッタファームトラネキサム酸
抗生物質/抗真菌剤サーモサイエンティフィック HyClone
塩化カルシウムシグマ アルドリッチ
カルチャープレートフィッシャー
DMEMインビトロジェン ライフテクノロジー
ズ 両面テープ ビニールATP 接着剤 システムGM 107CC、12 & マイクロ;m thick
Edge plotterBrotherScanncut CM900
FBSThermo Scientific HyClone Fibrinogen
Sigma Aldrichヒト血漿から抽出
ガラススライドThermo Scientific
GFP-ヒト真皮線維芽細胞-一次.マルタ・ガルクチアキューテ博士からの贈り物。
H2B-GFP-HaCaT細胞株ATCC不死化ケラチノサイト。マルタ・ガルクチアキューテ博士からの贈り物。
a Live/dead kitInvitrogen
PBSSigma Aldrich
ポリカーボネートメンブレンMerk TM5 µm 細孔径
ポリジメチルシロキサンダウ コーニングシルガード 184
塩化ナトリウムシグマ アルドリッチ
シリンジテルモ5 mL
トロンビンシグマ アルドリッチ10 NIH/バイアル
透明接着剤 ビニールマックタックJT 8500 CG-RT, 95 & マイクロ;m厚
トリプシン/ EDTAシグマアルドリッチ
チューブIDEXテフロン、1/16インチ外径、0.020インチ身分証明書

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
  2. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U.

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