本稿では、舌上の生体内イメージングウィンドウにマイクロ流体を統合することにより 、生体内で の機能性味細胞イメージング用μTongue(マイクロ流体術オン・ア・タン)デバイスを紹介する。
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この記事について
サマリー
要約
生体内蛍光顕微鏡は、生きた動物の多細胞ダイナミクスを研究するために広く使用されるツールです。しかし、味覚官能器官ではうまく使用されていない。マイクロ流体を生体内舌イメージングウィンドウに統合することにより、μTongueは、複数のタストタントへの制御された暴露の下 で生体内 の味細胞の信頼性の高い機能的画像を提供します。本論文ではμTongueシステムを利用するための詳細なステップバイステップの手順を提示する。タスタントソリューションの準備、マイクロ流体モジュールのセットアップ、サンプル実装、機能画像データの取得、データ分析の5つのサブセクションがあります。μTongueを使用する際に生じる可能性のある実用的な問題を解決するためのヒントとテクニックも紹介しています。
概要
生体内蛍光顕微鏡は、生体組織の時空間的ダイナミクスを研究するために広く使用されています。研究者たちは、生物学的プロセスの特異的かつ敏感な蛍光シグナルへの変換を提供する遺伝的にコードされたセンサーを急速に開発しています - 広く利用可能な蛍光顕微鏡を使用して容易に記録することができます1,2.げっ歯類のほとんどの内臓は顕微鏡を用いて調べられてきたが、舌への応用は成功していない3.
味覚細胞のカルシウムイメージングに関する以前の研究は、舌組織を薄く切り離して、舌組織を薄く切り離して、味覚芽4、5、6を得るか、または味覚上皮を剥離して真菌形態の味覚芽7、8を得ることによって行った。これらのサンプルの調製は必然的に侵襲的であったため、神経の内在性、透水性バリア、血液循環などの自然微小環境は、大部分が摂動された。最初のインビタル舌画像化ウィンドウは2015年にChoiらによって報告されたが、流動性タスタント刺激によって引き起こ....
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プロトコル
すべての外科的処置は、成均館大学及びソウル大学校の施設動物の世話及び使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. ソリューションの調製: 人工唾液とタストタント
- 2 mM NaClを溶解して人工唾液を調製し、 5 mM NaHCO3,3mM KHCO 3,0.25 mM CaCl2,0.25mM MgCl2,0.12mM K2HPO,0.12mM KH2PO4,および1.8 mM HClを蒸留水(>1 L)に調整し、溶液のpHを7(1L)に調整する。
- 酸味などのタスタントを準備します: 10 mM クエン酸;塩辛い:400 mM NaCl、必要に応じて50 μMアミロライド。甘い:40 mMアセスルファムK;苦い:5 mMキニン、5 mMデナトニウムおよび20 μMシクロヘキシミドの混合物を、ステップ1.1で調製した人工唾液中に試飲薬を溶解させることによって。
2. マイクロ流体システムの調製
注: タストタントは、加圧マルチチャンネル流体送達システムを使用....
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結果
Pirt-GCaMP6f-tdTomatoマウスを使用して、味覚芽画像を得た。マウス舌の表面は、自己蛍光フィリフォーム乳頭で覆われていた。味覚芽は舌の表面上にまばらに広がっている(図4A)。味覚芽とその構造の画像は、3つの異なるフィルタ検出器を使用して取得しました。607/70 nmフィルタセットを用いて、レシオメトリック解析用に味細胞からのtdTomatoシグナルを得た(図4B)。525/50 nmフィルタセットを用いて、味覚芽を囲む味細胞や血管からのGCaMPシグナルを取得した(図4B)。447/60 nmフィルターセットを用いて、味覚芽を構造的に支持するコラーゲン結合組織を獲得した(図4B)。
味覚芽および相対構造の画像を取得した後、インビボカルシウムイメージングは、プロトコルを使用して行った。Pirt-GCaMP6f-t.......
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ディスカッション
ここで説明する詳細なプロトコルは 、インビボでの味細胞の機能活動の調査にμTongueを適用する。このプロトコルでは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を用いて味細胞上で機能的イメージングが行われる。トランスジェニックマウスの使用に加えて、味細胞上のカルシウム染料(または電圧感知色素)の電気泳動負荷は代替オプションであり得る。
この実験では、1.336未満の屈折率の全ての味覚溶液を使用した。μTongueは安定した流体送達を提供し、レシオメトリック解析はイメージングアーティファクトを改善しますが、より高濃度のタスタント(例えば、1.338の屈折率を持つ>100 mMショ糖)を使用することは困難です。人工唾液と味液の屈折率の大きな差は、ポスト画像プロセスによって補正範囲よりも画像焦点面をシフトする。経験的には、リアルタイムで安定した細胞イメージングを可能にする味覚溶液の屈折率(1.336未満)の特定の範囲が得られる。
蛍光イメージングおよび動物処理の経験を有する研究者にとって、このプロトコルは繰り返し練習を通し.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益を宣言する:J.ハンとM.チェは、この記事で説明されている特許を取得したμTongue技術の発明者であり、μTongueシステムはSciTech Koreaを介して市販されている。
謝辞
この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)補助金(2019M3A9E2061789)、韓国政府(MSIT)が資金を提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金(2019M3552223A11)によって支援されました。キム・ウンスーとユージン・リーの技術支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセスルファムK | Sigma Aldrich | 04054-25G | 人工唾液・テイスタント |
| 塩化カルシウム溶液 | Sigma Aldrich | 21115-100ML | 人工唾液・テイスタント |
| クエン酸 | Sigma Aldrich | C0759-100G | 人工唾液・テイスタント |
| シクロヘキシミド | Σ Aldrich | 01810-5G | 人工唾液・テイスタント |
| デナトニウム | Sigma Aldrich | D5765-5G | 人工唾液/試飲 |
| 歯科用接着剤 | Denkist | P0000CJT-A2 | 動物の準備 |
| Image J | NIH | ImageJ | データ分析 |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | 人工唾液/試飲 |
| インスタント接着剤 | ロックタイト | ロックタイト 4161、ヘンケル | 動物の準備 |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | 人工唾液/tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | 人工唾液/tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | 動物製剤 |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | 人工唾液/tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | 人工唾液唾液/試飲 |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | データ解析 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | 人工唾液/試飲 |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | 人工唾液/試飲 |
| Mutiphoton顕微鏡 | Thorlab | ベルガモII | 顕微鏡 |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | 人工唾液/試飲 |
| NaHCO3 | Σ Aldrich | 792519-500G | 人工唾液/試 |
| 飲 対物 | ニコン | N16XLWD-PF | 顕微鏡 |
| オクタ | フローALA 科学機器 | OCTAFLOW II | 流体制御 |
| PC | LG | Lg15N54 | 流体制御 |
| PHメーター | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | 人工唾液・テイスタント |
| リン酸緩衝生理食塩水 | シグマ・アルドリッチ | 806562 | 人工唾液・テイスタント |
| ニーネ | シグマ・アルドリッチ | Q1125-5G | 人工唾液・テイスタント |
| シリンジポンプ | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | 流体制御 |
| TRITC-デキストラン | Sigma Aldrich | 52194-1G | 動物用調製 |
| 超高速ファイバーレーザー | Toptica | FFultra920 01042 | 顕微鏡 |
| キシラジン | バイエル 韓国 | ロンプン | 動物用調製 |
参考文献
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
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再版と許可
