液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

Summary

このプロトコルは、溶融温度の上昇を伴う脂質の脂質単層アセンブリおよび液滴界面二重層形成を促進するためのフィードバック温度制御加熱システムの使用、および膜の温度駆動変化を特徴付ける容量測定の詳細を示す。

Abstract

油中の脂質被覆水滴間で脂質二重層(すなわち、DIB)を組み立てる液滴界二重層(DIB)法は、他の方法に対して重要な利点を提供する:DIBは安定しており、しばしば長持ちし、二重層領域は可逆的に調整することができ、リーフレット非対称性は液滴組成物を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴によって得ることができる。DIBを形成するには、液滴の表面で高密度脂質単層に脂質を自発的に集める必要があります。これは一般的な合成脂質の室温で容易に起こるが、十分な単層または安定な二重層は、いくつかの細胞脂質抽出物を含む室温以上の融点を有する脂質に対して同様の条件で形成できない。この動作は、モデル膜研究におけるDIBの組成(おそらく生物学的関連性)を制限している可能性があります。この問題に対処するために、DIB液滴をホストする油溜層を慎重に加熱し、脂質膜に対する温度の影響を特徴付ける実験プロトコルが提示される。具体的には、このプロトコルは、熱伝導性のアルミニウムフィクスチャと、フィードバックループによって制御される抵抗加熱要素を使用して、より広い脂質タイプの単層アセンブリおよび二層形成を改善する高温を規定する方法を示す。膜の構造的特性は、二重層を含む脂質の熱的な相転移と同様に、DIBの電気容量の変化を測定することによって定量される。この手順を組み合わせることで、多成分脂質混合物の有効な融解温度(T_M)の決定を含む、様々な温度にわたってモデル膜の生物物理学的現象を評価するのに役立ちます。この機能は、モデル膜における自然相転移のより緊密な複製を可能にし、細胞の異質性をより良く捕捉するものも含め、より広い範囲の膜構成体からのモデル膜の形成と使用を促進する。

Introduction

細胞膜は、何千もの脂質タイプ^1、タンパク質、炭水化物、ステロールから構成され、すべての生きた細胞をカプセル化して細分化する選択的透過性バリアです。その組成がそれらの機能にどのような影響を与えるかを理解し、自然分子と合成分子が細胞膜とどのように相互作用し、接着し、破壊し、トランスポジションするかを明らかにすることは、生物学、医学、化学、物理学、材料工学において広範囲に及ぶ影響を持つ重要な研究分野です。

これらの発見は、合成脂質または天然脂質から組み立てられた脂質二重層を含むモデル膜を組み立て、操作、および研究するための実証済みの技術から直接利益を得ることを目的としています。近年、油脂中の脂質被覆水滴間に平坦な脂質二重層を構築するための液滴界面二重層(DIB)法^2、3、4は、5、6、7、8、9、11、1^に大^{きな注目を}

Protocol

1. 加熱された器具の準備

1. 幅と長さで25mm x 40mmにトリミングされた厚さ1mmの絶縁ゴム2個、25mm x 40mmの厚さ6mmのゴム2個、準備されたアルミニウムベースフィクスチャアセンブリ、アルミニウムベースフィクスチャの表示窓に収まるアクリルオイルリザーバー( 図S1、S2、およびS3 を収集して、製作と分解した組み立て図の詳細を参照)。最初に、UV硬化性接着剤でガラスカバースリップ表示窓をフィクスチャの底部に取り付け、フィクスチャの各25 mm x 25 mmサイドフランジの上部に1つの抵抗発熱体を付着させることで、アルミニウムフィクスチャを準備します。
2. 細いゴム片を顕微鏡のステージに置き、各片の長いエッジがステージ開口部に接線になるように(図1)。
3. アルミベースのフィクスチャを、対物レンズの上に中央に配置したフィクスチャの表示ウィンドウを使用して、絶縁パッドの上に配置します。接続された液滴を撮像するには、適切なアライメントが必要です。
4. 各抵抗発熱体の上に厚いゴム片を置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に保持します。これらの部分は、ステージクリップによって引き起こされる損傷から発熱体を保護し、発熱体とアルミニウム器具と顕微鏡ステージの両方の間の偶発的な電気ショートに対して絶縁します。
5. 熱電対の測定端を慎重に曲げて....

