μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

サマリー

本稿では、舌上の生体内イメージングウィンドウにマイクロ流体を統合することにより 、生体内で の機能性味細胞イメージング用μTongue(マイクロ流体術オン・ア・タン)デバイスを紹介する。

要約

生体内蛍光顕微鏡は、生きた動物の多細胞ダイナミクスを研究するために広く使用されるツールです。しかし、味覚官能器官ではうまく使用されていない。マイクロ流体を生体内舌イメージングウィンドウに統合することにより、μTongueは、複数のタストタントへの制御された暴露の下 で生体内 の味細胞の信頼性の高い機能的画像を提供します。本論文ではμTongueシステムを利用するための詳細なステップバイステップの手順を提示する。タスタントソリューションの準備、マイクロ流体モジュールのセットアップ、サンプル実装、機能画像データの取得、データ分析の5つのサブセクションがあります。μTongueを使用する際に生じる可能性のある実用的な問題を解決するためのヒントとテクニックも紹介しています。

概要

生体内蛍光顕微鏡は、生体組織の時空間的ダイナミクスを研究するために広く使用されています。研究者たちは、生物学的プロセスの特異的かつ敏感な蛍光シグナルへの変換を提供する遺伝的にコードされたセンサーを急速に開発しています - 広く利用可能な蛍光顕微鏡を使用して容易に記録することができます^1,2.げっ歯類のほとんどの内臓は顕微鏡を用いて調べられてきたが、舌への応用は成功していない³.

味覚細胞のカルシウムイメージングに関する以前の研究は、舌組織を薄く切り離して、舌組織を薄く切り離して、味覚芽^4、5、6を得るか、または味覚上皮を剥離して真菌形態の味覚芽^7、8を得ることによって行った。これらのサンプルの調製は必然的に侵襲的であったため、神経の内在性、透水性バリア、血液循環などの自然微小環境は、大部分が摂動された。最初のインビタル舌画像化ウィンドウは2015年にChoiらによって報告されたが、流動性タスタント刺激によって引き起こされる動き及び光学的アーチファクトのために信頼性の高い機能的記録は達成^{できなかった。}

最近、マイクロ流体オンアタン(μTongue)が^{導入された10}.この装置はマウスの舌のイメージ投射窓とマイクロ流体システムを統合する。画像撮影期間を通じてタスタント刺激の準定常状態の流れを達成することによって、流体運動からのアーチファクトを最小限に抑えることができる(図1)。入力ポートは一連のマルチチャンネル圧力コントローラによって供給され、出力ポートは0.3 mL/minを維持するシリンジポンプに接続されます。また、タスタント溶液の屈折率の差に起因する光学的アーチファクトは、カルシウム感受性指標(tdTomato)とカルシウムインジケーター(GCaMP6)11を導入した比分析により最小化された。この設計は、流体チャネル間の急激な切り替えでも、生体内の味細胞の微視的安定性を提供しました。その結果、μTongueは、インビボでマウスの味覚芽に複数のタストタントの信頼性の高い機能的スクリーニングを実施します。

このプロトコルでは、実験手順はμTongueを用いた 生体内 におけるマウス真菌形態味覚芽のカルシウムイメージングについて詳細に説明される。まず、人工唾液およびタスタント溶液の調製について説明する。第2に、準定常状態流を達成するためのマイクロ流体システムの設定が導入される。第三に、画像の取得を可能にするためにμTongueにマウス舌を取り付けるために使用される手順が描かれている。最後に、横運動アーチファクトの補正やレシオメトリーを含む画像解析の各ステップを指定します。このプロトコルはマウスの設備および2光子顕微鏡または同等の装置を用いてあらゆる実験室に容易に合わせることができる。

プロトコル

すべての外科的処置は、成均館大学及びソウル大学校の施設動物の世話及び使用委員会(IACUC)によって承認された。

1. ソリューションの調製: 人工唾液とタストタント

1. 2 mM NaClを溶解して人工唾液を調製し、 5 mM NaHCO_3,3mM KHCO 3,0.25 mM CaCl_2,0.25mM MgCl_2,0.12mM K₂HPO,0.12mM KH_2PO4,および1.8 mM HClを蒸留水(>1 L)に調整し、溶液のpHを7(1L)に調整する。
2. 酸味などのタスタントを準備します: 10 mM クエン酸;塩辛い:400 mM NaCl、必要に応じて50 μMアミロライド。甘い:40 mMアセスルファムK;苦い:5 mMキニン、5 mMデナトニウムおよび20 μMシクロヘキシミドの混合物を、ステップ1.1で調製した人工唾液中に試飲薬を溶解させることによって。

