方法論記事

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

DOI：

10.3791/62354

⸱

2021年4月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

この記事について

サマリー

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ここで説明するDNA抽出プロトコルは、蚊から高品質のDNA抽出を生成するために磁気ビーズを使用する。これらの抽出は、下流の次世代シーケンシングアプローチに適しています。

要約

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磁気ビーズと自動DNA抽出装置を用いた最近発表されたDNA抽出プロトコルは、下流の全ゲノムシーケンシングに十分な保存状態の良い個々の蚊から高品質および量のDNAを抽出することが可能であることを示唆した。しかし、高価な自動DNA抽出装置への依存は、多くの研究所にとって非常に困難な場合があります。ここでは、低スループットから中程度のスループットに適した予算に優しい磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルを提供します。ここで説明するプロトコルは、個々の Aedes aegypti 蚊サンプルを使用して正常にテストされました。高品質のDNA抽出に伴うコストの削減により、リソース制限のあるラボや研究に高スループットシーケンシングを適用できます。

概要

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改良されたDNA抽出プロトコル1の最近の開発は、全ゲノムシーケンシング2、3、4、5、6を含む多くの影響の大きい下流の研究を可能にしました。この磁気ビーズベースのDNA抽出プロトコルは、個々の蚊のサンプルからの信頼性の高いDNA収量を提供し、フィールドコレクションから十分な数のサンプルを取得することに関連するコストと時間を削減します。

近年の人口や景観のゲノミクスの進歩は、全ゲノムシーケンシングのコスト削減と直接相関しています。以前のDNA抽出プロトコル1 は、高スループットシーケンシングに関連する効率を高めますが、資金のない小規模なラボ/研究は、プロトコルを実装するためのコスト(例えば、特殊な機器のコスト)のために、これらの新しい強力な景観と人口ゲノミクスツールの使用をオプトアウトする可能性があります。

ここでは、Neiman et al. 1と同様の磁気ビーズ抽出ステップを使用 して高純度DNAを得るが、組織のリシスおよびDNA抽出のための高コストの器具に依存しない改変DNA抽出プロトコルが提示される。このプロトコルは、高品質DNAの>10 ngを必要とする実験に適しています。

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プロトコル

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1. DNA抽出前の一般的なサンプル貯蔵および調製物

  1. サンプルを>70%アルコールに保存して組織を軟化させる場合は、4°Cで1時間(または一晩)の100μL PCRグレードの水でサンプルを水和します。

2. サンプルの中断

  1. 56°Cでインキュベーターまたは振度熱ブロックをセットします。
  2. プロテナーゼK(PK)バッファー/酵素ミックスを作ります。プロテインナーゼK(100mg/mL)2 μL、プロテナーゼKバッファー98 μL(合計100 μL)が個々の蚊の抽出に必要です。複数の標本のマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために合わせた)合計量を〜15%増加させ、十分な容積の入手可能性を確保します。
  3. 抽出前にサンプルを水和した場合は、各サンプルチューブから水を捨てます。
  4. 蚊のティッシュを含んでいる1.5 mLのマイクロ遠心分離管に、PKバッファー/酵素の混合物の100 μLを加える。
  5. マイクロ遠心分離チューブの害虫を使用して組織を均質化します。
  6. 室温で9,600 x g で1分間サンプルを遠心分離します。
  7. 56°Cで2〜3時間のサンプルをインキュベートする。
  8. インキュベーション中に、DNA抽出工程(ステップ3)を用いて他の試薬を調製する。