Results

図1は、DIB形成用の顕微鏡ステージ上でアルミニウム製の器具およびアクリルオイル貯留層がどのように調製されているかを示しています。組み立てステップ1.2-1.4は、より効率的な加熱のために、ステージからフィクスチャを熱絶縁するのに役立ちます。ステップ1.5-1.7は、熱電対をフィクスチャに適切に取り付け、オイル貯蔵所を配置する方法を示し、ステップ1.8 -1.9はこれらの部分に油を分配するための推奨場所を示しています。

図 2 は、フィードバック温度制御を確立し、DIB で電気測定を行うコンポーネントの概要を示しています:PC、固定ゲインパワーアンプ、パッチクランプアンプ、DAQシステム(または電圧を印加してpA-nAレベル電流を測定するための同等の機器)、適切なアナログ入力と出力を備えた2番目のDAQ、波形発生器、および取り付けられたレジストヒーター付きアルミニウム製の固定具。DAQ-2は2つのモジュールを利用しています(

Discussion

本明細書に記載されているプロトコルは、Dibを形成するために使用される油および液滴の温度を制御する実験システムを組み立て、操作するための指示を提供する。RT以上の融解温度を有する脂質を用いてDIB形成を可能にする上で特に有益である。さらに、油溜めの温度を正確に変化させることにより、二層温度を操作して、容量、面積、厚さ、熱伝導相変化、膜活性種の運動論、および二層^37,38の接着のエネルギーを含む様々な膜特性および特性に対する高温の影響を研究することができる。

プロトコルは、DIB研究で使用する前の3つの部分で構成されています: 1) 加熱ステージ器具の準備とアセンブリ;2)様々な楽器を接続します。3)選択された比例および積分制御の利益と適切な温度制御性能を確認する。パート 2 で最も重要なのは、パワー アンプ(>mA 電流)とパッチ クランプヘッドステージ(pA-nA 電流)の出力間の共有伝導経路を避ける必要があります。不注意なショートは、ヘッドステージに永久的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mmの絶縁ゴム(x2)	任意		顕微鏡のステージからアルミニウム固定具の底を絶縁
25 mm x 40 mm x 6 mmの絶縁ゴム(x2)	任意		顕微鏡ステージクリップによって発熱体が損傷を受けるのを防ぎ、発熱体の上部を断熱します。
3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸	Sigma Aldrich	M3183	脂質溶液用緩衝剤
アクリル基材	HTD_STG_2		~1000 uL アクリル井戸で製造され、ポカヨケの外装プロファイルで向きを固定
アルミニウム固定具	住宅で製造	HTD_STG_1	ベース固定具 アシリック固定具を保持する油井と、発熱体用の油井に隣接する 2 つのフラットパッドを含むベース固定具
脳総脂質抽出物	Avanti	131101C-100mg	25 mg / mL豚脂質抽出物
コンパクトDAQシャーシ(cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	複数のタイプのセンサ計測モジュールまたは出力モジュールを収納できるシャーシ
データ取得システム(DAQ)	分子デバイス	デジデータ1440A	高解像度アナログ-デジタルコンバータ
固定ゲインアンプ/電源	ヒューリットパッカード	HP 6826A	は、電圧出力モジュールからのDC電圧出力を増幅します
ガラスカバースリップ	コーニング	CLS284525	アルミニウムベースの底をシールし、二層の光学特性評価を可能にします
発熱体 (x2)	オメガ	KHLV-101/5	25 mm x 25 mmポリイミドフィルムカプトン発熱体、5ワットの電力制限付き。
M3ステンレス鋼ネジマク	マスター	カー90116A150	は、熱電対をアルミニウム固定具
パッチクランプアンプ	分子デバイスに固定します	アクソパッチ 200B	ヘッドステージへの電流と出力電圧を測定
パーソナルコンピュータ	複数の高速USBポートと最低6 Gbのラムを備えた任意の
塩化カリウム	Sigma Aldrich	P3911	解離イオンの電解質溶液
温度入力モジュール	National Instruments	NI 9211	:cDAQシャーシの開放型および冷接点熱電対の計測が可能
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	直径0.02インチ、長さ6インチのU型熱電対
UV硬化型接着剤ロック	タイト	19739	カバースリップをアルミニウムベースフィクスチャに固定
電圧出力モジュール	ナショナルインスツルメンツ	NI 9263	アナログ電圧出力モジュール、cDAQシャーシ用
、波形発生器	Agilent	33210A	10mV、10Hzの正弦波を出力するために使用