2. マイクロ流体システムの調製

注: タストタントは、加圧マルチチャンネル流体送達システムを使用してマウス舌に送達されました( 図1 および 材料表を参照)。

1. 加圧流灌流システムの貯留層を人工唾液とタスタントで満たします。
2. 圧縮空気ラインをレギュレータ入力に接続し、流体送達システムで30~50 psiの間で空気圧を設定します。
3. レギュレータの出力圧力を0.4 psiに設定し、この圧力の下でチューブから液体が出ているかどうかを確認します。
4. 貯留層からμTongueの入力ポートにマニホールドを接続します。
5. μTongueの出力ポートをシリンジポンプに接続し、液体を~300 μL∙min-1で引き出して定常状態を確立します。μTongueの下に吊り下げ液滴の一定の体積を観察します。サンプルの高さに応じて設定パラメータの値を調整します。
6. 圧縮空気ラインを外し、プロトコルステップ3が完了するまでシリンジポンプを停止します。

3.インビボイメージング用のマウスの準備 (図 2)。

注:すべての動物の製剤は、実験室のワークベンチで無菌条件下で昼間に行われました。

1. マウス麻酔
   1. どちらかのセックスの7週齢または古いマウスを準備します。味細胞内のカルシウム感知蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスラインを使用します。
   2. マウスは麻酔のために拘束されています。100 mg/kg ケタミンと 10 mg/kg キシラジンの混合物をマウス¹³に腹腔内注射する。
2. 2.5%W/Vリン酸緩衝液生理食塩液中のTRITC-デキストラン(500kDa)は、画像化セッション中に血液循環を観察するために、レトロ軌道経路を介してマウスに静脈内投与される。
3. マウスの頭蓋骨にヘッドフィクサーを取り付けて、動きのアーティファクトを最小限に抑えます。
   1. マウスヘッドは、マウスが、supineの位置に配置されている間、70%ETOHを噴霧されます。頭の皮を鉗子で軽く持ち上げ、はさみで約^7mm2 を切り取ります。
   2. 頭皮の周りの髪をきれいにし、皮膚の下の骨膜を取り除き、頭蓋骨に瞬間的な接着剤を塗布し、カスタマイズされたヘッドフィクサーを取り付けます。
   3. 瞬間接着剤が硬化した後、ヘッドフィクサーの周りに歯科用接着剤を塗布し、歯の接着剤を固めるために青色光で点灯します。
4. μTongueの底部にマウス舌を置きます。
   1. マウスの下唇を瞬時に接着剤でμTongueの底部に取り付けます。
   2. ボード上にマウスを置き( 図1Bのマウス準備ボード)、μTongueの底部ユニットをポストに置きます( 図1BのμTongueホールドポスト)。下部のユニットの端にある穴が、ポストに揃えられていることを確認します。
   3. ボードのヘッドフィクサーホルダーにマウスヘッドフィクサーを締めます。次に、マウスヘッドとデバイスの間の距離を調整します。ヘッドフィクサーホルダーを使用して、マウスヘッドを約45°スムーズに回転させます。このプロセスは顕微鏡目的とマウスの鼻の物理的接触を防ぐ。
   4. プラスチック製のピンセットを使用してマウスの舌を優しく描き、舌の腹側をμTongueの底部の上側に取り付けます。次に、濡れた綿棒でマウス舌の表面を拭きます。
   5. 人工唾液に紙を浸し、濡れた状態を維持するためにマウス舌の露出した表面に置きます。
   6. μTongueの底部の両端を保持するポストに湾曲したワッシャーを置きます。
5. 顕微鏡のステージにマウスの準備を置きます。露出したマウス舌を顕微鏡目的領域の近似中心の下に置きます。ステージのダイナミックレンジから逸脱しないように注意してください。次に、ステージ上のマウスボードをねじで締めます。
6. マウス本体の下に加熱パッドを置き、温度を36.5°C-37.5 °Cに保ちます。 温度センサーでマウスの体温を監視し、温度センサからのフィードバック信号を使用して加熱パッドの温度を制御します。
7. 薄い紙をひねってマウスの口に置き、液体がマウスの気管に入るのを防ぎます。
8. マウスの舌から濡れた組織を取り出し、準備したμTongueをマウスの舌の上に置きます。舌にマイクロ流体チャネルを置き、その位置を調整して、画像窓から舌の表面を観察します。
9. 最小の圧縮圧力で両端を軽くねじ込んでμTongueを固定します。