3. DNA抽出

  1. 磁気ビーズマスターミックスを作ります。各サンプルに100 μLのリシスバッファー、100 μLのイソプロパノール、15 μL の磁気ビーズ(合計 215 μL)を混ぜます。複数の反応のためのマスターミックスを準備するには、(すべての個々の標本のために組み合わせた)合計量を〜20%増加させ、十分な量の可用性を確保します。
  2. インキュベーション時間(ステップ2.7)後、ピペットを使用して各ライセートをクリーンマイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに移します。
  3. 各サンプルに100 μLのリセートと215 μLの磁気ビーズマスターミックスを加えます。
  4. ピペットを使って10~20sをよく混ぜ、室温で10分間放置します。時折チューブを軽く振って、磁気ビーズとDNAの結合を最大限に引き出します。
  5. マグネットビーズのセパレータにチューブ/プレートを置き、溶液がはっきりするまで待ちます。
  6. ピペットを使用してチューブ/プレートから液体を捨てます。上清を取り除くときは、DNAを保持している磁気ビーズに触れたり邪魔したりしないようにしてください。
  7. チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各ウェルに325 μLの洗浄バッファー1を追加します。
  8. ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。
  9. 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
  10. チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 1 を各ウェルに追加します。
  11. ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。
  12. 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
  13. チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、各サンプルに250 μLの洗浄バッファー2を加えます。
  14. 十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。
  15. 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
  16. チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、250 μLの洗浄バッファー 2 を各ウェルに追加します。
  17. 十分に混ぜ合わせ、室温で1分間インキュベートします。
  18. 手順 3.5 ~ 3.6 を繰り返します。
  19. チューブ/プレートを磁気ビーズ分離器から離し、溶出バッファーを各ウェルに 100 μL 追加します。
  20. 十分に混ぜ合わせ、室温で2分間インキュベートします。
  21. マグネットビーズのセパレータ上でチューブ/プレートを上に移動し、溶液がはっきりするまで待ちます。
  22. 新しいクリーンな0.5マイクロ遠心チューブまたはマイクロプレートウェルに上清をピペット。
  23. DNAサンプルは4°C(最大1週間)または-80°Cで保存してください。 マイクロプレートを使用している場合は、パラフィルムで覆います。
  24. 任意の適切な方法を使用してDNAの収量を決定します。
    注:本研究では、260/280 nmのDNAフルオロメーターの読み取りと吸光度が利用されました。

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結果

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蚊頭/胸郭組織あたりのDNA収量の平均は、100 μLの溶出バッファーを使用して溶出した場合のフルオロメーターを用いて測定した4.121 ng/μL(N = 92、標準偏差3.513)であった。全ゲノムライブラリ構築1,7に必要な10〜30ngゲノムDNA入力要件に対して十分である。DNAの量は、蚊の体の大きさと保存条件に応じて0.3〜29.7 ng/μLの間で変化する可能性があります。ばらつきの高い部分は、研究で使用される磁気ビーズの特性によるものです。磁気ビーズの異なるブランドは、前のレポート1に示すように、より一貫した濃度を生成する可能性があります。また、蚊種の大きさが異なり、DNAの収量はそれらの個体および種のサイズ範囲に依存していることも留意すべきである。DNA濃度が典型的な範囲を下回る場合、タンパク質化K反応(ステップ2.7)でインキュベーション期間を調整してもよいが、この延長は16時間以下でなければならない。さらに、プロテイナーゼKおよび/またはリシスバッファ...

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ディスカッション

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ここで説明するプロトコルは、他の昆虫種に適合させることができる。Niemanら 1 で導入されたプロトコルの元のバージョンは、Aedes aegypti、 Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, アノフェレス・アラビエンシス, アン・コルッツィー, アン・クスタニ、アン・ダーリンリ、アン・ファネスタス、アン・ガンビア、アン・クアドリアヌラトゥス、アン・ルフィペス、キュレックス・ピピエンス、Cx.クインケファシアトゥス、Cx.フェイレリ、ショウジョウバエ・スズキイ、クリソドラ・アエネコリス・トゥタ・アルソルタ、カイフェリア・リコパこのプロトコルは、これらだけでなく、他の節足動物のために動作することが期待されます。

理想的に...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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我々は、米国が資金を提供する太平洋南西部地域ベクター媒介性疾患優秀センターからの資金援助を認める。 疾病管理予防センター(協同協定1U01CK000516)、CDC助成金NU50CK000420-04-04、USDA国立食品農業研究所(ハッチプロジェクト1025565)、UF/IFASフロリダ医学昆虫学研究所フェローシップ、Tse-Yuチェン、NSF CAMTech IUCRCフェーズII(AWD05009_MOD0030)、フロリダ州保健省(COJJJ)この記事の調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも米国魚類野生生物局の見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AEバッファーQiagen19077溶出バッファー
ALバッファーQiagen19075溶解バッファー
AW1 バッファーQiagen19081洗浄バッファー
1 AW2 バッファーQiagen19072洗浄バッファー 2
MagAttract 懸濁液 GQiagen1026901磁気
ビーズ マグネティックビーズセパレーターEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000微量分光光度計
PK バッファーThermoFisher4489111プロテイナーゼ K
Proteinase KThermoFisherA25561
Qubit InvitrogenQ33238蛍光光度計
バッファー

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

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