4. イメージング取得

1. 920 nmの2光子レーザーと顕微鏡を使用前にオンにします。
2. 水浸物目的(16x、NA 0.80または25x、NA 1.1)を顕微鏡に取り付けます。μTongueのイメージングウィンドウに蒸留水を落とし、目的を浸します。
3. カメラモードでは、水銀ランプを使用してライトを点灯し、舌の表面を照らします。
4. Z軸を調整することで、フィリフォーム乳頭から自己蛍光信号を検索し、近似焦点面を見つけます。次に、XとYの調整ノブを使用して、味覚芽を見つけます。
5. マルチフォトンモードに切り替えます。次のように画像取得条件を設定します: 励振波長: 920 nm;エミッションフィルタセット:447/60 nm、525/50 nm、および607/70 nm;双方向ラスタースキャンモード、フレームサイズ:512 x 512。
6. X と Y の位置を調整して、イメージ ウィンドウの中央に味覚芽を配置します。
7. 味覚芽の約3分の2の高さで味覚芽を囲む血管を検索します。プロトコルステップ3.2からのTRITC-デキストラン(500 kDa)注入によって血液循環を視覚化する。血流が詰まっている場合は、固定ネジを少し緩めて血流を可能にします。
8. Z軸を調整し、味覚細胞の十分な数を含む味覚芽のZ平面を見つけます。
9. 80 sの2-6 Hzでカルシウムイメージングを進めます。イメージング開始後に流体システムの貯留槽をオンにして20sの味液を提供する。味覚刺激の20のsの後、人工唾液に戻って貯水池を切り替えます。
10. シーケンシャルイメージングが終了した後、次のイメージングセッションまで3~4分ほど待ちます。人工唾液をマウス舌に流し、前のイメージングセッションからタスタントのリマントを洗い流します。実験の設計に応じて、必要に応じてセッションを繰り返します。
11. インビボカルシウムイメージングが完了したら、IACUC手順に従ってマウスを安楽死させる。麻酔下のマウスは_CO2チャンバーで屠殺される。
    メモ:つま先ピンチ反射を使用して麻酔の深さを確認してください。イメージングセッション中に、貯留層からの人工唾液を一貫して提供する必要があります。μTongueのイメージングウィンドウに気泡が現れた場合は、強い液体圧力を使用してμTongueの入力または出力を通して泡を取り除きます。

5. 画像解析 (図 3)

1. 画像変換
   1. フィジー¹⁴ または同様の画像解析ソフトウェアを使用して、生の画像ファイルを開きます。
   2. NPL バド アナライザコードを使用するには、イメージ ファイルを RGB スタック ファイルに変換します。
      1. 画像>カラー>分割チャンネル
      2. [イメージ>カラー>[チャンネルをマージ]を クリックし、ステップ 5.2.1 からイメージを選択します。
      3. 画像>カラー > スタックから RGB
2. 画像登録
   注: データ分析には、カスタム記述されたコードを使用します。https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer を参照してください。
   1. Taste_GUI.mという名前のコードを実行します。NPL バド アナライザという名前の GUI ウィンドウがポップアップ表示されます。右上隅の[新規解析]ボタンをクリックし、ステップ5.1から変換された画像をロードします。ロードされたイメージの上のフレーム レートを設定します。
   2. 登録のために、ロードされたイメージの上に関心領域(ROI)を描画します。選択したROIをダブルクリックすると、自動計算された登録が開始されます。
3. 相対的な蛍光強度変化を求める(ΔF/F)
   1. ステップ 5.2 から登録されたイメージを自動的に表示するには 、NPL バド アナライザ ウィンドウに戻ります。ユーザーがすでに reg ファイルを持っている場合は、[データのロード] ボタンをクリックして 、_reg.tif ファイルを選択します。
   2. CIRCLEまたはポリゴンボタンをクリックし、味覚芽の画像の上に味の細胞のROIを配置します。
   3. これは、味覚芽像の下で自動的に選択された味覚細胞の生蛍光強度とカルシウムトレース(ΔF/F)を示す。
   4. 「トレースを保存」をクリックして、GUI の右側にカルシウムトレース (ΔF/F)を表示し、ROI は味覚芽のイメージの上に表示されます。ROI の選択が完了するまで、ステップ 5.3.2 から 5.3.4 を繰り返します。
      注: ROI が誤って選択されている場合は、[ トレースの削除 ]ボタンをクリックして、最後に選択した ROI およびカルシウム トレースを削除します。
   5. ROI の選択が完了したら、右下隅にファイル名を書き込み、 完了 ボタンをクリックして、ΔF/F カルシウムトレースを.xls形式としてエクスポートし、タセ芽画像と ROI を.bmp形式でエクスポートします。
4. カルシウムトレースの解析
   1. ステップ5.3から得られたカルシウムトレースを分析する。テイスト細胞は、tastant^が送達された後にベースラインの標準偏差が2つ以上上昇したときにテイスト細胞がタスタントに反応し、p−値が0.01未満であると考え、対または非対t-tests10を用いた。
   2. 味細胞は、特定のタスタントに応答する場合、3回の試験のうち2回以上(〜60%)15回を超えると考えてください。
   3. ステップ5.4.1から得られた個々のカルシウムトレースを平均化することによって代表的なカルシウムトレースを得る。

結果

Pirt-GCaMP6f-tdTomatoマウスを使用して、味覚芽画像を得た。マウス舌の表面は、自己蛍光フィリフォーム乳頭で覆われていた。味覚芽は舌の表面上にまばらに広がっている(図4A)。味覚芽とその構造の画像は、3つの異なるフィルタ検出器を使用して取得しました。607/70 nmフィルタセットを用いて、レシオメトリック解析用に味細胞からのtdTomatoシグナルを得た(図4B)。525/50 nmフィルタセットを用いて、味覚芽を囲む味細胞や血管からのGCaMPシグナルを取得した(図4B)。447/60 nmフィルターセットを用いて、味覚芽を構造的に支持するコラーゲン結合組織を獲得した(図4B)。

味覚芽および相対構造の画像を取得した後、インビボカルシウムイメージングは、プロトコルを使用して行った。Pirt-GCaMP6f-t...

ディスカッション

ここで説明する詳細なプロトコルは 、インビボでの味細胞の機能活動の調査にμTongueを適用する。このプロトコルでは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を用いて味細胞上で機能的イメージングが行われる。トランスジェニックマウスの使用に加えて、味細胞上のカルシウム染料(または電圧感知色素)の電気泳動負荷は代替オプションであり得る。

この実験では、1.336未満の屈折率の全ての味覚溶液を使用した。μTongueは安定した流体送達を提供し、レシオメトリック解析はイメージングアーティファクトを改善しますが、より高濃度のタスタント(例えば、1.338の屈折率を持つ>100 mMショ糖)を使用することは困難です。人工唾液と味液の屈折率の大きな差は、ポスト画像プロセスによって補正範囲よりも画像焦点面をシフトする。経験的には、リアルタイムで安定した細胞イメージングを可能にする味覚溶液の屈折率(1.336未満)の特定の範囲が得られる。

蛍光イメージングおよび動物処理の経験を有する研究者にとって、このプロトコルは繰り返し練習を通し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アセスルファムK	Sigma Aldrich	04054-25G	人工唾液・テイスタント
塩化カルシウム溶液	Sigma Aldrich	21115-100ML	人工唾液・テイスタント
クエン酸	Sigma Aldrich	C0759-100G	人工唾液・テイスタント
シクロヘキシミド	Σ Aldrich	01810-5G	人工唾液・テイスタント
デナトニウム	Sigma Aldrich	D5765-5G	人工唾液/試飲
歯科用接着剤	Denkist	P0000CJT-A2	動物の準備
Image J	NIH	ImageJ	データ分析
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	人工唾液/試飲
インスタント接着剤	ロックタイト	ロックタイト 4161、ヘンケル	動物の準備
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	人工唾液/tastant
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	人工唾液/tastant
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	動物製剤
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	人工唾液/tastant
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	人工唾液唾液/試飲
MATLAB	Mathwork	MATLAB	データ解析
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	人工唾液/試飲
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	人工唾液/試飲
Mutiphoton顕微鏡	Thorlab	ベルガモII	顕微鏡
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	人工唾液/試飲
NaHCO3	Σ Aldrich	792519-500G	人工唾液/試
飲 対物	ニコン	N16XLWD-PF	顕微鏡
オクタ	フローALA 科学機器	OCTAFLOW II	流体制御
PC	LG	Lg15N54	流体制御
PHメーター	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	人工唾液・テイスタント
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ・アルドリッチ	806562	人工唾液・テイスタント
ニーネ	シグマ・アルドリッチ	Q1125-5G	人工唾液・テイスタント
シリンジポンプ	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	流体制御
TRITC-デキストラン	Sigma Aldrich	52194-1G	動物用調製
超高速ファイバーレーザー	Toptica	FFultra920 01042	顕微鏡
キシラジン	バイエル 韓国	ロンプン	動物用調製